樣品保藏方式與時間對海洋底棲細菌及原生生物熒光計數(shù)效能的影響

孟昭翠,類彥立和瑩瑩,徐奎棟

(1.中國科學院 海洋研究所海洋生物分類與系統(tǒng)演化實驗室,山東 青島 266071; 2.中國科學院 研究生院,北京 100039)

DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole,4′,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚) 是一種靈敏度高、特異性強的熒光染料,對細胞核及染色體有很好的染色效果。它可與 DNA的 A-T 堿基結(jié)合形成 DAPI-DNA 復合物,該復合物在紫外激發(fā)光 (365nm) 下會發(fā)出藍色熒光。而福爾馬林固定的樣品經(jīng) DAPI 染色時,甲醛可誘發(fā)蛋白質(zhì)中的芳香乙胺基團轉(zhuǎn)化為熒光色團,從而使細胞質(zhì)熒光較強,由此可見整個細胞的輪廓[1]。此外,細胞內(nèi)的色素體在綠色激發(fā)光下發(fā)出紅色熒光,可計數(shù)自養(yǎng)鞭毛蟲。由此,DAPI 不僅用于細菌計數(shù),也可用于藍細菌、硅藻、自養(yǎng)和異養(yǎng)小鞭毛蟲及纖毛蟲等微型底棲生物計數(shù)。結(jié)合復染劑 Evans Blue的使用,可使染色后的細胞更容易辨認[2]。

樣品的保藏方式及保存時間是影響 DAPI 熒光計數(shù)效能的重要因素。對海洋浮游細菌及鞭毛蟲的研究發(fā)現(xiàn),固定后的樣品隨著保藏時間延長,可造成數(shù)量低估[3]。Daley 等[4]、Sherr 等[5]及 Kepner 等[6]發(fā)現(xiàn)經(jīng)福爾馬林固定的浮游樣品于 5℃下避光保存1～3 周后,對細菌的計數(shù)結(jié)果無差異。Porter 等[7]報道福爾馬林固定的浮游樣品經(jīng) DAPI 染色后封片,4℃下保存 24 周對細菌的計數(shù)結(jié)果無差異。但Hyun等[8]報道經(jīng)福爾馬林固定后的浮游樣品,貯藏于樣品瓶的計數(shù)結(jié)果優(yōu)于封片保存的。Turley 等[3,9]用戊二醛固定浮游樣品并經(jīng)常溫避光保藏,40 天后發(fā)現(xiàn)對細菌的計數(shù)數(shù)量平均減少了 39%,而經(jīng) DAPI染色封片并冷凍保存 70 d的細菌計數(shù)則無影響。而Pomroy[10]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過 Lugol’s 液固定的浮游樣品在室溫避光保存 4年未造成對細菌數(shù)量的低估,對鞭毛蟲可保存10年甚至更長而無數(shù)量變化。但是,上述研究均源自浮游樣品,對于底棲樣品則缺少系統(tǒng)的研究。僅Hamels 等[11,12]報道沉積物中的鞭毛蟲經(jīng) DAPI 染色封片后可冷凍避光保存 1個月,而經(jīng) Percoll 液提取后的鞭毛蟲經(jīng)同樣處理可保存2個月。

由于細菌及原生生物因可附著于其他生物體和/或沉積物顆粒表面 (如“海雪”),若不加處理直接以 DAPI 進行熒光計數(shù),可對其數(shù)量乃重要性造成不同程度的低估[13～15]。目前最為有效的做法是首先利用超聲波等設(shè)備將底棲生物與沉積物分散開,然后再行染色計數(shù)。但在野外尤其是海上取樣時,因取樣站位多、時間緊、超聲波分散儀及離心設(shè)備等現(xiàn)場無法使用,將樣品進行保藏 (冷凍或冷藏) 后帶回室內(nèi)分析是較為可行的方法。保藏方式對于無細胞壁的原生生物尤為重要,如在冷凍保藏的凍融過程中,可因細胞膜的破裂而無法準確計數(shù)。此外,出海采集常涉及大量樣品,樣品分析完成常需數(shù)周甚至數(shù)月。因此,測試不同保藏方式和保存時間對沉積物樣品定量分析的影響,是對數(shù)量進行準確估算的重要環(huán)節(jié)。

作者采用 DAPI 熒光染色計數(shù)法對海洋沉積物樣品中的細菌、藍細菌、自養(yǎng)小鞭毛蟲 (PNF) 和異養(yǎng)小鞭毛蟲 (HNF) 及硅藻進行了冷藏與冷凍兩種保藏方式的比較分析,同時比較研究了不同保藏時間 (1 個月和 4 個月) 對這些微型底棲生物計數(shù)結(jié)果的影響。

1 材料與方法

1.1 研究站位和樣品采集

用內(nèi)徑 1.6 cm 的采樣管 (注射器改造),從未受擾動的 0.1 m2改進型 Gray-Ohara 箱式采泥器中,隨機采集 5 cm 長芯樣 4 個,每個芯樣按 0～2 cm、2～5 cm 分層移入 50 mL 離心管中,加入經(jīng)濾膜 (孔徑0.22 μm) 過濾的海水配制的 2.5% 甲醛溶液分別至 20 mL 和 30 mL 進行固定。每個重復各取 10 mL 后合并共計 40 mL,一份于4℃避光冷藏保存,一份放置在冰柜-20 ℃ 避光冷凍保存。

冷凍和冷藏對比實驗選取 2007年7月采集自黃海的編號為 3205 (32°N,124.5°E)、3403 (33.5°N,123°E)、4018 (33°N,122.5°E) 三個站位的 0～2 cm分層樣品; 保存時間實驗選取 2008 年開放共享航次編號為 3400-8(34°N,124°E)、3800-1(38°N,121.7°E)兩個站位的 0～2 cm、2～5 cm 分層的樣品 (圖 1)。沉積物粒度分析采用 Cilas (940L) 型激光粒度儀進行測定。其他環(huán)境資料來自溫鹽深測定儀 (CTD) 現(xiàn)場測定。

圖1 黃海采樣站位Fig.1 Sampling stations in the Yellow Sea

1.2 樣品分析方法

取適量樣品 (約 2mL) 加入焦磷酸四鈉 (f.c.1 mmol/L),常溫避光培育 15～30 min。經(jīng) JY92-II超聲波分散處理 180 s (振幅109 μm,50 W,6 mm Microtip),為避免樣品過熱,每超聲破碎處理 45 s,冷卻 1 min。取分樣后,根據(jù)鏡檢樣品中生物的密度,調(diào)節(jié)至適當?shù)南♂尡堵?(細菌以每個視野 20～30個為宜,鞭毛蟲以沉積物不遮擋生物為宜),加入DAPI (f.c.5 mg/L) 和復染劑 Evans Blue (f.c.10-6g/mL),低溫避光染色 10 min[1～3,9,13]。染色樣品經(jīng) Sartorius 真空過濾系統(tǒng)濃縮過濾到黑混合纖維素膜上。封片后置于 Zeiss Axioskop 2 plus HBO 100熒光顯微鏡油鏡下鏡檢計數(shù)。細菌的計數(shù)在紫外光激發(fā) (BP 365/12,FT 395,LP 397) 下,每片隨機計數(shù) 20～40 個視野,總計 500 個左右。鞭毛蟲的計數(shù)根據(jù)其最長粒徑劃分為 2～5 μm,5～10 μm,＞10 μm三個粒級,先在紫外激發(fā)光下每片隨機計數(shù)50個視野 (此為鞭毛蟲總數(shù)),后轉(zhuǎn)換至綠色激發(fā)光 (BP 546/12,FT 580,LP 59) 下,每片快速隨機計數(shù)50個視野 (為自養(yǎng)小鞭毛蟲 (PNF) 總數(shù))[5,16]。異養(yǎng)小鞭毛蟲 (HNF) 的數(shù)目為鞭毛蟲總數(shù)與自養(yǎng)小鞭毛蟲數(shù)目的差值。根據(jù)視野面積以及樣品稀釋倍率換算各生物類群的最終豐度。微型底棲生物豐度的計算按如下公式：

其中,A為豐度(個/mL);N為各視野平均數(shù)(個);Sf為1000×下顯微鏡視野面積(cm2);S為濾膜實際過濾面積(cm2);D為稀釋倍數(shù);V為染色用的樣品體積(mL)。

文中采用如下縮寫：自養(yǎng)小鞭毛蟲 PNF (2～5 μm)、PNF (5～10 μm)、PNF (＞10 μm); 異養(yǎng)小鞭毛蟲 HNF (2～5 μm)、HNF (5～10 μm)、HNF (＞10 μm)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用 SPSS 15.0 統(tǒng)計軟件進行分析,將沉積物中各類群豐度的不同處理進行T-test 檢驗。為使數(shù)據(jù)正態(tài)分布,將原始數(shù)據(jù)經(jīng)過 log 轉(zhuǎn)化處理。

2 結(jié)果

2.1 站位基本情況

實驗中 5 個站位 (3205、3403、4018、3400-8、3800-1) 的環(huán)境因子見表 1。

表1 五個站位 3205、3403、4018、3400-8、3800-1的環(huán)境因子Tab.1 Environmental factors of the five stations: 3205,3403,4018,3400-8,and 3800-1

圖2 DAPI 染色后的細菌 (2-1)、硅藻 (2-2,2-3)、鞭毛蟲 (2-4～2-7) 及藍細菌 (2-8)Fig.2 Bacteria (2-1),diatoms (2-2 and2- 3),flagellates (2-4～2-7) and cyanobacteria (2-8) stained with DAPI

2.2 保藏方式實驗

利用 DAPI 染色,對三站位 (3205、3403、4018)0～2 cm 分層的冷凍、冷藏樣品進行分析。熒光鏡檢觀察到細菌及各種原生生物的形態(tài)如圖 2 所示,細菌大小約為 1～2 μm,常見為球菌、桿菌、弧形菌; 硅藻種類多樣,有圓篩藻、曲舟藻、直鏈藻等,常見10 μm大小的直鏈藻; 鞭毛蟲形態(tài)多種多樣,有球形,橢球形等,個體大小差異也較大; 藍細菌多為 2 個或 4個一組存在。

圖3 示 3205、3403、4018 站冷凍、冷藏兩種保藏方式下各類群的豐度。三個站位冷凍樣品中細菌平均豐度為 8.69×108±2.92×108個/mL,較冷藏樣品低 25% (平均 1.16×109±0.31×109個/mL),2～5 μm 的鞭毛蟲平均豐度為 4.00×106±0.97×106個/mL,較 冷 藏 樣 品 低 25% (平 均 5.39×106±1.92×106個/mL),5～10 μm 的鞭毛蟲平均豐度為 5.07×105±3.06×105個/mL,較冷藏樣品低 23%(平均 6.61×105±3.06×105個/mL),＞10 μm 的鞭毛蟲平均豐度為4.50×104±4.82×104個/mL,較冷藏樣品低 79% (平均 2.18×105±1.38×105個/mL),硅 藻 平 均 豐 度 為8.35×104±7.71×104個/mL,較冷藏樣品低13% (平均9.63×104±13.9×104個 /mL),藍 細 菌 平 均 豐 度 為2.56×106±0.75×106個/mL,較冷藏樣品高 9% (平均2.35×106±0.86×106個/mL)。沉積物中細菌在豐度(108～109) 上占絕對優(yōu)勢 (冷藏冷凍樣品 98.84%～99.35%),冷藏保存下 4018 站的細菌豐度最高; 其次是自養(yǎng)小鞭毛蟲 (豐度占0.32%～0.57%)、藍細菌(豐度占 0.12%～0.40%)、異養(yǎng)小鞭毛蟲 (豐度占0.02%～0.25%),硅藻豐度所占比例最小 (0～0.02%)。三個站位沉積物樣品中相同粒級的自養(yǎng)小鞭毛蟲的豐度均高于異養(yǎng)小鞭毛蟲。自養(yǎng)小鞭毛蟲豐度 4018站最高,其次是 3403 站、3205 站。按鞭毛蟲大小看,2～5 μm 鞭毛蟲的豐度最高,5～10 μm 鞭毛蟲豐度次之,＞10 μm 鞭毛蟲豐度最小。

T-test 檢驗結(jié)果表明,冷凍、冷藏兩種保藏方式下,3205 站和 3403 站的各測試對象：細菌、硅藻、藍細菌、自養(yǎng)小鞭毛蟲、異養(yǎng)小鞭毛蟲均無差異;4018 站的細菌、硅藻、藍細菌、異養(yǎng)小鞭毛蟲及PNF(＞10 μm) 均無差異,而 PNF (2～5 μm)、PNF (5～10 μm) 存在顯著差異 (P＜0.05),PNF (2～5 μm) 冷藏樣品豐度顯著高于冷凍樣品 92.1%,PNF (5～10 μm)冷藏樣品豐度顯著高于冷凍樣品 89.5% (表 2)。

圖3 冷凍及冷藏兩種保藏方式下3個站位 (3205、3403、4018) 的細菌 (a)、硅藻 (b)、藍細菌 (c)、自養(yǎng)小鞭毛蟲 (d)和異養(yǎng)小鞭毛蟲 (e) 的豐度Fig.3 Abundances of bacteria (a),diatoms (b),cyanobacteria (c),PNF (d) and HNF (e) from Stations 3205,3403 and 4018,respectively.Samples that underwent either 4 °C or -20 °C storage were measured

2.3 保藏時間實驗

為研究不同保藏時間對細菌及各原生生物類群定量計數(shù)的影響,對來自黃海的兩個站位 (3400-8及 3800-1) 0～2 cm 及 2～5 cm 分層的樣品經(jīng)保存1 個月和 4 個月后的對比分析見表 3。兩個站位的各類群中,細菌豐度均超過 99%,自養(yǎng)小鞭毛蟲占0.42%,異養(yǎng)小鞭毛蟲、藍細菌,硅藻所占比例最小。在保存 1 個月和 4 個月后各類群所占的百分比基本保持穩(wěn)定。統(tǒng)計分析表明,不同保存時間下,3400-8 及 3800-1 站的兩個分層的細菌、藍細菌、PNF (5～10 μm)、PNF (＞10 μm)、HNF (＞10 μm) 和硅藻均無差異。3400-8 站兩個分層的 HNF (2～5 μm)均有顯著差異,保存 4 個月后鏡檢均未檢獲到; 而PNF (2～5 μm) 和 HNF (5～10 μm)均無差異。3800-1站 0～2 cm 分層的 PNF (2～5 μm)和 HNF (5～10 μm)均有顯著差異,保存4個月后PNF (2～5 μm) 的豐度比1個月時減少了47.4%,HNF (5～10 μm)未檢獲到;2～5 cm 分層的 PNF (2～5 μm)、HNF (2～5 μm)均有顯著差異,保存4個月后 PNF (2～5 μm)豐度比 1個月時減少了 59.6%,HNF (2～5 μm)未檢獲到 (表 3 和表4)。

表2 不同保藏方式下3205、3403、4018站位的0~2cm分層細菌,藍細菌及原生生物的T-Test檢驗Tab.2 T-Test analyses of bacteria,cyanobacteria and protists in the 0~2 cm layer at Stations 3205,3403 and 4018 under two different preservations

3 討論

3.1 保藏方式對定量的影響

Porter等[7]報道福爾馬林固定后的浮游樣品經(jīng)DAPI 染色封片后,4℃保存24周,細菌計數(shù)結(jié)果無差異。Hyun等[8]研究發(fā)現(xiàn)浮游樣品采集后經(jīng)福爾馬林固定,一部分存于樣品瓶中,一部分現(xiàn)場染色封片,均冷凍保存90天。結(jié)果顯示存于樣品瓶后的細菌數(shù)量為原來的 95%,而封片中細菌數(shù)量為原來的80%,且反復凍融可造成細菌數(shù)量損失。但有關(guān)底棲樣品保藏后對實驗結(jié)果的影響研究極少。本研究三個站位中,對于細菌、藍細菌、硅藻、三個粒級的異養(yǎng)小鞭毛蟲以及大于10 μm的自養(yǎng)小鞭毛蟲,冷凍、冷藏兩種保藏方式無差異; 而對于 2～5 μm 與 5～10μm的自養(yǎng)小鞭毛蟲來說,在一個站位呈現(xiàn)差異顯著,冷藏獲得的豐度高于冷凍保藏。原因可能在于冷凍樣品的解凍過程對細胞尤其是較大個體的細胞造成破碎,解凍對于細胞壁較為堅實的細菌和藍細菌的影響較小,而對于細胞壁不太堅實的鞭毛蟲則影響較大。因此,對沉積物樣品短期內(nèi)宜采用避光冷藏保存。此外,沉積物類型的不同,也會對定量計數(shù)造成影響：例如,含砂量較多的樣品過濾到黑膜上后,可造成細胞分布不均或鏡檢時焦距不同而影響計數(shù),而含泥較多則會遮掩部分細菌及小的原生生物。

表3 兩站位(3400-8,3800-1)的0~2 cm及2~5 cm分層樣品在保存1個月和4個月后的細菌、藍細菌及原生生物的豐度Tab.3 Abundance of bacteria,cyanobacteria and protists in the 0~2 cm and 2~5cm layers of Stations 3400-8 and 3800-1 after 1 and 4 months

表4 兩站位(3400-8,3800-1)的0~2 cm及2~5 cm分層在保存1個月和4個月后的細菌及原生生物的T-Test檢驗結(jié)果Tab.4 T-Test analyses of bacteria and protists in the 0~2 cm and 2~5cm layers of Stations 3400-8 and 3800-1 after 1 and 4 months

3.2 樣品保存時間對定量的影響

在樣品保存時間對底棲生物定量分析的影響方面,迄今尚無研究報道。Daley等[4]、Sherr等[5]及Kepner 等[6]發(fā)現(xiàn)經(jīng)福爾馬林固定的浮游樣品于 5℃下避光保存 1～2周后,對細菌的計數(shù)結(jié)果無差異。Turley[9]曾報道經(jīng)戊二醛固定后的浮游樣品常溫避光保藏,前 40天內(nèi)細胞數(shù)量平均減少39%,并證實無論以何種固定液 (戊二醛或甲醛)、樣品瓶 (無色或棕色瓶) 或染色劑 (AO或DAPI) 處理,均會造成細胞數(shù)量的低估。本研究表明樣品隨著保存時間的延長 (保藏 1個月和 4個月),對其定量計數(shù)依不同研究對象而有程度不同的影響：對于細菌、藍細菌、PNF (5～10 μm)、PNF (＞10 μm)、HNF (＞10 μm)、硅藻保存 4 個月后計數(shù)無影響; 而對于 PNF (2～5 μm)、HNF (2～5 μm)、HNF (5～10 μm) 的影響不同,例如樣品保存4個月后,在3800-1站0～2 cm分層的PNF (2～5 μm) 豐度比1個月時減少了47.4%,2～5 cm分層的豐度減少了 59.6%,而且統(tǒng)計分析存在差異的 HNF (2～5 μm)和 HNF (5～10 μm)在 4 個月后豐度降為0?？梢姌悠繁２貢r間對異養(yǎng)小鞭毛蟲的影響比自養(yǎng)小鞭毛蟲的影響大。總體上,樣品保藏4個月對細菌、藍細菌、硅藻均無影響,但對鞭毛蟲有一定的影響,因此建議對鞭毛蟲樣品在采集后宜盡快分析。

4 結(jié)語

冷凍和冷藏兩種保藏方式對于細菌、藍細菌和硅藻的影響未呈現(xiàn)明顯差異,但對于自養(yǎng)小鞭毛蟲則冷藏優(yōu)于冷凍方式,故建議短期內(nèi)對沉積物樣品采取避光冷藏保存,并在采集后盡快完成樣品的定量分析。

致謝：本研究樣品源于“中國科學院海洋研究所2007 年度黃海冷水團調(diào)查航次”。杜永芬、代仁海、詹子鋒協(xié)助采樣,李承春協(xié)助部分樣品處理,在此一并致謝。

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