大鼠子宮內(nèi)膜異位癥CD44的異常表達(dá)及意義

金海燕，周龍書

（廣州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院，廣州 510260）

具有活性的子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮內(nèi)膜以外部位時(shí)稱為子宮內(nèi)膜異位癥（Endometriosis,EMT），簡(jiǎn)稱內(nèi)異癥。根據(jù)子宮內(nèi)膜種植學(xué)說(shuō)，經(jīng)血中所含的子宮內(nèi)膜碎片可隨經(jīng)血倒流，經(jīng)輸卵管進(jìn)入腹腔，種植于卵巢和臨近的盆腔腹膜，以致形成EMT[1]。腹膜表面覆蓋著一層間皮細(xì)胞，可以分泌大量透明質(zhì)酸乃至在間皮細(xì)胞周圍形成一層包被，CD44正是透明質(zhì)酸的受體，與細(xì)胞外基質(zhì)中的透明質(zhì)酸結(jié)合，參與子宮內(nèi)膜細(xì)胞與腹膜之間的特異性黏附[2]。因此，本研究建立大鼠EMT模型，比較黏附分子CD44在EMT大鼠在位、異位內(nèi)膜及正常子宮內(nèi)膜中的表達(dá)，以探討CD44在EMT發(fā)病中的作用和意義。

1 材料與方法

1.1 大鼠EMT模型的建立

健康雌性SD大鼠，體重200～240 g。經(jīng)陰道涂片檢查，在動(dòng)情期建模。以2%戊巴比妥鈉（40 mg·kg－1）腹腔麻醉。在尿道上端約 1 cm 處，沿腹部中線切開皮膚約3 cm，切下左側(cè)子宮角長(zhǎng)約1.5 cm，并行端端吻合術(shù)。在洛氏營(yíng)養(yǎng)液中，將切下的子宮角縱向剖開，并將其內(nèi)膜與肌層分離，切取5 mm×5 mm的內(nèi)膜片段，令其表面上皮與腹壁相對(duì)，用無(wú)損傷6-0縫線將其四角縫于腹腔右側(cè)腹壁上?？p合切口，常規(guī)飼養(yǎng)。對(duì)照組（假手術(shù)組）術(shù)程同建模組，只是不予縫合內(nèi)膜片段于腹壁。

1.2 試驗(yàn)分組

建模組：建模后第4周，選擇動(dòng)情期，將建模成功的10只大鼠，摘出在位及異位子宮內(nèi)膜組織。對(duì)照組（假手術(shù)組）：5只大鼠，于假手術(shù)后第4周，選擇大鼠動(dòng)情期，摘出子宮內(nèi)膜組織。

1.3 免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)EMT組在位、異位內(nèi)膜及對(duì)照組子宮內(nèi)膜CD44的表達(dá)

標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋、切片，經(jīng)微波爐抗原修復(fù)20 min后用鏈霉菌抗生物素蛋白－過(guò)氧化酶（S-P）法進(jìn)行染色。采用DAB同步浸染顯色法使所有切片顯色時(shí)間相同[3]。試驗(yàn)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照。小鼠抗大鼠CD44（購(gòu)自深圳先進(jìn)技術(shù)工業(yè)有限公司）；S-P免疫組化通用試劑盒（購(gòu)自Maxin Biotech公司），均為即用型。

1.4 圖像分析

用陽(yáng)性單位（Positive unit，PU）定量表達(dá)免疫組化陽(yáng)性反應(yīng)程度。將排除了切片本底因素后的純免疫組化反應(yīng)程度按灰度圖像分為0～100個(gè)等級(jí)，每一個(gè)等級(jí)定義為1個(gè)PU。PU值大小與陽(yáng)性反應(yīng)程度成正比。在Leica Q550 IW圖像分析系統(tǒng)上測(cè)試大鼠在位和異位子宮內(nèi)膜腺上皮的灰度值Gα和背景的灰度值Gβ，按公式PU=[（Gα-Gβ）/Gmax]×100計(jì)算PU值。Gmax為檢測(cè)儀器的最大灰度，等于256。每張染色片隨機(jī)測(cè)試10個(gè)視場(chǎng)，相加后除以10，所得數(shù)值為該切片的陽(yáng)性單位[4]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均用±S表示，EMT大鼠在位子宮內(nèi)膜、異位內(nèi)膜和對(duì)照組子宮內(nèi)膜腺上皮之間的比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠EMT模型的形態(tài)學(xué)

大鼠EMT模型建模后第4周開腹，見移植的異位子宮內(nèi)膜體積明顯增大，生長(zhǎng)良好，形成內(nèi)有液體積聚表面有血管攀生的透明小囊泡，移植物組織學(xué)檢查可見子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞、腺體及間質(zhì)細(xì)胞，證明建模成功。對(duì)照組大鼠假手術(shù)后第4周，未見移植物生長(zhǎng)。

2.2 大鼠EMT模型異位內(nèi)膜的超微結(jié)構(gòu)

大鼠EMT模型異位的腺上皮很少見腺腔形成。分泌細(xì)胞游離面有短小稀疏的微絨毛，可見分泌細(xì)胞的微絨毛大片脫落（見圖1）。纖毛細(xì)胞表面的纖毛短小、少見（見圖2）。上皮細(xì)胞間隙囊狀擴(kuò)大，胞漿內(nèi)線粒體體積增大，擴(kuò)張呈球形，中央可見透亮無(wú)嵴區(qū)；還有少量粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、豐富的游離核糖體和高爾基體。細(xì)胞核位于細(xì)胞中部，核周腔擴(kuò)大；核膜不規(guī)則；核染色淡，染色質(zhì)分散，核仁明顯。異位內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞可見凋亡現(xiàn)象，基底膜彎曲，間質(zhì)細(xì)胞體積大，核染色稍淡。

圖1 大鼠EMT模型異位的腺上皮分泌細(xì)胞的微絨毛大片脫落（×6890）Fig.1 In ectopic glandular epithelium in rat model with endometriosis,the microvilli on the free surface of secretory cells had shed(Original magnification:×6890)

圖2 大鼠EMT模型異位的腺上皮纖毛細(xì)胞表面的纖毛短?。ā?200）Fig.2 In ectopic glandular epithelium in rat model with endometriosis,the cilia of ciliated cells were short（Original magnification:×5200）

2.3 大鼠EMT模型組在位、異位內(nèi)膜與對(duì)照組子宮內(nèi)膜CD44的表達(dá)模式

CD44在大鼠子宮內(nèi)膜的腺上皮細(xì)胞、腔面上皮細(xì)胞表達(dá)。CD44陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞膜被染成棕黃色，胞漿內(nèi)雖也有CD44表達(dá)，但著色比胞膜淺，一些腺體的腺腔內(nèi)也充滿了CD44陽(yáng)性顆粒。大鼠EMT模型組在位、異位內(nèi)膜與對(duì)照組子宮內(nèi)膜CD44的表達(dá)模式見表1。

表1 大鼠EMT模型子宮內(nèi)膜腺上皮CD44的表達(dá)Table 1 CD44 expression in control eutopic and ectopic endometrium from rats with endometriosis (±S)

表1 大鼠EMT模型子宮內(nèi)膜腺上皮CD44的表達(dá)Table 1 CD44 expression in control eutopic and ectopic endometrium from rats with endometriosis (±S)

注：組間比較，數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同大寫字母表示差異極顯著（P＜0.01）；不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）；字母相同且大小寫也相同表示差異不顯著（P＞0.05）。Note:To compare between the groups,values with different capital letters mean extremely significant difference(P＜0.01).Values with different small letters mean significant difference(P＜0.05).The same letters mean no significant difference(P＞0.05).

組別Group n CD44 對(duì)照組大鼠子宮內(nèi)膜Endometrium from control rats 1 5 6.97±2.13Aa大鼠EMT模型組在位內(nèi)膜Eutopic endometrium from rats with endometriosis 2 10 7.20±1.68Aa大鼠EMT模型組異位內(nèi)膜Ectopic endometrium from rats with endometriosis 3 10 19.34±2.35Bb

由表1可以看出，大鼠EMT模型組在位內(nèi)膜腺上皮CD44的表達(dá)（見圖3）與對(duì)照組子宮內(nèi)膜（見圖4）無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

圖3 大鼠EMT模型組在位內(nèi)膜CD44的表達(dá)（×400）Fig.3 Expression of CD44 in eutopic endometrium from rats with endometriosis(S-P×400)

圖4 對(duì)照組大鼠子宮內(nèi)膜CD44的表達(dá)（×400）Fig.4 Expression of CD44 in endometrium from control rats(S-P×400)

EMT模型組大鼠異位內(nèi)膜腺上皮CD44的表達(dá)（見圖5）高于對(duì)照組子宮內(nèi)膜，差異極顯著（P＜0.01）。EMT模型組大鼠異位內(nèi)膜腺上皮CD44的表達(dá)高于同組的在位內(nèi)膜，差異極顯著（P＜0.01）。其中對(duì)照組大鼠子宮內(nèi)膜CD44的PU平均值為6.97，大鼠EMT模型組在位內(nèi)膜CD44的PU平均值為7.20，而大鼠EMT模型組異位內(nèi)膜CD44的PU平均值為19.34。

圖5 大鼠EMT模型組異位內(nèi)膜CD44的表達(dá)（×400）Fig.5 Expression of CD44 in ectopic endometrium from rats with endometriosis(S-P×400)

3 討 論

正常生理狀態(tài)下，子宮內(nèi)膜生長(zhǎng)于子宮腔內(nèi)壁，受卵巢激素調(diào)控，每月隨月經(jīng)來(lái)潮而剝脫后排出體外。當(dāng)子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮體以外部位時(shí)，稱為EMT。EMT雖然是一種良性疾病，但生物學(xué)行為卻如同惡性腫瘤，具有浸潤(rùn)破壞性和復(fù)發(fā)性等，使之成為難以治愈、危害頗大生殖系統(tǒng)疾病之一。居于子宮腔內(nèi)的子宮內(nèi)膜如何遷徙到機(jī)體的其他部位形成EMT，確切病因及發(fā)病機(jī)制至今尚不明確，且病程呈進(jìn)行性加重，長(zhǎng)期以來(lái)令人困惑。根據(jù)子宮內(nèi)膜種植學(xué)說(shuō)，逆流經(jīng)血中的子宮內(nèi)膜與腹膜接觸并種植在其表面是形成EMT的主要途徑。

CD44是一種細(xì)胞表面跨膜糖蛋白，通過(guò)細(xì)胞膜外受體與相應(yīng)配體如透明質(zhì)酸、膠原蛋白、纖粘蛋白、層粘蛋白等基質(zhì)分子結(jié)合后，參與細(xì)胞－細(xì)胞、細(xì)胞－基質(zhì)之間的特異性粘連，并與細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合，參與細(xì)胞偽足形成，與細(xì)胞的遷移運(yùn)動(dòng)有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜在盆腹腔突破腹膜及器官“防線”，在“異域”生根、生長(zhǎng)，必須經(jīng)過(guò)粘附（Adhesion）－侵襲（Aggression）－血管生成（Angiogenesis）三部曲。子宮內(nèi)膜細(xì)胞在盆、腹腔內(nèi)與間皮細(xì)胞接觸是形成異位病灶的第一步[5]。腹膜表面覆蓋著一層間皮細(xì)胞，可以分泌大量透明質(zhì)酸，CD44正是透明質(zhì)酸的受體。CD44的表達(dá)增加，使脫落的細(xì)胞易于通過(guò)其配體透明質(zhì)酸與腹膜表面的間皮細(xì)胞結(jié)合，并形成種植灶。由此可見，CD44表現(xiàn)出許多浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移所需要的特性，它的異常表達(dá)可能與EMT的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有密切的關(guān)系。CD44在子宮內(nèi)膜細(xì)胞與間皮細(xì)胞的相互作用中發(fā)揮非常重要的作用[6－7]。

本研究通過(guò)建立大鼠EMT模型，發(fā)現(xiàn)EMT模型大鼠異位內(nèi)膜腺上皮CD44的表達(dá)顯著高于EMT在位內(nèi)膜及對(duì)照組子宮內(nèi)膜。由腹膜間皮細(xì)胞產(chǎn)生的透明質(zhì)酸與表達(dá)CD44的子宮內(nèi)膜細(xì)胞黏附結(jié)合，是子宮內(nèi)膜細(xì)胞在盆、腹腔種植形成EMT的機(jī)制之一，CD44表達(dá)增強(qiáng)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞表現(xiàn)出與間皮細(xì)胞很強(qiáng)的黏附性。CD44表達(dá)增強(qiáng)的子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞是具有腹膜種植潛能的細(xì)胞，易與細(xì)胞外基質(zhì)黏附，進(jìn)而在異位處種植生長(zhǎng)，種植能力與CD44的表達(dá)量有關(guān)，其在異位內(nèi)膜中的異常表達(dá)可引起異位病灶的種植。

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