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      不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)男子賽艇運(yùn)動(dòng)員紅細(xì)胞內(nèi)皮型一氧化氮合酶的影響

      2010-03-03 14:30:02黃紅梅屈金亭
      中國(guó)體育科技 2010年4期
      關(guān)鍵詞:磷酸化紅細(xì)胞血漿

      黃紅梅,屈金亭,劉 濤

      內(nèi)源性一氧化氮(NO)是由左旋精氨酸(L-A rg)在一氧化氮合成酶(NOS)的作用下產(chǎn)生的,是一種化學(xué)性質(zhì)活躍的氣體自由基,亦是一種重要的生物信號(hào)分子。在心血管系統(tǒng)中,NO具有擴(kuò)張血管,抑制血小板黏附和聚集,抑制血管平滑肌細(xì)胞和淋巴細(xì)胞增殖,以及影響心臟舒縮周期和收縮力等功效[4]。大量研究表明,心血管系統(tǒng)NOSNO系統(tǒng)功能與機(jī)體運(yùn)動(dòng)形式、強(qiáng)度及持續(xù)時(shí)間密切相關(guān)[19]。NOS是調(diào)節(jié)NO合成的關(guān)鍵酶,已確認(rèn)有3種同工酶:神經(jīng)元型(nNOS)、內(nèi)皮型(eNOS)和誘導(dǎo)型(iNOS),它們分布的部位、生物效應(yīng)及調(diào)控機(jī)制各不相同。研究表明,心血管系統(tǒng)NO主要是由血管內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)皮型一氧化氮合成酶(eNOS)催化合成[17]。最近,Kleinbongard等發(fā)現(xiàn),eNOS亦存在于紅細(xì)胞漿膜,表明紅細(xì)胞也是心血管系統(tǒng)內(nèi)NO的主要來(lái)源之一[7]。本研究擬觀察不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)男子賽艇運(yùn)動(dòng)員紅細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)量/活性和磷酸化水平,以及血漿中 NO含量的變化,以探討紅細(xì)胞eNOS-NO系統(tǒng)對(duì)于運(yùn)動(dòng)刺激的應(yīng)答及可能機(jī)制。

      1 研究對(duì)象與方法

      1.1 研究對(duì)象

      專業(yè)賽艇運(yùn)動(dòng)員10名(一級(jí)和健將級(jí)),年齡21.6± 1.9歲,身高1.89±0.05 m,體重80.5±7.9 kg,訓(xùn)練年限5.8±1.9年。所有參加實(shí)驗(yàn)的運(yùn)動(dòng)員均身體健康,無(wú)器質(zhì)性疾病,實(shí)驗(yàn)前48 h內(nèi)受試者均未進(jìn)行過(guò)劇烈運(yùn)動(dòng)。

      1.2 測(cè)試方案

      受試者于清晨(6:30~7:30)靜臥15 min,空腹,肘靜脈采血5mL。然后進(jìn)行劃船測(cè)功儀(CONCEPTⅡ,美國(guó))遞增負(fù)荷測(cè)試來(lái)測(cè)定受試者的 ˙VO2max,測(cè)試前以16槳/ min負(fù)荷做5min準(zhǔn)備活動(dòng),準(zhǔn)備活動(dòng)后休息5min并佩戴好呼吸面罩,起始負(fù)荷為20槳/min,每3 min增加2槳,直至力竭。用運(yùn)動(dòng)心肺測(cè)試系統(tǒng)(Cortex MetaLyzerⅡ,德國(guó))測(cè)定耗氧量(˙VO2)、CO2呼出量(VCO2)、呼吸交換律(RER =VCO 2/˙VO2)、每分通氣量(VE)等,用遙測(cè)心率表(Polar A 3,芬蘭)記錄心率。受試者休息1周后,進(jìn)行1次60% ˙VO2max強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)(劃船測(cè)功儀),時(shí)間為20min,運(yùn)動(dòng)結(jié)束后即刻肘靜脈采血5 mL;休息2天后,進(jìn)行1次75% ˙VO2max強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng),再休息2天,進(jìn)行1次90%˙VO2max強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng),其運(yùn)動(dòng)方式、運(yùn)動(dòng)時(shí)間以及取血量與第1次相同。

      1.3 紅細(xì)胞的制備

      所有血液樣品均加入38 g/L枸櫞酸鈉(體積比1∶9)抗凝,1 400 g離心10 min,去上清。加入4倍體積 Hank’s平衡鹽溶液(M HBSS)中反復(fù)離心3遍,清洗后取紅細(xì)胞懸浮于等體積 Hank’s平衡鹽溶液中待測(cè)。

      1.4 紅細(xì)胞eNOS活性及血漿NO-2/NO-3含量測(cè)定

      依照試劑盒(南京建成生物公司)說(shuō)明,紫外分光光度計(jì)測(cè)量紅細(xì)胞 eNOS活性,自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血漿NO-2/NO-3含量。

      1.5 紅細(xì)胞eNOS蛋白總量及eNOS磷酸化水平測(cè)定

      制備紅細(xì)胞組織勻漿,考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白含量。蛋白樣品經(jīng)15%SDS-PAGE分離轉(zhuǎn)移于PVDF膜。一抗(Santacruz公司)孵育過(guò)夜,HRP標(biāo)記二抗(TBD公司)孵育1 h,ECL顯影。采用凝膠系統(tǒng)分析軟件(上海天能科技公司),掃描各條帶灰度值,以安靜狀態(tài)為100%,其他3組與安靜時(shí)比值,即其相對(duì)表達(dá)量(%)。Actin作為內(nèi)參蛋白。

      1.6 統(tǒng)計(jì)方法

      所有數(shù)據(jù)均用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理,結(jié)果用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,各組比較采用單因素方差分析,P <0.05為顯著性水平,P<0.01為非常顯著水平。

      2 研究結(jié)果

      2.1 不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)血漿NO-2/NO-3含量的影響

      圖1顯示,與安靜狀態(tài)比較,運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度為60%和75% ˙VO2max時(shí),血漿 NO-2/NO-3含量顯著升高(均為 P< 0.05),運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度為90%˙VO2max時(shí),血漿NO-2/NO-3含量顯著降低(P<0.05)。

      2.2 不同負(fù)荷運(yùn)動(dòng)對(duì)紅細(xì)胞eNOS活性的影響

      圖2顯示,與安靜狀態(tài)比較,運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度為60%和75% ˙VO2max時(shí),紅細(xì)胞eNOS活性顯著升高(分別為 P<0.05和 P<0.01)。運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度為90%˙VO2max時(shí),紅細(xì)胞eNOS活性顯著降低(P<0.01)。

      圖1 不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)血漿NO2-/NO3-含量的影響示意圖

      圖2 不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)紅細(xì)胞eNOS活性的影響示意圖

      2.3 不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)紅細(xì)胞eNOS蛋白總量及eNOS磷酸化水平

      圖3顯示,與安靜狀態(tài)比較,運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度為60%和75% ˙VO2max時(shí),紅細(xì)胞eNOS蛋白總量和 Thr495磷酸化eNOS蛋白量無(wú)明顯變化,Ser1177磷酸化eNOS蛋白量顯著升高(分別為 P<0.05和 P<0.01)。運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度為90% ˙VO2max時(shí),紅細(xì)胞eNOS蛋白總量和Ser1177磷酸化eNOS蛋白量顯著降低(均為 P<0.05),Thr495磷酸化eNOS蛋白量無(wú)明顯變化。

      圖3 不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)紅細(xì)胞eNOS蛋白總量及eNOS磷酸化水平的影響示意圖

      3 討論

      NO作為重要的信號(hào)分子,與運(yùn)動(dòng)關(guān)系十分密切。研究表明,運(yùn)動(dòng)過(guò)程中,血液中一定水平的NO可通過(guò)環(huán)鳥(niǎo)苷酸通路提高心肌和骨骼肌收縮力;可增加運(yùn)動(dòng)中組織氧攝入量和氧消耗量;可通過(guò)舒張血管調(diào)節(jié)運(yùn)動(dòng)中機(jī)體各器官血液重新分布;也可通過(guò)刺激 GLU-4轉(zhuǎn)位促進(jìn)組織葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等[10]。此外,NO還可通過(guò)調(diào)控紅細(xì)胞變形性影響運(yùn)動(dòng)中紅細(xì)胞的功能[8]。Sun等報(bào)道,大鼠運(yùn)動(dòng)前服用一定劑量L-A rg,可改善機(jī)體的運(yùn)動(dòng)能力,明顯延長(zhǎng)遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)的力竭時(shí)間,推遲疲勞發(fā)生[14]。而注射了NOS抑制劑N-硝基左旋精氨酸(L-NAM E)的人骨骼肌最大收縮速度及輸出功率明顯降低[6]。這表明,運(yùn)動(dòng)中維持一定水平的NO可正性調(diào)控機(jī)體運(yùn)動(dòng)能力。目前的研究主要關(guān)注于運(yùn)動(dòng)刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞以及骨骼肌產(chǎn)生NO的影響,最近發(fā)現(xiàn),紅細(xì)胞亦是心血管系統(tǒng)中NO的主要來(lái)源,這與定位于紅細(xì)胞漿膜的eNOS密切相關(guān)[7]。研究表明,不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)紅細(xì)胞膜流動(dòng)性及脂質(zhì)組成的作用效應(yīng)不同[16]。因而,不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度對(duì)紅細(xì)胞eNOS功能及NO產(chǎn)生也會(huì)產(chǎn)生差異性作用,從而影響心血管系統(tǒng)中NO的穩(wěn)態(tài)及生物效應(yīng)。

      本研究中,在運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度為60%和75%˙VO2max時(shí),紅細(xì)胞eNOS活性顯著升高,且隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的增加而增加,而eNOS總蛋白表達(dá)量無(wú)明顯變化。當(dāng)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度增加為90%˙VO2max時(shí),紅細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)量及活性均明顯降低,甚至低于運(yùn)動(dòng)前安靜狀態(tài)時(shí)的水平。血漿NO含量的變化趨勢(shì)與紅細(xì)胞eNOS基本一致,提示運(yùn)動(dòng)過(guò)程中,紅細(xì)胞產(chǎn)生的NO是血漿NO總量的重要組成部分。Rassaf等發(fā)現(xiàn),前臂分別進(jìn)行20%、30%和40%的最大握力強(qiáng)度運(yùn)動(dòng),前臂靜脈血漿中NO和血流量與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度呈正向的線性關(guān)系;而當(dāng)強(qiáng)度增加至50%和60%時(shí),上述指標(biāo)與運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度呈負(fù)相關(guān)線性關(guān)系[12]。Copp等報(bào)道,短期急性跑臺(tái)訓(xùn)練可使大鼠后肢血管內(nèi)皮細(xì)胞eNOS活性及血漿NO含量急劇增加,而力竭運(yùn)動(dòng)使上述指標(biāo)顯著降低,運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)24 h仍然低于安靜對(duì)照組[2]。我們認(rèn)為,低強(qiáng)度和中等強(qiáng)度負(fù)荷運(yùn)動(dòng)可刺激紅細(xì)胞等組織中eNOS表達(dá)量及活性升高,舒張血管,增加血流量,以代償運(yùn)動(dòng)造成的組織血液供應(yīng)相對(duì)不足;而當(dāng)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度進(jìn)一步增加時(shí),eNOS-NO生物效應(yīng)反而受到抑制,這可能與運(yùn)動(dòng)疲勞的形成相關(guān)。

      運(yùn)動(dòng)可使血流加速,產(chǎn)生搏動(dòng)性血流并增加血管內(nèi)血流切應(yīng)力,且血流切應(yīng)力隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的增加而增加。研究證實(shí),血流切應(yīng)力是運(yùn)動(dòng)促血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放NO的主要生理刺激。Fischer等在體外循環(huán)中發(fā)現(xiàn),高血流切應(yīng)力亦可顯著激活紅細(xì)胞中eNOS[3]。最近,Suhr等的研究表明,短暫的高血流切應(yīng)力可增加紅細(xì)胞eNOS的活性,而高頻反復(fù)的高血流切應(yīng)力反而會(huì)抑制 eNOS的活化[13]。Temiz等發(fā)現(xiàn),在低水平血流切應(yīng)力下,紅細(xì)胞膜呈彈性固態(tài),而在高水平切應(yīng)力下,紅細(xì)胞膜呈液態(tài)[15]。因而,不同運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度可能通過(guò)影響改變血流切應(yīng)力影響紅細(xì)胞膜狀態(tài),從而動(dòng)態(tài)調(diào)控位于紅細(xì)胞漿膜eNOS的穩(wěn)定性及活性。此外,Petibois等發(fā)現(xiàn),大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可加速紅細(xì)胞膜蛋白質(zhì)的脫失與降解[11],這可能與90%˙VO2max強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)造成的eNOS表達(dá)量快速減少有關(guān)。

      除了蛋白表達(dá)量的變化,特定氨基酸的磷酸化也決定了eNOS的活性。eNOS主要有 3個(gè)磷酸化位點(diǎn):Ser116、Thr495和 Ser1177,其中,Ser1177磷酸化使eNOS活性增強(qiáng),而Ser116和 Thr495磷酸化則使eNOS活性減弱。本研究中,我們發(fā)現(xiàn),60%和 75%˙VO2max的運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度可使 eNOS (Ser1177)磷酸化水平增加,且隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度增加而增加。而在運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度為90%˙VO2max時(shí),eNOS(Ser1177)磷酸化水平降低,eNOS(Thr495)磷酸化水平在各種運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度中均維持于運(yùn)動(dòng)前安靜狀態(tài)水平。研究表明,血管中的血流切應(yīng)力可以激活紅細(xì)胞中磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)-絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)信號(hào)通路,從而上調(diào)紅細(xì)胞eNOS Ser1177磷酸化水平和NO產(chǎn)量[5]。因而我們推測(cè),低強(qiáng)度和中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)可能通過(guò)PI3 K-Akt通路上調(diào)eNOS Ser1177磷酸化水平,從而增加其活性和NO產(chǎn)量。而大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)導(dǎo)致的eNOS Ser1177磷酸化水平降低可能與紅細(xì)胞eNOS蛋白總量減少有關(guān),或有其他的抑制機(jī)制發(fā)生,其具體調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

      4 結(jié)論

      1.當(dāng)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度適量時(shí),紅細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)、活化磷酸化水平以及NO產(chǎn)生隨著運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度增加而增加,可能是機(jī)體對(duì)運(yùn)動(dòng)應(yīng)激的一種適應(yīng)機(jī)制。

      2.當(dāng)運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度過(guò)大時(shí),紅細(xì)胞eNOS蛋白表達(dá)、活化磷酸化水平以及NO產(chǎn)生受到抑制,可能與運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生相關(guān)。

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