對蝦白斑綜合征病毒wsv477基因的克隆表達(dá)與時相分析

韓芳，王志勇，巫旗生，王曉清*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院，福建 廈門 361021）

白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）發(fā)現(xiàn)于20世紀(jì)90年代初，是造成對蝦大面積暴發(fā)性流行病的主要病原體[1-2]．該病毒不僅可以廣泛感染所有人工養(yǎng)殖的對蝦，還能感染其他淡水及海水甲殼類，如螃蟹、螯蝦等，甚至可以感染昆蟲．目前尚未發(fā)現(xiàn)能夠耐受WSSV的蝦群，而感染的對蝦在一周內(nèi)死亡率高達(dá)90%～ 100%[1]．該病害嚴(yán)重阻礙對蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，還對海洋環(huán)境構(gòu)成威脅，已成為全世界廣泛關(guān)注和研究的熱點(diǎn)．

研究表明，WSSV病毒是一種新型的有囊膜的環(huán)狀雙鏈DNA病毒，基因組長度約305 kb[3-4]，屬線頭科（Nimaviridae），Whispovirus屬[5]．該病毒與昆蟲桿狀病毒形態(tài)上很相似，但基因比對沒有同源性．生物信息學(xué)分析表明，該病毒約有181個開放閱讀框，所編碼的蛋白質(zhì)和已知的蛋白質(zhì)基本沒有同源性．目前的研究主要是對WSSV結(jié)構(gòu)和功能基因進(jìn)行分析，尋找預(yù)防和控制白斑綜合征感染的有效方法[5]．在研究病毒功能基因時，需要確定可以轉(zhuǎn)錄表達(dá)的基因以及轉(zhuǎn)錄表達(dá)的時相．楊豐等[3]用生物學(xué)軟件預(yù)測WSSV基因組蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域時發(fā)現(xiàn)，在基因組274527至275150區(qū)間存在1個可能的病毒感染早期基因（wsv477基因）．筆者將wsv477基因克隆到原核表達(dá)系統(tǒng)中，誘導(dǎo)了這個蛋白的表達(dá)，并進(jìn)行了純化，制備了多克隆抗體．現(xiàn)將結(jié)果報道如下．

1 材料與方法

1.1 材 料

成年小白鼠由廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院提供；WSSV由國家海洋局第三海洋研究所提供；試驗(yàn)對蝦為日本對蝦（Penaeus japonicus），體長10～15 cm，購于廈門集美菜市場．引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成．

1.2 方 法

1.2.1 人工感染試驗(yàn)

試驗(yàn)前將對蝦充氣養(yǎng)殖3 d．隨機(jī)抽取5只進(jìn)行WSSV檢測，確定試驗(yàn)用蝦為不帶WSSV的健康蝦．感染時，每只對蝦注射100 μL用生理鹽水稀釋的WSSV液，分別收集注射后0、2、4、6、12、24、48、96 h的鰓樣品（各取2只等量混合），存放于超低溫冰箱．

1.2.2 病毒DNA模板的制備

PCR模板的制備參照文獻(xiàn)[6]的方法：將20 mg左右的對蝦組織置于離心管中，加入200 μL裂解液（50 mmol Tris-HCl，pH8.0，25 mmol EDTA，4 mol guanidinum thiocyanate，0.5 % N-lauroylarcosine）后搗碎，12 000 r/min離心3 min，上清用二氧化硅吸附DNA，乙醇洗滌，60 ℃烘干后用20 μL蒸餾水溶解．

1.2.3wsv477基因克隆和重組質(zhì)粒構(gòu)建

wsv477基因 ORF克隆．根據(jù)已知的 WSSV ORF477序列（GenBank登錄號DQ121373），設(shè)計1對引物，P1：5′-CGCGGATCC ATGTATATCTTCGTCG A-3′（BamHI），P2：5′-CCGGAATTCTTATAAGAAA TGTACAA-3′（EcoRI），下劃線表示加入的BamHI 和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)．以病毒DNA為模板擴(kuò)增目的片段．PCR擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸7 min．取少量PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，剩余的用DNA回收試劑盒（華舜，上海）回收純化．

重組質(zhì)粒構(gòu)建．將回收的PCR產(chǎn)物經(jīng)BamHI和EcoRⅠ酶切后，連接到經(jīng)同樣酶切的pGEX-4T-2載體（Pharmacia）中（重組質(zhì)粒命名 pGEX-4T-2-wsv477），然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，少量制備質(zhì)粒DNA，經(jīng)雙酶切檢驗(yàn)后，送上海英駿公司進(jìn)行測序確認(rèn)．

1.2.4 重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)

將測序正確的陽性克隆菌株置于含100 mg/L氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基（10 g/L胰蛋白胨，5 g/L酵母浸粉，10 g/L氯化鈉）中，37 ℃搖培過夜．次日按1 100轉(zhuǎn)接后，繼續(xù)培養(yǎng)3 h至OD600nm約為0.7，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度1 mmol/L，37 ℃振蕩培養(yǎng)4～6 h．5 000 r/min離心5 min，收集菌體，每1.5 mL菌液所得的菌體沉淀用100 μL的TE緩沖液懸浮，加入2×SDS- PAGE加樣緩沖液煮沸10 min，進(jìn)行12 % SDS - PAGE電泳，以轉(zhuǎn)化空載體的E. coliBL21為對照，電泳結(jié)束后，用0.025 %考馬斯亮蘭R250進(jìn)行顯色后觀察．

1.2.5 融合蛋白的可溶性分析和蛋白質(zhì)純化

按1%的接種量轉(zhuǎn)接菌液250 mL，37 ℃搖培誘導(dǎo)．誘導(dǎo)表達(dá)的菌液于5 000 r/min 離心5 min，收集菌體，加入15 mL裂解液（含1 %Triton X-100的1×PBS），冰浴超聲（超聲10 s，間隔10 s，功率200 W）直至菌液清亮．4 ℃下15 000 r/min離心20 min后，分別取上清和沉淀，用于SDS-PAGE進(jìn)行融合蛋白可溶性分析[7]．

將超聲裂解的菌液上清與Glutathione Sepharose 4B（Sigma）低溫混勻裝柱．用冰冷的PBS洗去雜蛋白，至流出液的OD280nm接近于0．用洗脫緩沖液（50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L還原型谷胱甘肽，pH 8.0）洗脫目的蛋白．

1.2.6 多克隆抗體的制備

將純化的wsv477-GST融合蛋白2 mL（質(zhì)量濃度為100 μg/mL）與 2 mL弗氏完全佐劑（Sigma）乳化，腹腔注射 10只小白鼠進(jìn)行免疫．初次免疫 1周后，改用不完全佐劑，每周加強(qiáng)免疫1次，連續(xù)4周．小鼠末次免疫3 d后斷尾取血，免疫血清利用 ProteinA進(jìn)行純化[7]．純化后的抗體分裝，于－80 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.2.7wsv477轉(zhuǎn)錄時相分析

分別提取不同WSSV感染時間（0、2、4、6、12、24、48、96 h）的對蝦鰓組織總RNA作為模板，用隨機(jī)引物oligo （dT）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一條鏈，以wsv477基因特異的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以日本對蝦β-actin基因作為陽性對照．

1.2.8 蛋白質(zhì)印跡（ Western blot） 檢測

用蛋白裂解液（50 mmol Tris，1.0 mmol EDTA，150 mmol NaCl，0.1 % SDS，1 % TritonX-100，1 %去氧膽酸鈉，1 mmol蛋白酶抑制劑coclktail）從對蝦鰓組織中提取總蛋白．采用文獻(xiàn)[8]的方法定量蛋白質(zhì)后，取1 mg蛋白質(zhì)上樣，在12 %SDS-PAGE上進(jìn)行電泳，分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜（70 V, 1 h）．用5 %脫脂牛奶（溶于TBST中）封閉1 h，以1 ∶ 10 000的比例加入wsv477的多克隆抗體，與膜雜交反應(yīng)1 h，TBST多次漂洗，再加HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗雜交1 h，經(jīng)TBST 漂洗后，用TMB顯色[9]．3次重復(fù)．

2 結(jié)果與分析

2.1 wsv477基因克隆

以WSSV病毒DNA為模板，用wsv477特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測得到1條600 bp左右的目的帶（圖1），與預(yù)測的大小一致．將wsv477基因克隆到pMD-18T進(jìn)行測序，比對結(jié)果與已知序列完全一致．重新將wsv477基因克隆到pGEX-4T-2表達(dá)載體上（重組質(zhì)粒被命名為wsv477-pGEX-4T-2），轉(zhuǎn)化E. coliBL21感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性轉(zhuǎn)化菌培養(yǎng)后，提取質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切檢驗(yàn)（圖2）．進(jìn)一步測序結(jié)果表明，插入序列正確，且沒有出現(xiàn)移碼．該基因編碼的開放閱讀框（ORF）624 bp，預(yù)測編碼 208個氨基酸，本試驗(yàn)原核表達(dá)的WSV477蛋白理論相對分子質(zhì)量約為24 000．

圖1 wsv477基因的PCR產(chǎn)物Fig. 1 PCR product of wsv477 gene

圖2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定Fig.2 Double digestion of the recombinant plasmid.

2.2 WSV477蛋白質(zhì)表達(dá)和純化

將測序正確的陽性克隆菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行SDS-PAGE分析．pGEX-4T-2質(zhì)粒本身有谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）的基因，編碼蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量約為25 000，當(dāng)插入外源基因片段后，可表達(dá)出外源基因和GST基因的融合蛋白．本試驗(yàn)中融合蛋白GST-WSV477的預(yù)計相對分子質(zhì)量約為49 000．重組菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后在相對分子質(zhì)量49 000左右處出現(xiàn)一條明顯的蛋白條帶，而在表達(dá)載體 PGEX-4T-2及不誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒對照中都無此帶（圖3），說明wsv477基因克隆到表達(dá)載體后在大腸桿菌中獲得了高效表達(dá)．超聲裂解細(xì)菌，高速離心后將上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分析重組蛋白的可溶性，在菌液上清中重組蛋白大量存在，而沉淀中極少（圖4），說明GST-WSV477融合蛋白在菌體里為可溶性表達(dá)．

圖3 GST-WSV477融合蛋白質(zhì)表達(dá)分析Fig.3 Solublity analysis of expressed GST-WSV477 fusion protein

圖4 GST-WSV477融合蛋白質(zhì)的可溶性分析Fig.4 Solublity analysis of expressed GST-WSV477 fusion protein

大量搖配重組表達(dá)菌，將菌液裂解上清經(jīng)Sepharose 4B親和層析純化，純化的重組蛋白經(jīng)SDS-PAGE （圖5），獲得了純度較高的融合蛋白．

圖5 wsv477在E.coli中的表達(dá)和純化Fig.5 Expressed and purified proteins encoded by wsv477 gene in E. coli

2.3 wsv477基因轉(zhuǎn)錄時相的RT-PCR分析

圖6結(jié)果表明，wsv477基因在病毒感染后4 h開始轉(zhuǎn)錄（圖6-A）．

圖6 wsv477基因轉(zhuǎn)錄時相分析Fig.6 Temporal transcription analysis of the wsv477 gene by RT-PCR in vivo

2.4 WSV477蛋白表達(dá)時相的Western blot 分析

采用 Protein A agarose親和柱分離純化WSV477蛋白的抗血清，得到 WSV477蛋白的抗體．采用間接ELISA法測定抗體效價，抗體滴度為1 10 000． 對各WSSV感染時間（0、2、4、6、12、24、48 h）的對蝦鰓蛋白質(zhì)進(jìn)行Western blot分析，檢測WSV477蛋白在對蝦體內(nèi)的表達(dá)時相． 結(jié)果顯示，在病毒感染6 h后開始檢測到WSV477蛋白（圖7），說明wsv477基因編碼的WSV477病毒蛋白在WSSV病毒感染6 h后開始表達(dá)．

3 結(jié)論與討論

對蝦白斑綜合征病毒是世界對蝦養(yǎng)殖中蝦病的主要病原，至今未發(fā)現(xiàn)有效的防治方法，有待對病毒分子生物學(xué)進(jìn)行深入研究[10]，其中與病毒轉(zhuǎn)錄和復(fù)制相關(guān)的功能基因研究是非常重要的方面．

筆者采用PCR方法首次克隆了wsv477基因，其 ORF長度為 624 bp，預(yù)測編碼 208個氨基酸．WSSV基因組分析表明，wsv477編碼的蛋白質(zhì)存在Cys2/Cys2型鋅指結(jié)構(gòu)域[3]．在許多病毒中發(fā)現(xiàn)的鋅指蛋白，可以作為蛋白質(zhì)與核酸或蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用參與病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制等過程[11-12]的調(diào)控因子．WSV477鋅指蛋白序列與鋅指蛋白的典型序列并不完全一致，可能是類鋅指蛋白，其生物學(xué)功能需要通過進(jìn)一步的試驗(yàn)驗(yàn)證．

本研究中通過轉(zhuǎn)錄和表達(dá)時相分析，確定wsv477基因在病毒感染對蝦4 h后開始轉(zhuǎn)錄，6 h

后開始表達(dá)，是個典型的病毒感染早期基因[13]．目前在 WSSV中已經(jīng)確認(rèn)的早期基因主要有參與核苷酸代謝、DNA復(fù)制有關(guān)的酶類，包括胸腺嘧啶核苷酸合成酶[14]、胸腺嘧啶激酶[9]、核酸內(nèi)切酶[15]、DNA聚合酶[16]等．病毒早期基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)與否決定晚期基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響病毒的復(fù)制與增殖，在病毒感染中具有非常重要的地位．通過本研究可確認(rèn)WSSV的wsv477基因?yàn)樵缙诒磉_(dá)基因，為WSSV的早期診斷提供了理論依據(jù)．下一步工作需要采用蛋白質(zhì)互作的方法，尋找對蝦中與WSV477相互作用的蛋白質(zhì)．通過構(gòu)建WSV477蛋白的原核表達(dá)重組載體，誘導(dǎo)重組表達(dá)，獲得重組蛋白GST-WSV477．

[1] Lightner D V，Redman R M，Morre D W. Development and application of a simple and rapid diagnostic method to studies on hepatopancreatic parvovirus of penaeid shrimp[J]. Aquaculture，1993，116：25-33.

[2] Flegel T W. Major viral diseases of the black tiger prawn （Penaeus monodon） in Thailand[J].World J Microb Biot，1997，13：433-442.

[3] Yang F，He J，Lin X H，et al. Complete genome sequence of the shrimp white spot bacilliform viru[J]．J Virol，2001，75：11811-11820.

[4] Sandbrink H，Lankhorst R K. The white spot syndrome virus DNA genome sequence[J]. Virology，2001，286：7-22.

[5] 于洪濤，黃捷，張士璀. 對蝦白斑綜合征病毒（WSSV）致病相關(guān)基因研究進(jìn)展[J]．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（18）：7712-7715.

[6] 吳文林，戴聰杰，王磊． PCR法分析WSSV在日本對蝦體內(nèi)的感染增殖[J]．泉州師范學(xué)院學(xué)報：自然科學(xué)版，2005，23（2）：77-80.

[7] 薩姆布魯克J，拉塞爾D W. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M]．3版. 黃培堂，譯．北京：科學(xué)出版社，2002：457-471.

[8] 汪家政，范明．蛋白質(zhì)技術(shù)手冊[K]. 北京：科學(xué)出版社，2000：55-57.

[9] Tzeng H F，Chang Z F，Peng S E，et al. Chimeric polypeptide of thymidine kinase and thymidylate kinase of shrimp white spot syndrome virus：Thymidine kinase activity of the recombinant protein expressed in a baculovirus/insect cell system[J]. Virology， 2004， 299：248-255.

[10] 孫志良，符少輝，陳立祥. 人α-干擾素對中國對蝦皮下及造血組織壞死桿狀病毒的作用[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，1999，25（2）：124-126.

[11] Joazeiro C A P，Weissman A M．RING finger proteins：Mediators of ubiquitin ligase activity[J]. Cell，2000，102：549- 552.

[12] 朱艷冰，楊豐. 對蝦白斑綜合征病毒基因組同源重復(fù)區(qū)結(jié)合蛋白的篩選[J]. 臺灣海峽，2006，25（3）：318-323.

[13] Okano K，Mikhailov V S，Maeda S. Colocalization of baculovirus IE-1 and two DNA-binding proteins，DBP and LEF-3，to viral replication factories[J]. J Virol，1999，73：110-119.

[14] Li Q，Pan D，Zhang J H，et al. Identification of the thymidylate synthase within the genome of white spot syndrome virus[J]. J Gen Virol，2004，85：2035-2044.

[15] Li L，Lin S M，Yang F. Functional identification of the non-specific nuclease from white spot syndrome virus[J]. Virology，2005，337：399-406.

[16] Chen L L，Wang H C，Huang C J，et al. Transcriptional analysis of the DNA polymerase gene of shrimp white spot syndrome virus[J]. Virology，2002，301（1）：136-147．

英文編輯：羅文翠