洗胚對(duì)小鼠胚胎質(zhì)量影響初探

周懂杰 蘇賀靖 張杰 陳森 陳韻穎 齊安龍 張熙浩 鄭小敏

(天津醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 天津 300270)

洗胚對(duì)小鼠胚胎質(zhì)量影響初探

周懂杰 蘇賀靖 張杰 陳森 陳韻穎 齊安龍 張熙浩 鄭小敏

(天津醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 天津 300270)

本實(shí)驗(yàn)探討了胚胎移植過(guò)程中洗胚對(duì)胚胎質(zhì)量的影響。實(shí)驗(yàn)對(duì)象是KM鼠,對(duì)實(shí)驗(yàn)(不洗胚)組和對(duì)照(洗胚)組進(jìn)行比較,結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組受體鼠產(chǎn)仔率為30.3%,對(duì)照組受體鼠產(chǎn)仔率為23.0%,實(shí)驗(yàn)組明顯高于對(duì)照組,卡方檢驗(yàn)P＜0.05,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從而得出移植過(guò)程中的洗胚對(duì)胚胎質(zhì)量有一定影響的結(jié)論。

小鼠 胚胎移植 細(xì)胞胚胎 洗胚 成活率

小鼠作為一種最廣泛的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,其胚胎移植技術(shù)對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)和生命科學(xué)具有重要意義。自20世紀(jì)50年代受精卵和早期胚胎的采集技術(shù)建立以來(lái),人類對(duì)小鼠進(jìn)行發(fā)育生物學(xué)研究,包括胚胎基因突變研究,轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的研究,基因打靶技術(shù)的研究等均需要胚胎移植技術(shù)。而其移植的成功率往往受多方面影響,例如胚胎的培養(yǎng)液成分、培養(yǎng)的氣體比例與溫度、胚胎發(fā)育階段、移植方式等。筆者認(rèn)為移植過(guò)程中的物理操作可影響胚胎質(zhì)量,從而影響胚胎成活率,而之前少有文獻(xiàn)報(bào)道,鑒于此,本文探討了傳統(tǒng)方法的胚胎移植中洗胚對(duì)胚胎質(zhì)量的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

封閉群KM小鼠,清潔級(jí),毛色光澤,無(wú)形態(tài)行為異常。飼養(yǎng)溫度（22±2）℃，濕度50%～60%。飲水充足,日糧全面,飼喂專門的小鼠飼料,4～5d更換墊料以保持清潔。雌雄鼠體重分別在25.3g, (27.6±1.8)g。雌鼠50日齡以上100只,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各隨機(jī)取其中15只,相同條件飼養(yǎng),剩余鼠做供體鼠處理。雄鼠60日齡以上50只,其中15只預(yù)備結(jié)扎。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

無(wú)菌手術(shù)器械(包括眼科剪、眼科鑷、玻璃分針、針線、生理鹽水等)孕馬血清促性腺激素(PMSG):由天津市華孚高新技術(shù)公司提供。人絨毛膜促性腺激素(HCG):由上海第一生化藥業(yè)公司提供。透明質(zhì)酸酶、M2培養(yǎng)液、M16培養(yǎng)液、優(yōu)質(zhì)石蠟油:sigma公司。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱:上海博迅實(shí)業(yè)公司提供。體視解剖鏡、培養(yǎng)皿。

自制胚胎移植管:筆者為了減少由于系統(tǒng)誤差而引起的對(duì)胚胎的物理?yè)p傷,利用千分尺、鐵架臺(tái)及毛細(xì)吸管等裝置自制了精密胚胎移植管。方法如下:取一毛細(xì)吸管清洗后在洗液中浸泡過(guò)夜,再洗凈烘干,利用酒精噴燈拉制吸管,細(xì)端長(zhǎng)約10～15cm內(nèi)徑120～180μm,細(xì)端瞬間在火焰上燒成圓口。

1.3 假孕受體準(zhǔn)備

首先對(duì)15只KM雄鼠進(jìn)行輸精管結(jié)扎,以便制備受體鼠:腹腔注射麻醉后,鋪一治療巾于蠟盤上,四角訂好蛙丁,小鼠仰面躺上,張開四肢,用皮筋將四肢和蛙丁固定(或用透明有機(jī)玻璃固定)。75%酒精擦拭后采用腹部橫切口,暴露視野。輸精管前后結(jié)扎,然后中間剪斷。術(shù)后滴入適量青霉素和鏈霉素,縫合體壁和皮膚。碘伏擦拭后包扎并標(biāo)號(hào)放入鼠盒精心飼養(yǎng),注意保溫。

假孕受體鼠制備:胚胎移植前1d,將結(jié)扎鼠和雄鼠以2∶1的比例合籠,次日早上有陰栓者作為受體鼠待用。

1.3 供體準(zhǔn)備

超數(shù)排卵[2]:中午12點(diǎn)注射PMSG,50IU/mL的比例每只鼠注射0.1mL。47h后的11～12點(diǎn)間注射HCG,每只鼠注射50 IU/mL, 0.1mL。

表1 table 1 將細(xì)胞期胚胎移入假孕0.5d的變體鼠內(nèi)的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)總結(jié)

在注射HCG后當(dāng)晚,將供體鼠和雄鼠以2∶1的比例合籠,次日早上有陰栓的待用。

1.4 方法

本文采用輸卵管壁移植。供體鼠和受體鼠的制備在同晚進(jìn)行,于次日晚7點(diǎn)進(jìn)行胚胎移植。

1.5 胚胎采集

1.5.1 對(duì)照組用傳統(tǒng)方法 將小鼠處死,75%酒精擦拭,開腹找到子宮,去除其他組織。取其輸卵管,移入M2培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中,解剖鏡下撕開輸卵管壺腹部找到胚胎,然后用吸管將卵移入1mg/mL的透明質(zhì)酸酶的培養(yǎng)液中,溶去卵丘細(xì)胞。解剖鏡下觀察當(dāng)卵丘細(xì)胞散開時(shí)即把受精卵移入不含透明質(zhì)酸酶的新鮮培養(yǎng)液中,吹洗胚胎8～10次,吸取放入M16培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。37℃50mL/L二氧化碳培養(yǎng)箱中短暫培養(yǎng)。

1.5.2 實(shí)驗(yàn)組采用改進(jìn)的方法 取出輸卵管后直接移入透明質(zhì)酸酶的M2培養(yǎng)液中,撕開壺腹部見卵溢出,待其顆粒細(xì)胞消解時(shí),吸取上清液,注入M2培養(yǎng)液后再吸取上清液,反復(fù)稀釋后,小心地將其移入M16培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中。37℃50mL/L二氧化碳培養(yǎng)箱中短暫培養(yǎng)。

1.6 胚胎的吸取

植入之前將M16中培養(yǎng)的胚胎移入M2培養(yǎng)液中在轉(zhuǎn)移管中。裝入石蠟油到肩部,先在轉(zhuǎn)移管中一次吸入氣柱,少量M2培養(yǎng)液,氣柱,然后將胚胎吸入,每次吸入20枚,之后吸入少量培養(yǎng)液后再吸入一段氣柱。小心放置待用。

1.7 胚胎移植

麻醉受體鼠,背部朝上固定,75%酒精擦拭后作最后一肋中央縱切口。左右滑動(dòng)皮膚,小心剪破體壁,用眼科鑷夾住脂肪墊帶出子宮,血管夾夾住脂肪墊。顯微鏡下在輸卵管傘端至壺腹部1/3無(wú)血管或少血管處刺破囊膜,再將裝胚胎移植管插入輸卵管內(nèi),當(dāng)?shù)?個(gè)氣柱進(jìn)入后鏡下仔細(xì)檢查有無(wú)漏導(dǎo)入胚胎。松開止血夾,將脂肪墊,卵巢,子宮一并送回體內(nèi),左右兩側(cè)各導(dǎo)入完后滴入適量青霉素和鏈霉素,縫合體壁和皮膚。碘伏擦拭傷口后包扎。術(shù)后單獨(dú)飼養(yǎng)。根據(jù)胎齡推測(cè)預(yù)產(chǎn)時(shí)間。

2 結(jié)果

本文采用將1細(xì)胞期胚胎移入假孕0.5d的受體鼠內(nèi)。將實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)列表表示(表1)。

用χ2檢驗(yàn),代入專用公式得χ2=5.68,P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

資料顯示小鼠受精卵在體外培養(yǎng)時(shí)常常不容易度過(guò)2細(xì)胞階段,表現(xiàn)為“雙細(xì)胞限制”,本文使用1細(xì)胞時(shí)期的胚胎移植來(lái)探討洗胚對(duì)其的質(zhì)量影響,避免了這個(gè)問(wèn)題。

在1細(xì)胞期的小鼠胚胎移植過(guò)程中去顆粒細(xì)胞是必經(jīng)的一步,一般用透明質(zhì)酸酶來(lái)消化顆粒細(xì)胞,而透明質(zhì)酸酶也會(huì)對(duì)小鼠胚胎造成損傷,故傳統(tǒng)的方法是在消化完顆粒細(xì)胞后再用洗卵針對(duì)其吹洗8～10次,以消除其對(duì)胚胎的化學(xué)損傷。

由表1的數(shù)據(jù)可以看出經(jīng)過(guò)胚胎移植管沖洗胚胎的對(duì)照組的胚胎移植成功率23.0%明顯低于沒(méi)有經(jīng)過(guò)沖洗的實(shí)驗(yàn)組30.3%。原因在于小鼠早期胚胎很小,易損傷,直徑約100μm。它由透明層包圍,透明層對(duì)其有保護(hù)作用。洗胚過(guò)程中的吹洗胚胎會(huì)對(duì)其外的透明層產(chǎn)生一定的物理沖擊,這種沖擊有一定的概率對(duì)透明層造成損傷,并最后影響其成活。胚胎移植是將早期胚胎從供體鼠的生殖道內(nèi)取出,然后植入受體鼠的相應(yīng)生殖道內(nèi)。在胚胎采集的過(guò)程中,多次轉(zhuǎn)移胚胎,用透明質(zhì)酸酶消化顆粒細(xì)胞后用培養(yǎng)液沖洗胚胎,雖然轉(zhuǎn)移管口已平滑,但是這個(gè)過(guò)程中不可避免地使胚胎受到物理?yè)p傷。這種損傷就有可能影響其分裂并最終影響胚胎的存活。

由于細(xì)胞體外條件還難以達(dá)到與體內(nèi)相同的理想狀態(tài),胚胎的體外發(fā)育與體內(nèi)發(fā)育相比結(jié)果則存在明顯的不同。胚胎移植的成功率受到多方面因素的影響,如小鼠本身的品系問(wèn)題、移植階段不同、移植方式不同以及胚胎取出后的環(huán)境影響等。在這里筆者不做深入探討。

此外,本實(shí)驗(yàn)的產(chǎn)仔率偏低于一些文獻(xiàn)報(bào)道資料,可能與小鼠來(lái)源和其它移植設(shè)備因素有關(guān)。

[1]金巖.小鼠發(fā)育生物學(xué)與胚胎實(shí)驗(yàn)方法[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2005.

[2]孫敬方.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2001.

[3]吳紅,朱孝榮.影響小鼠1細(xì)胞期胚胎移植成功率有關(guān)因素的探討[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理,2002,19(1):49～50.

[4]滕勇.3種胚胎移植技術(shù)方法比較[J].生物技術(shù),2003,13(6): 33～35.

[5]RM Hearms-Stokes,BT M iller,L Scott,do2.Pregnancy rates after embryo transfer depend On the provider at embryo transfer [J]. Fertil Steril,2000,74(1):80～86.

[6]張慶玲,賀莉.小鼠品系影響胚胎移植成功率的比較研究[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,9(14).

[7]董婉維,時(shí)偉紅,李華.615小鼠胚胎移植初探[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)雜志,2002,12(5):263～265.

[8]劉恩岐,楊鵬輝,尚榮軍.小鼠胚胎的收集培養(yǎng)和移植[J].中國(guó)獸醫(yī)科技,2002,32(11):44～45.

[9]王敬康.張?zhí)?劉冀班,等.一種改良的胚胎噯管[J].動(dòng)物學(xué)雜志,1999,34(6):34～35.

[10]管彤,王風(fēng)山,王靜,等.小鼠胚胎移植技術(shù)方法比較[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)與管理,2001,18(1):29～31.

[11]李文清,劉全軍,趙衛(wèi)東,等.培養(yǎng)用液對(duì)小鼠胚胎移植效果的影響[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2006,4：383.

[12]劉建新,羅麗蘭.體外無(wú)血清小鼠胚胎種植模型的建立[J].中華婦產(chǎn)科雜志,2000，35（7）：417～419.

Ef fects of Embryo Washing on Embryo Qual ity in Mice

This study explored the ef fects of embryo washing on embryo quality in the embryo transfer process.The experimental subject was KM mice.Compared to experimental(Non- embryo washing) group and control(embryo washing) group,the resul t showed that the total birth rate of the experimental group was 30.3%,and the total birth rate of control group was 23.0%,which was lower than the experimental group's.Chi-square test showedP＜0.05,the dif ference was statistical ly significant.Then we draw a conclusion that the embryo washing in the transfer process af fects embryo quality in a degree.

Mice;Embryo transfer;Lcel l embryos;Wash embryos;Success rate

R11

A

1674-0742(2010)06(c)-0030-02

2010-03-15