擬南芥18srRNA參與隱花色素介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的研究*

汪啟明,屠小菊,唐冬英,趙小英,劉選明?

(1.湖南大學(xué)生物學(xué)院;化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南長(zhǎng)沙 410082; 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410128)

擬南芥18srRNA參與隱花色素介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑的研究*

汪啟明1,2,屠小菊1,唐冬英1,趙小英1,劉選明1?

(1.湖南大學(xué)生物學(xué)院;化學(xué)生物傳感與計(jì)量學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖南長(zhǎng)沙 410082; 2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖南長(zhǎng)沙 410128)

通過(guò)篩選以擬南芥藍(lán)光受體隱花色素雙突變體cry1cry2為遺傳背景的激活標(biāo)簽突變體庫(kù),得到一株SCC98-D株系,該突變體具有早開(kāi)花,下胚軸變短,并具有花瓣數(shù)目增加等表型,徹底恢復(fù)了cry1cry2的晚開(kāi)花和長(zhǎng)下胚軸表型.通過(guò)Tail-PCR的方法克隆得到SCC98-D突變體中激活標(biāo)簽插入位點(diǎn)的側(cè)翼序列,通過(guò)對(duì)該側(cè)翼序列測(cè)序發(fā)現(xiàn)插入位點(diǎn)在18srRNA的1751bp處,運(yùn)用RT-PCR方法分析插入位點(diǎn)周?chē)虻谋磉_(dá),發(fā)現(xiàn)只有18srRNA的表達(dá)被激活,由此證實(shí)了18srRNA參與隱花色素介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑.

擬南芥;隱花色素;激活標(biāo)簽突變體;18s核糖體RNA

植物的藍(lán)光受體對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育起著非常重要的調(diào)控作用,擬南芥的藍(lán)光受體包括隱花色素(cryptochrome)和向光素(phototropin)[1],隱花色素能夠調(diào)控?cái)M南芥長(zhǎng)日照條件下的開(kāi)花時(shí)間、光形態(tài)建成、氣孔開(kāi)放等一系列的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[2-3],現(xiàn)代的植物分子生物學(xué)的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),擬南芥體內(nèi)主要發(fā)揮功能的隱花色素是CRY 1和CRY2[4-6].

近20年的研究發(fā)現(xiàn),隱花色素能夠通過(guò)與常數(shù)基因(Constans),光形態(tài)建成負(fù)調(diào)控因子COP1,鈣調(diào)蛋白SUB1以及轉(zhuǎn)錄因子CIB1等蛋白相互作用,將信號(hào)傳遞給下游基因從而調(diào)控植物的多個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[7-11].然而,對(duì)藍(lán)光受體隱花色素調(diào)控下游基因表達(dá)的分子機(jī)制的了解仍不透徹[12],詳細(xì)了解植物的光信號(hào)傳遞途徑對(duì)于合理利用植物有益基因資源和開(kāi)發(fā)生物能源有著非常重要的意義,所以,研究與隱花色素直接相互作用或者參與隱花色素介導(dǎo)的信號(hào)途徑的基因是現(xiàn)代植物分子生物學(xué)的研究熱點(diǎn).

本文以隱花色素雙突變體cry1cry2為實(shí)驗(yàn)材料,通過(guò)激活標(biāo)簽技術(shù)構(gòu)建了T-DNA插入突變體庫(kù).通過(guò)篩選具有開(kāi)花時(shí)間提前,植株矮化等表型的SCC突變體(sup press cry1cry2,抑制cry1cry2表型的突變體),并選取突變體庫(kù)中表型為顯性的突變體,命名為sup press cry1cry2-dom inant(SCC-D),同時(shí)采用 TA IL-PCR(Thermal asymmetric interlaced-PCR,熱不對(duì)稱(chēng)巢式PCR)和RT-PCR方法對(duì)突變體進(jìn)行分析,發(fā)掘被激活的基因,為闡明藍(lán)光受體隱花色素發(fā)揮功能的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 植物材料

擬南芥野生型(wild-type,W T)為col-4,哥倫比亞生態(tài)型;突變體cry1cry2:其遺傳背景為 col-4;突變體SCC98-D是以cry1cry2為受體,通過(guò)插入激活標(biāo)簽篩選分離而來(lái).

1.2 植物培養(yǎng)

擬南芥種子用體積分?jǐn)?shù)為70%酒精處理30 s,然后用體積分?jǐn)?shù)為0.1%升汞滅菌8m in,無(wú)菌水沖洗4～5次,均勻播于MS鹽+質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%瓊脂的培養(yǎng)基上.4℃處理4 d后,連續(xù)照白光12 h,以促進(jìn)種子萌發(fā),并將植物轉(zhuǎn)入22℃培養(yǎng)室,分別在長(zhǎng)日照白光(16光照,8 h黑暗)和黑暗處理培養(yǎng)后觀察苗期表型,以及在培養(yǎng)土中長(zhǎng)日照白光(16光照,8 h黑暗)培養(yǎng)觀察開(kāi)花時(shí)間.本試驗(yàn)中用的藍(lán)光、紅光、遠(yuǎn)紅光和白光光源分別為:LED-B(波長(zhǎng)為470 nm,半幅寬為30 nm),LED-R(波長(zhǎng)為660 nm,半幅寬為20 nm),LED-FR(波長(zhǎng)為740 nm,半幅寬為25 nm)和白色熒光燈(飛利普).藍(lán)光、紅光和白光的光照強(qiáng)度用Li-250量子光度計(jì)測(cè)量.遠(yuǎn)紅光的強(qiáng)度先用Li-250量子光度計(jì)測(cè)量,然后根據(jù)分光照度計(jì)測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行估計(jì).

1.3 質(zhì)粒

激活標(biāo)記載體pSKI015(見(jiàn)圖1)由美國(guó)加州大學(xué)洛杉磯分校林辰濤教授提供.

圖1 激活標(biāo)簽載體pSK I015示意圖Fig.1 Diagram of activation tagging vector pSK I015

1.4擬南芥總DNA提取

液氮充分研磨植物材料,將75 mg新鮮材料樣品中加400μL Buffer AP1,4μL RNase A,充分混勻;在65℃培養(yǎng)10 min,期間上下顛倒離心管2～3次;在130μL Buffer AP2,混勻,冰上放置 5 m in, 14 000 rpm離心5 min;將上清轉(zhuǎn)入含2 m L收集管的過(guò)濾柱內(nèi),10 000 r/m in離心2min;將下清轉(zhuǎn)入新的1.5 m L離心管內(nèi),加1.5倍體積的 Buffer AP3/E,顛倒3～4次,混勻;把溶液轉(zhuǎn)入含2 m L收集管的吸附柱內(nèi),10 000 rpm離心1～2 min;如果一次過(guò)不完柱,可多次加樣直至過(guò)濾完成,倒掉收集管中的液體;加500μL Buffer AW 1,10 000 rpm離心1 m in,棄下清;加 500μL Buffer AW 2,10 000 rpm離心 1 min,棄下清;重復(fù)上一步操作一次; 14 000 rpm離心3 min,將離心柱轉(zhuǎn)移至1.5m L離心管內(nèi);加50～100μL Buffer AE至吸附柱濾膜上,室溫靜置 1～5 min,10 000 rpm 離心1 m in;將離心管中DNA溶液電泳檢查后,置于-20℃保存.

1.5 T-DNA插入突變體側(cè)翼序列的克隆

TA IL-PCR是一種比較成熟的擴(kuò)增T-DNA插入側(cè)翼序列的技術(shù)[13-15].本實(shí)驗(yàn)利用該技術(shù)來(lái)擴(kuò)增突變體載體左臂的基因組DNA側(cè)翼序列.根據(jù)pSKI015載體的序列,TAIL-PCR反應(yīng)的3個(gè)特異性引物如下:LS1 5'-GACAACATGTCGAG-GCTCAGCAGGA-3';LS2 5'-TGGACGTGAATGTAGACACGTCGA-3';LS3 5'-GCTTTCGCCTATAAATACGACGG-3'.其中 LS3離 T-DNA的左臂最近,這3個(gè)特異性引物的 Tm值較高,為60℃相鄰.6個(gè)簡(jiǎn)并引物為AD1:5'-NTCGASTWTSGWGTT-3';AD2:5'-NGTCGASWGA NAWGAA-3';AD3:5'-WGTGNAG-WANCANAGA-3';AD4:5'-AG-WGNAGWANCAWAGG-3';AD5:5'-GNAGT-GWSANCAA-GA-3';AD6:5'-STTGNTASTNCTNTGC-3'.這6個(gè)簡(jiǎn)并引物的 Tm值較低,均為 45℃左右. TAIL-PCR的擴(kuò)增條件為第1輪PCR:4℃,2 min;93℃,1 min;95℃,1 min;(94℃,30 s;62℃, 1min;72℃,2.5 min)5個(gè)循環(huán);94℃,30 s;25℃, 3min;升溫0.2 ℃/s,升至72 ℃(約需4 min);72℃,2.5min;(94℃,10 s;68℃,1m in;72℃,2.5 min;94℃,10 s;68℃,1 min;72℃,2.5 m in;94℃,10 s;44℃,1 min;72℃,2.5 min)15個(gè)循環(huán);72℃,5min.第2輪PCR以第1輪的產(chǎn)物稀釋50倍后取1μL為模板,擴(kuò)增條件為4℃2m in;(94℃,10 s;64℃,1 min;72℃,2.5 min;94℃,10 s; 64℃,1 min;72℃,2.5 min;94℃,10 s;44℃,1 min;72℃,2.5 min)12個(gè)循環(huán);72℃,5min.第3輪PCR以第2輪的產(chǎn)物稀釋50倍后取1μL為模板,擴(kuò)增條件為4℃,2 min;(94℃,15 s;44℃,1 min;72℃,2.5 min)20個(gè)循環(huán);72℃,5min.3輪PCR的反應(yīng)體系均為20μL.

1.6 總RNA提取及cDNA第1鏈的合成

1)采用安比奧公司生產(chǎn)的 RNA提取試劑盒,提取總RNA;

2)按照試劑說(shuō)明書(shū)在總RNA溶液中加適量的Rnase(無(wú)DNase I)和10×Buffer,37 ℃水浴30min;

3)加水使溶液體積達(dá)500μL,然后加等體積氯仿混勻;

4)4℃,12,000 rpm 離心10m in,取上清,然后加2.5倍體積無(wú)水乙醇混勻,-20℃放置30 min;

5)4℃,12000 r/m in離心15min,然后用70%乙醇洗滌沉淀1～2次,真空干燥后將沉淀溶于適量的無(wú)RNase水,通過(guò)熒光分光光度計(jì),進(jìn)行樣品濃度和純度的測(cè)量,純度合格的RNA樣品-80℃保存?zhèn)溆?

6)合成cDNA第1鏈的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為25 μL,首先在無(wú) RNase的離心管中加約2μg的總RNA和Promega公司0.5μg Olig(dT)15,體系不能超過(guò)14μL,混勻,4℃短暫離心,70℃水浴5min后,立即冰浴冷卻.短暫離心后,依次加入10×Buffer 2.5μL,Genview 公司 10 mM dNTPs 1.25μL, MBI公司RNaseA抑制劑25 u,Promega公司MM LV逆轉(zhuǎn)錄酶 200 u,加無(wú)RNase的水至25μL, 42℃反應(yīng) 60m in后,70℃水浴10 min使酶失活,即得cDNA第1鏈.

1.7 半定量RT-PCR

半定量RT-PCR(Sem i-quantitative PCR)引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)介紹的方法[16-17],根據(jù)半定量PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度限定在300～700 bp范圍內(nèi)以及PCR產(chǎn)物序列盡可能靠近目的基因序列的3'端的要求,引物的設(shè)計(jì)盡可能滿足以下幾個(gè)條件:引物最適宜長(zhǎng)度為20～22 bp;最適宜退火溫度為60～62℃;G+ C含量最好大于50%.根據(jù)上述要求,試驗(yàn)中采用Primer Premier 5.0軟件對(duì)目的基因的PCR引物進(jìn)行了設(shè)計(jì),然后由上海生工生物技術(shù)有限公司合成,引物序列如表1所示.

表1 半定量PCR所用引物的序列Tab.1 Primers used in sem i RT-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體SCC98-D的表型分析

通過(guò)篩選突變體庫(kù)得到抑制cry1cry2表型的顯性突變體(SCCD).本實(shí)驗(yàn)以突變體SCC98-D為研究對(duì)象,通過(guò)對(duì)其表型觀察,發(fā)現(xiàn)在藍(lán)光培養(yǎng)條件下該突變體與野生型相比,具有下胚軸變短(見(jiàn)圖2)并且長(zhǎng)日照條件下成花時(shí)間提前(見(jiàn)圖3),花器官數(shù)目增加的表型(見(jiàn)圖4).

為對(duì)突變體SCC98-D的表型變化進(jìn)行定量分析,實(shí)驗(yàn)選取培養(yǎng)7 d的SCC98-D,WT和cry1cry2為材料,研究了不同光質(zhì)光以及同一光質(zhì)的不同光照強(qiáng)度下突變體SCC98-D下胚軸長(zhǎng)度的變化,結(jié)果如圖2所示:在白光或者藍(lán)光下突變體SCC98-D的下胚軸比母本cry1cry2的要短,很好地抑制其遺傳表型,恢復(fù)到野生型Col-4的表型,但是暗培養(yǎng)和紅光培養(yǎng)條件下三者之間則無(wú)差異.

觀察上述材料在長(zhǎng)日照條件下生長(zhǎng)的開(kāi)花時(shí)間,并記錄開(kāi)花時(shí)間的差異.見(jiàn)圖3,結(jié)果發(fā)現(xiàn):突變體SCC98-D在長(zhǎng)日照條件下開(kāi)花時(shí)間提前,只有19 d就抽苔,比野生型Col-4的始花時(shí)間還要提前,而在短日照條件下始花時(shí)間無(wú)差異.由此說(shuō)明,突變體SCC98-D 完全抑制了cry1cry2的開(kāi)花表型,該突變體中被激活的基因極有可能是CRY信號(hào)傳導(dǎo)途徑的下游基因.

圖2 突變體SCC98-D在不同光下的幼苗下胚軸分析Fig.2 Hypocotyl lengths of SCC98-D mutant seedlings in different lights

圖3 突變體SCC98-D在長(zhǎng)日照(LD)下早開(kāi)花Fig.3 SCC98-D mutant early flow er under LD

觀察花的發(fā)育情況,結(jié)果如圖4所示:突變體cry1cry2的花器官的發(fā)育正常,與擬南芥野生型的數(shù)目和排列方式都一致;突變體SCC98-D花器官的數(shù)目增加,排列方式也不是對(duì)生,并且每朵花花瓣數(shù)目的增加并不一致,從5到9都有,但是大多集中在5枚花瓣.這種花器官的異常發(fā)育與突變體dbb1a的花器官突變表型又存在差異,突變體SCC98-D花器官的數(shù)目只有增加,而突變體dbb1a的花器官的數(shù)目有增加也有減少.突變體SCC98-D的表型說(shuō)明,其體內(nèi)被激活的基因可能參與隱花色素介導(dǎo)的光對(duì)擬南芥下胚軸伸長(zhǎng)的抑制和光周期調(diào)控植物開(kāi)花的信號(hào)傳導(dǎo),是CRY的下游基因.

圖4 野生型(CoL-4)和突變體SCC98-D花的表型Fig.4 Flow er o f W T(Col-4)and SCC98-D

2.2 突變體SCC98-D中T-DNA插入位點(diǎn)及被激活基因的確定

為確定突變體SCC98-D的T-DNA插入位點(diǎn)位,采用TA IL-PCR方法克隆出T-DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列,圖5(a)是TAIL-PCR產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果,泳道 M 是分子 m arker;泳道 1,4,7分別為SCC91-D,SCC101-D和SCC98-D的總DNA為模板的TAIL-PCR的第1輪PCR產(chǎn)物,泳道 2,5,8分別為對(duì)應(yīng)的TAIL-PCR的第2輪PCR產(chǎn)物,泳道3,6,9分別為對(duì)應(yīng)的TAIL-PCR的第3輪PCR產(chǎn)物.由圖4(a)可見(jiàn),突變體SCC98-D為模板的TAIL-PCR的第3輪PCR產(chǎn)物有電泳條帶,只略小于其第2輪PCR產(chǎn)物.該結(jié)果說(shuō)明,擴(kuò)增得到突變體SCC98-D的T-DNA插入位點(diǎn)的側(cè)翼片段.

接著通過(guò)將克隆片段測(cè)序,并將克隆片段與擬南芥基因組序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)突變體SCC98-D中的TDNA插入位點(diǎn)位于18srRNA(18srRNA)的3'端第1 751 bp處.為進(jìn)一步驗(yàn)證T-DNA插入位點(diǎn)位,通過(guò)PSKI015載體上的特異序列與18srRNA序列設(shè)計(jì)上的引物,對(duì)各種材料的總DNA進(jìn)行PCR檢測(cè),結(jié)果如圖5(b)所示:泳道 M 是分子 marker,泳道1～3分別是以 SCC98-D,W T(Col-4)和cry1cry2的總PCR鑒定電泳,以突變體SCC98-D的DNA為模板的PCR產(chǎn)物中有1個(gè)1 000 bp左右的電泳條帶,其與目的片段大小相同;而野生型和cry1cry2中均未擴(kuò)增出目的條帶.由此進(jìn)一步證明突變體SCC98-D的T-DNA插在18srRNA的3'端第1 751 bp處,其T-DNA插入位點(diǎn)模式圖如圖6 (a)所示.

圖5 SCCD突變體插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的獲得Fig.5 Acquisition of f lanking genom ic sequence o f inserted site of SCCD mutants

為進(jìn)一步挖掘突變體SCC98-D中被激活的基因,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)RT-PCR方法分析插入位點(diǎn)相鄰的基因在野生型Col-4,cry1cry2和SCC98-D中的表達(dá)差異,確定被激活標(biāo)簽PSKI015激活的基因.但是,由于18srRNA是18srRNA,相鄰的基因非常少,大多是無(wú)功能的核酸序列,而僅有的基因也是是轉(zhuǎn)坐子基因或沒(méi)有具體功能的假基因,所以只選擇檢測(cè)A t3g3995,A t3g41979和18srRNA這3個(gè)基因.結(jié)果如圖6(b)所示:SCC98-D中T-DNA插入位點(diǎn)所在的18srRNA基因在野生型中有表達(dá),但在cry1cry2中表達(dá)量很少,而在SCC98-D中表達(dá)量很高;各突變體中A t3g3995和A t3g41979基因的表達(dá)量均無(wú)明顯差異.該結(jié)果說(shuō)明:突變體SCC98-D所具有的表型可能是由于18srRNA基因表達(dá)被激活而引起的.

圖6 突變體SCC98-D的T-DNA插入位點(diǎn)及被激活基因分析Fig.6 The T-DNA insertion location and the actived gene in the SCC98-D mutants

3 討 論

18srRNA是核糖體小亞基的組成部分,參與到植物體內(nèi)蛋白質(zhì)的翻譯.此外,生物體中的某些基因的5'端非翻譯區(qū)結(jié)合可以與18srRNA所包含的核糖體內(nèi)進(jìn)入位點(diǎn)(internal ribosome entry sites IRES)相結(jié)合,從而導(dǎo)致這些特異基因進(jìn)行不依靠帽子結(jié)構(gòu)翻譯(Cap-independent translation).這種翻譯機(jī)制可以幫助生物體在受到脅迫或緊急狀態(tài)下得到需要的蛋白[18].通過(guò)分析18srRNA基因的互補(bǔ)序列,發(fā)現(xiàn)其1 750～1 765 bp區(qū)域?yàn)楹颂求w內(nèi)進(jìn)入位點(diǎn),并且與受光誘導(dǎo)表達(dá)的鋅指蛋白DBB1a基因5'端非翻譯區(qū)中的一段序列一致.

此外,通過(guò)酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隱花色素CRY2能與真核翻譯的啟始因子eif4E相互作用(未發(fā)表實(shí)驗(yàn)結(jié)果),而eif4E在真核生物蛋白翻譯復(fù)合體中的關(guān)鍵蛋白,負(fù)責(zé)識(shí)別m RNA的帽子結(jié)構(gòu),并且在不依靠帽子結(jié)構(gòu)的蛋白翻譯過(guò)程也發(fā)揮著關(guān)鍵作用[19].因此推測(cè),突變體SCC98-D抑制cry1cry2表型的功能可能與18srRNA基因介導(dǎo)的DBB1a基因表達(dá)相關(guān).

本研究發(fā)現(xiàn)SCCD 98-1突變體能完全恢復(fù)cry1cry2的表型,且其中的18srRNA表達(dá)量上升,由此推測(cè)18srRNA可能通過(guò)參與不依靠帽子結(jié)構(gòu)的蛋白翻譯過(guò)程,調(diào)控光信號(hào)途徑蛋白的表達(dá),從而介入隱花色素介導(dǎo)的信號(hào)傳遞途徑.然而植物藍(lán)光信號(hào)傳導(dǎo)途徑非常復(fù)雜,而調(diào)控方式也極具多樣性,因此18srRNA、隱花色素、eif4E以及 DBB1a之間詳細(xì)的調(diào)控機(jī)制將有待于進(jìn)一步研究,為全面揭示藍(lán)光受體隱花色素介導(dǎo)的信號(hào)傳遞途徑提供理論基礎(chǔ).

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A Study of 18srRNA Invovled in Cryptochrome-mediated Signaling in A rabidopsis

WANG Qi-ming1,2,TU Xiao-ju1,TANG Dong-ying1,ZHAO Xiao-ying1,LIU Xuan-ming1?
(1.State Key Laboratory forChemical Biosensing and Chemometrics,Hunan Univ,Changsha,Hunan 410082,China; 2.School of Biological Science and Technology,Hunan Agricultural Univ,Changsha,Hunan 410128,China)

SCC98-D was screened from an activation-tagging mutant library in the background of blue light-recep tor cryp tochrome doub lemutant cry1cry2 in A rabidopsis,which was early flowering,short hypocotyl and excess petalnum ber,and then the phenotype of late flowering and long hypocoty l in cry1cry2 was suppressed.The flanking sequence of inserted sitewas cloned w ith TAIL-PCR.The sequenced result of flanking sequence has shown that the T-DNA w as inserted in 1751 bp of 18srRNA.A fterwards,a transcriptional analysisof the gene around inserted sitewith RT-PCR demonstrated that the activated genewas 18srRNA.This study has identified that 18srRNA is involved in Cry-mediated signaling.

arabidopsis;cryptochrome;activation-tagging mutant;18srRNA

O613.52

A

1674-2974(2010)12-0066-06 *

2010-06-21

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30770200),教育部高校博士點(diǎn)基金資助項(xiàng)目(755228001)

汪啟明(1982-),男,湖南衡陽(yáng)人,湖南大學(xué)博士,湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)講師

?通訊聯(lián)系人,E-mail:sw_x lm@hnu.cn