激光共聚焦技術(shù)證實(shí)HCV NS5在人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞的定位表達(dá)*

聶青和 程勇前 黃曉峰 張亞飛 羅新棟 楊家驥 楊艷紅

自1989年丙型肝炎病毒（HCV）基因組克隆成功后，人們對(duì)其基礎(chǔ)、流行病學(xué)、臨床診斷和治療的研究已十分深入[1]。HCV感染在全世界估計(jì)約1.7億人[2]，HCV在我國一般人群中的感染率約為3.2%。中國約有3700萬～4000萬感染者。丙型肝炎常進(jìn)展為肝硬化和肝細(xì)胞癌。HCV的經(jīng)典傳播途徑為經(jīng)血液或血液制品傳播，但1991年后獻(xiàn)血員HCV的篩檢已使輸血后丙型肝炎大為減少[3]?，F(xiàn)研究認(rèn)為HCV存在母嬰傳播[4，5]，在HCV感染的母親中，HCV母嬰傳播發(fā)生率大約為5%左右[6，7]，但目前尚無有效的方法阻斷這種傳播。因此，HCV的母嬰傳播將可能成為未來HCV感染的重要途徑[8，9]。丙型肝炎疫苗尚難以用于人體預(yù)防HCV感染[10]，因此阻斷HCV母嬰傳播的研究工作顯得十分重要。目前，有關(guān)HCV母嬰傳播的研究多數(shù)為流行病學(xué)調(diào)查[11]，關(guān)于HCV如何在母嬰間進(jìn)行傳播的具體機(jī)制尚不清楚，可能為宮內(nèi)傳播、出生時(shí)傳播和出生后通過母乳、唾液傳播等，而宮內(nèi)感染可能是主要機(jī)制之一[12，13]。本研究用HCV RNA陽性血清感染體外培養(yǎng)的人胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞，并運(yùn)用激光共聚焦技術(shù)觀察人滋養(yǎng)層細(xì)胞感染HCV后的特性，探討HCV NS5在滋養(yǎng)層細(xì)胞中的定位表達(dá)，為進(jìn)一步深入研究HCV的母嬰傳播分子機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料與方法

一、單細(xì)胞懸液的制備 取剖腹產(chǎn)術(shù)后的無菌胎盤組織，將絨毛組織剪碎至1～3mm3，以0.25%胰蛋白酶液及 20u/ml DNaseⅠ于 37℃恒溫?fù)u床內(nèi)消化30min，消化產(chǎn)物經(jīng)100目不銹鋼篩網(wǎng)過濾后，濾液加入預(yù)先加有5ml小牛血清的50ml離心管內(nèi)，1000rpm離心10min，棄上清，DMEM培養(yǎng)液重懸沉淀。

二、Percoll密度梯度制備 用9.0%NaCl與Percoll以1：9混合，以達(dá)到生理性滲透壓，再以0.9%NaCl稀釋為45%和35%兩個(gè)濃度，按濃度從大到小將兩個(gè)不同密度的Percoll溶液逐層緩慢加入10ml離心管內(nèi)，每個(gè)濃度3ml。Percoll細(xì)胞分離液為美國Pharmacia公司產(chǎn)品（No：05-59-16-001A）。

三、細(xì)胞的純化與培養(yǎng) 將收集的細(xì)胞懸液2ml緩慢加于Percoll分離液上層，以2500rpm離心20min，用吸管小心吸取云霧狀的中層，置于50ml離心管內(nèi)，DMEM稀釋4倍，1000rpm離心10min，棄上清，以含20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液重懸沉淀，將細(xì)胞懸液濃度調(diào)整至5～6×109/L，置于培養(yǎng)瓶或預(yù)先置有蓋破片的六孔培養(yǎng)板內(nèi)37℃，5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

四、免疫細(xì)胞化學(xué)染色 將細(xì)胞爬片固定后，用ABC法進(jìn)行細(xì)胞角蛋白、波形蛋白染色。胎盤組織切片脫蠟至水后用ABC法進(jìn)行細(xì)胞角蛋白、波形蛋白染色。免疫組織化學(xué)染色用ABC試劑盒購自華美生物工程公司，所用抗細(xì)胞角蛋白（No：C8541）及波形蛋白抗體（No：MU074-UC）購自寶泰克生物工程公司?？笻CV NS5單克隆抗體購自寶泰克生物工程公司。

五、HCV體外感染試驗(yàn) 選擇抗HCV陽性血清，HCV RNA 為6.1×107copies/ml，經(jīng)血清學(xué)檢測(cè)甲、乙、丁、戊型肝炎病毒標(biāo)志物均為陰性，另選正常人血清作為陰性對(duì)照。以含20%丙型肝炎患者血清的DMEM培養(yǎng)液感染體外培養(yǎng)24h后的滋養(yǎng)層細(xì)胞，同時(shí)以含20%正常人血清的DMEM培養(yǎng)液作為陰性對(duì)照，37℃，5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)24h，倒置顯微鏡下觀察，棄去感染血清，PBS充分洗滌5次后加入新鮮培養(yǎng)液，留取最后一次洗液待檢，以后每2天換液一次，留取培養(yǎng)上清待檢。

六、培養(yǎng)上清HCV RNA定性及定量檢測(cè) 為保證試驗(yàn)的可靠性，分別采用RT-PCR及擴(kuò)增敏感試驗(yàn)（Amplisensor assay）對(duì)培養(yǎng)上清HCV RNA進(jìn)行定性及定量檢測(cè)，簡(jiǎn)言之，定性檢測(cè)：提取HCV RNA，加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，37℃，30min：預(yù)變性 94℃，300sec，第一次 PCR 循環(huán)，94℃ 45sec，50℃ 45sec，72℃ 45sec循環(huán) 35次，終延伸 72℃，300sec；取 2μl第一次循環(huán)后的產(chǎn)物加入第二次PCR反應(yīng)緩沖液23μl；預(yù)變性94℃ ，300sec， 第 二 次 PCR 循 環(huán) ，94℃ 45sec，55℃45sec，72℃ 45sec循環(huán) 35 次，終延伸 72℃，300sec；取擴(kuò)增產(chǎn)物15μl加樣于含溴化乙錠的2%瓊脂糖凝膠，于1×TAE緩沖液中在60v電壓下電泳15～20min。根據(jù)試劑盒說明，紫外燈下觀察225bp處有熒光者為陽性；定量檢測(cè)：提取HCV RNA，加入逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，37℃ ，45min： 預(yù) 變 性 90℃ ，2min，PCR 循 環(huán) ，95℃25sec，60℃ 35sec，72℃ 45sec 循環(huán) 20 次，終延伸72℃，30sec，10℃保溫 1h；計(jì)算機(jī)讀取數(shù)值，＞102者為陽性。HCV RNA熒光定量檢測(cè)試劑盒購自美國Acegene公司。

七、電鏡標(biāo)本制作及激光共聚焦顯微鏡檢查 細(xì)胞培養(yǎng)40d后以0.25%胰蛋白酶分別消化感染組及對(duì)照組貼壁生長的細(xì)胞，PBS洗滌一次，2000rpm離心20min，4%戊二醛固定過夜，送本校電鏡室。所用激光共聚焦顯微鏡型號(hào)為 MRC-1024（BioRad，Watford，UK），固定在含Plan-Ne-ofluar 40x油浸鏡（數(shù)值孔徑為 3.53）的顯微鏡（Zeiss，Gena，Germany）上，用多線氬離子激光束（25mW）在488nm激發(fā)熒光素（FITC）。這些措施使得在高放大倍數(shù)下對(duì)微弱的標(biāo)記物能產(chǎn)生敏銳的熒光信號(hào)。共聚焦系統(tǒng)由Bio-Rad公司提供的軟件控制，在IBM計(jì)算機(jī)上運(yùn)行。

結(jié) 果

一、滋養(yǎng)層細(xì)胞體外生長特性觀察 在倒置顯微鏡下觀察，中層細(xì)胞以單個(gè)核細(xì)胞為主，培養(yǎng)3h后開始貼壁，18h后基本全部貼壁，貼壁細(xì)胞多呈上皮細(xì)胞樣生長，形態(tài)多樣，個(gè)別細(xì)胞呈纖維細(xì)胞樣。24h后開始出現(xiàn)多個(gè)核細(xì)胞，并隨時(shí)間推移逐漸增大，成片生長。HCV感染后，感染組及對(duì)照組細(xì)胞光鏡下觀察未見明顯不同。

二、免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果 細(xì)胞爬片染色陽性信號(hào)為棕黃色顆粒，結(jié)果顯示，90%以上細(xì)胞的細(xì)胞角蛋白染色陽性，陽性信號(hào)定位于細(xì)胞漿，而波形蛋白染色僅個(gè)別細(xì)胞可見陽性信號(hào)（圖1，2）。

圖1 滋養(yǎng)層細(xì)胞角蛋白表達(dá)（免疫熒光染色，×100）

圖2 滋養(yǎng)層細(xì)胞波形蛋白表達(dá)（免疫熒光染色，×100）

三、免疫熒光染色結(jié)果 HCV感染后的滋養(yǎng)層細(xì)胞，經(jīng)抗-HCV NS5染色陽性，陽性信號(hào)為黃綠色或黃色熒光，主要定位于細(xì)胞核周。正常對(duì)照標(biāo)本的滋養(yǎng)層細(xì)胞抗-HCV NS5染色未見黃綠色或黃色熒光，因伊文藍(lán)襯染而呈現(xiàn)紅色。

四、激光共聚焦觀察 HCV感染后的滋養(yǎng)層細(xì)胞抗HCV NS5染色陽性信號(hào)為黃綠色或黃色熒光，主要定位于細(xì)胞核周（圖3）。

圖3 HCV感染的滋養(yǎng)層細(xì)胞抗HCV NS5陽性（激光共聚焦，×1059）

五、培養(yǎng)上清HCV RNA表達(dá) 見圖4和表1。

圖4 培養(yǎng)上清HCV RNA定性檢測(cè)結(jié)果

表1 培養(yǎng)上清HCV RNA定量和定性檢測(cè)結(jié)果

討 論

胎盤是胎兒與母體之間進(jìn)行物質(zhì)交換的重要器官，由滋養(yǎng)層細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞以及二者之間基膜所構(gòu)成的胎盤屏障組成，是營養(yǎng)物質(zhì)以及某些藥物、病毒、激素等從母體進(jìn)入胎兒的必經(jīng)之路，而滋養(yǎng)層細(xì)胞是胎盤屏障的第一道防線。合體滋養(yǎng)層細(xì)胞還具有重要的內(nèi)分泌功能，體外分離培養(yǎng)滋養(yǎng)層細(xì)胞是研究其功能及母體與胎兒之間物質(zhì)交換的具體分子機(jī)制的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)[14]。本研究在Kliman等[15]建立的Percoll不連續(xù)密度梯度分離純化方法的基礎(chǔ)上作如下改進(jìn)：將分離細(xì)胞的密度梯度簡(jiǎn)化為兩層。Kliman等用14個(gè)不連續(xù)Percoll分離密度梯度進(jìn)行分離，并確定滋養(yǎng)層細(xì)胞在Percoll中所處的密度值為1048～1062g/L，而Cordon等[16]用連續(xù)密度梯度觀察其密度值為 1053～1060g/L，以此為依據(jù)并根據(jù)美國Pharmacia公司提供的Percoll使用說明書中不同稀釋度的Percoll在0.15M（0.9%）鹽溶液中相應(yīng)的密度值曲線，將分離梯度簡(jiǎn)化為兩層，即35%（密度值為1043g/L）與45%（密度值為1062g/L），以使所要分離的滋養(yǎng)層細(xì)胞處于兩層之間，這樣既節(jié)約了實(shí)驗(yàn)試劑，又簡(jiǎn)化了操作步驟。

許多學(xué)者研究證實(shí)，在胎盤絨毛組織中細(xì)胞角蛋白染色陽性的僅為細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞及合體滋養(yǎng)層細(xì)胞[17，18]。本研究培養(yǎng)細(xì)胞爬片經(jīng)免疫組化染色結(jié)果顯示，細(xì)胞角蛋白染色陽性者占90%以上，證明改進(jìn)后的分離方法同樣可以得到滿意的分離效果。

目前，HCV感染靶細(xì)胞的方式主要有血清直接感染法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、電穿孔法及真核細(xì)胞表達(dá)載體攜帶法等[19，20]。直接感染法是HCV感染細(xì)胞的主要方法，即把丙型肝炎患者血清直接加到培養(yǎng)細(xì)胞中進(jìn)行感染，37℃溫育不同時(shí)間后，更換新鮮培養(yǎng)液，在不同時(shí)相檢測(cè)細(xì)胞及其培養(yǎng)上清HCV RNA。RT-PCR用于直接檢測(cè)培養(yǎng)上清及細(xì)胞中HCV正鏈及負(fù)鏈RNA，可直觀反映HCV在感染細(xì)胞中的復(fù)制情況。該方法簡(jiǎn)便，特異性好，但培養(yǎng)液中殘留的HCV感染物可能會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

本研究參照國外學(xué)者[21，24]用HCV感染體外培養(yǎng)細(xì)胞的方法，對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行感染試驗(yàn)。經(jīng)定性及定量RT-PCR雙重檢測(cè)，證明了實(shí)驗(yàn)的可靠性。結(jié)果表明，感染前及感染后洗液及對(duì)照組中HCV RNA檢測(cè)均為陰性，排除了標(biāo)本來源及HCV感染試驗(yàn)時(shí)培養(yǎng)液中殘留的HCV感染物污染的可能[25，26]。在感染后16天的培養(yǎng)上清中間斷檢測(cè)到了HCV RNA。HCV RNA定性檢測(cè)結(jié)果為陽性的標(biāo)本HCV RNA定量檢測(cè)大于105copies/ml，證實(shí)HCV可以感染胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞，HCV能否在滋養(yǎng)層細(xì)胞中復(fù)制尚有待進(jìn)一步研究。HCV NS5為HCV非結(jié)構(gòu)蛋白之一，目前對(duì)其功能研究的較為明確，HCV NS5主要表達(dá)RDRP，參與HCV的復(fù)制，并具有外周核定位功能，提示HCV的復(fù)制位于核周圍的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。用抗-HCV特異性McAb NS5，采用間接免疫熒光法直接檢測(cè)感染細(xì)胞內(nèi)特異性抗原的表達(dá)情況，并用激光共聚焦方法觀察發(fā)現(xiàn)，HCV NS5主要在核周表達(dá)。感染HCV的人滋養(yǎng)層細(xì)胞中存在HCV NS5表達(dá)。這些改變?yōu)镠CV感染滋養(yǎng)層細(xì)胞提供了形態(tài)學(xué)依據(jù)[27]，也為進(jìn)一步深入研究HCV的母嬰傳播分子機(jī)制奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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