生物反應(yīng)器在血管組織工程中的應(yīng)用及進(jìn)展

李春民 汪忠鎬2*

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬復(fù)興醫(yī)院血管外科，北京 100038）2（首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院血管外科，北京100053）

引言

血管組織工程是一門交叉學(xué)科，以細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)為基礎(chǔ)，利用生命科學(xué)和工程學(xué)原理，用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在體外模擬構(gòu)建機(jī)體血管的技術(shù)，其目的是為患者提供血管替代物［1］。血管組織工程的基本思路為：將體外分離、培養(yǎng)的自體血管組織細(xì)胞，種植于具有良好生物相容性并可最終完全降解的生物材料上，形成細(xì)胞生物材料復(fù)合體，植入體內(nèi)與宿主血管組織融合生長，重塑后完全演變?yōu)樽泽w正常血管。種子細(xì)胞和支架是構(gòu)成組織工程的核心：種子細(xì)胞能夠新生血管組織，而且不會引起機(jī)體免疫排斥反應(yīng)；血管支架是活細(xì)胞在體外生長所需的支持物，提供一個細(xì)胞生長的三維空間，便于細(xì)胞附著、生長及遷移，同時也是構(gòu)建血管所需的骨架結(jié)構(gòu)。由于組織工程能完全恢復(fù)血管組織結(jié)構(gòu)和功能，使該技術(shù)成為最理想的修復(fù)重建手段，因此是近年來血管外科研究的新方向和熱點(diǎn)［2-3］。

早在1986年，Weinberg把牛主動脈的內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）、平滑肌細(xì)胞（SMCs）和外膜的成纖維細(xì)胞種植于膠原構(gòu)建的支架內(nèi)，最先構(gòu)建出3層的動脈血管結(jié)構(gòu)，該血管的爆破強(qiáng)度僅為90 mmHg，遠(yuǎn)低于自然血管［4］。導(dǎo)致這種情況的主要原因是沒有能夠得到一個類似于生物體內(nèi)具有機(jī)械、生物化學(xué)等生理刺激的環(huán)境，這使得研究者開始著手研制生物反應(yīng)器。作為血管組織工程構(gòu)建的關(guān)鍵要素之一，血管組織工程生物反應(yīng)器是在體外造就一個與體內(nèi)相似的環(huán)境，形成加速血管種子細(xì)胞培養(yǎng)、血管組織構(gòu)建的系統(tǒng)。生物反應(yīng)器的發(fā)展為組織工程的發(fā)展提供了載體，在生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行血管三維構(gòu)建和培養(yǎng)已成為目前血管組織工程常用、有效的方式。

1 生物反應(yīng)器的種類

近年來，組織工程用生物反應(yīng)器飛速發(fā)展，種類也越來越多，先后出現(xiàn)了攪拌式生物反應(yīng)器，氣升式生物反應(yīng)器、中空纖維式生物反應(yīng)器、單軸和雙軸旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器等。旋轉(zhuǎn)壁式生物反應(yīng)器（rotating wall vessel bioreactor，RWVB）的出現(xiàn)是反應(yīng)器發(fā)展的一個里程碑，它是1990年由Kleis等首先研發(fā)成功［5］，隨后于1992年被美國航空航天局（NASA）應(yīng)用，作為在地面上模擬微重力條件下細(xì)胞生長的一種新型細(xì)胞及組織培養(yǎng)裝置，目前主要應(yīng)用于骨、軟骨、心血管等領(lǐng)域。RWVB的主體一般由內(nèi)外同心圓柱組成，內(nèi)柱由可以進(jìn)行氣體交換的半透膜構(gòu)成，內(nèi)外柱之間充滿培養(yǎng)基和預(yù)先種植了細(xì)胞的支架。由于它具有動態(tài)培養(yǎng)環(huán)境的優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于血管組織工程領(lǐng)域，并在它出現(xiàn)后的十幾年里得到了非?？斓陌l(fā)展，出現(xiàn)了許多新改進(jìn)的反應(yīng)器類型。

一個理想的生物反應(yīng)器應(yīng)具備健全的可以控制的環(huán)境因素［6］：pH、O2、溫度、營養(yǎng)物質(zhì)的傳送和代謝廢物的排出等，同時還要做到無菌和自動化控制。在生物反應(yīng)器的設(shè)計中，對于要培養(yǎng)的細(xì)胞或組織來說，生物力學(xué)和生物化學(xué)的調(diào)控是模擬生理環(huán)境最需要的。流體力學(xué)的應(yīng)力（即剪切應(yīng)力）是最重要的生物反應(yīng)的機(jī)械刺激信號，常被廣泛應(yīng)用于生物反應(yīng)器的機(jī)械刺激方面。作為生物反應(yīng)器，應(yīng)至少能夠具有以下5種功能中的一種：一是能夠在三維支架上建立均勻分布的細(xì)胞層；二是在培養(yǎng)的介質(zhì)中能維持恒定的氣體和營養(yǎng)物質(zhì)的供給；三是給生長提供有效的物質(zhì)傳遞；四是培養(yǎng)中的組織能夠受到生理的刺激；五是能提供三維培養(yǎng)組織的生長信息，而最初步的信息來自于獨(dú)立培養(yǎng)的細(xì)胞［7］。

2 生物反應(yīng)器與種子細(xì)胞的培養(yǎng)、擴(kuò)增

血流動力學(xué)影響生物體內(nèi)的動脈搏動產(chǎn)生血流，對血管壁造成以下兩種機(jī)械應(yīng)力：一種是由血流沖擊造成的平行血流長軸的剪切應(yīng)力，主要影響內(nèi)皮細(xì)胞的排列和功能；另一種是由血流壓力形成的沿管徑分布的環(huán)形張力，主要影響平滑肌細(xì)胞的排列和功能狀況。

細(xì)胞在運(yùn)行的生物反應(yīng)器內(nèi)，可以受到流體剪切應(yīng)力的作用。擬胚體在生物反應(yīng)器內(nèi)的培養(yǎng)需要一個最佳的剪切應(yīng)力，比較低的剪切應(yīng)力容易使擬胚體聚集，而過高的剪切應(yīng)力則導(dǎo)致細(xì)胞死亡。已觀察到在較低剪切應(yīng)力的反應(yīng)器內(nèi)可以加速擬胚體的聚集。不同的干細(xì)胞有其最佳的剪切應(yīng)力，上皮干細(xì)胞的培養(yǎng)最適合的剪切應(yīng)力為0.21 Pa，而胚胎干細(xì)胞最適合的為 0.61 Pa，在0.45 Pa壓力下，細(xì)胞就發(fā)生了聚集［8］。Chen同時發(fā)現(xiàn)，20 r/m的轉(zhuǎn)速可以防止細(xì)胞在反應(yīng)器內(nèi)聚集［9］，8 d后細(xì)胞開始在旋轉(zhuǎn)反應(yīng)器內(nèi)聚集。所以有學(xué)者認(rèn)為，微重力條件僅有一個較短的時間適合于高質(zhì)量的干細(xì)胞擴(kuò)增［10］。在培養(yǎng)過程中，應(yīng)用70 μm的過濾器或通過反復(fù)移液吹打的方法分離聚集的細(xì)胞，但在13 d后這些方法也無作用，因為反應(yīng)器內(nèi)的細(xì)胞發(fā)生了嚴(yán)重的聚集。所以，在第8 d細(xì)胞數(shù)量達(dá)到頂峰，隨后開始下降。由此可見，應(yīng)該選擇8 d作為細(xì)胞在反應(yīng)器內(nèi)擴(kuò)增的平均時間。

Sanford在對牛主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過在生物反應(yīng)器內(nèi)30 d的三維培養(yǎng)，掃描電鏡結(jié)果顯示，細(xì)胞具有典型的內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)，在細(xì)胞數(shù)量和遷移功能方面，明顯高于對照組［11］。同時發(fā)現(xiàn)，三維培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞分泌的NO比對照組高10倍，而且反應(yīng)器的旋轉(zhuǎn)速度不同，分泌的NO增加量也有明顯不同：在8 r/min條件下較對照組增加73％，在20 r/min條件下則增加500％。這充分說明機(jī)械刺激信號對內(nèi)皮細(xì)胞生長有顯著作用。

在靜態(tài)條件下，間充質(zhì)細(xì)胞（mesenchume cells，MSCs）進(jìn)行擴(kuò)增需要耗費(fèi)較長的時間，不適于臨床的應(yīng)用，人們轉(zhuǎn)而尋求另一種能夠快速擴(kuò)增的方法。Chen在對人成體間充質(zhì)干細(xì)胞研究中發(fā)現(xiàn)，在生物反應(yīng)器內(nèi)的MSCs可以擴(kuò)增29倍；同時通過細(xì)胞表型分析和功能檢驗發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增后的MSCs仍保持其原有的生物特性［10］。MSCs在體外能支持造血功能，在過去的研究中，MSCs細(xì)胞與造血干細(xì)胞（haemopoietic stem cells，HSCs）在反應(yīng)器內(nèi)共同培養(yǎng)，能夠保持其多向分化的能力。這種混合培養(yǎng)體系對于MSCs和HSCs生長都是有利的，因為懸浮液系統(tǒng)在體外模擬了骨髓微環(huán)境，其中包含生長所需要的各種要素細(xì)胞因子、化學(xué)激素、生長因子等。三維旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器是目前最理想的培養(yǎng)體系，它提供了獨(dú)特的生長環(huán)境，使剪切應(yīng)力降到最低，實(shí)現(xiàn)微重力的環(huán)境，特別適合于哺乳動物細(xì)胞的生長。生物反應(yīng)器內(nèi)擴(kuò)增MSCs可以完全表達(dá)MSCs原始的細(xì)胞標(biāo)記，同時維持高水平的 CFE-F/day（colony-forming efficiency-fibroblast per day），而且能保持在合適誘導(dǎo)條件下向軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞分化的能力。許多研究證明，MSCs細(xì)胞與HSCs在旋轉(zhuǎn)反應(yīng)器中共同培養(yǎng)，可以使MSCs得到迅速的擴(kuò)增［12-13］。

在生物反應(yīng)器中，有3個條件對細(xì)胞產(chǎn)生重要的影響：營養(yǎng)方式、剪切應(yīng)力、培養(yǎng)基的補(bǔ)充。有限稀釋法［14-16］（LDF）在目前的研究中發(fā)現(xiàn)有許多的優(yōu)勢：首先，在培養(yǎng)體系中，干細(xì)胞的快速擴(kuò)增可導(dǎo)致有刺激作用的細(xì)胞因子減少，使培養(yǎng)系統(tǒng)中有害因子增加，這將阻礙初級的干細(xì)胞進(jìn)一步擴(kuò)增。通過LDF，可以稀釋培養(yǎng)基中的抑制因子，同時保留有刺激因素的因子。其次，為了在體外獲得最佳的細(xì)胞擴(kuò)增，對反應(yīng)器系統(tǒng)進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物交換，可以等同于體內(nèi)環(huán)境。每天交換懸浮培養(yǎng)體現(xiàn)20％的培養(yǎng)基，可以完全模擬血漿在骨髓內(nèi)的灌注（大約每分鐘0.1 mL/mL骨髓）?，F(xiàn)在的研究證實(shí)每天20％的稀釋培養(yǎng)完全可以適應(yīng)于MSCs快速擴(kuò)增的需要。

生物反應(yīng)器對干細(xì)胞來說，不僅僅局限于進(jìn)行細(xì)胞數(shù)量的擴(kuò)增，更重要的是對干細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境進(jìn)行監(jiān)測和調(diào)控。生物反應(yīng)器內(nèi)的調(diào)控不是簡單地維持干細(xì)胞環(huán)境持續(xù)的恒定，而是能長時間動態(tài)地供應(yīng)細(xì)胞營養(yǎng)、氧和生長因子等，這會改變目前干細(xì)胞培養(yǎng)的現(xiàn)狀［17］。另外，在反應(yīng)器內(nèi)創(chuàng)造一個呈梯度分布的培養(yǎng)環(huán)境也是必要的，可使一些生長環(huán)境不同的細(xì)胞分布在同一個反應(yīng)器內(nèi)的不同區(qū)域，這些細(xì)胞間能產(chǎn)生相互影響。選擇生物反應(yīng)器要根據(jù)細(xì)胞的種類、生長方式，反應(yīng)器的調(diào)控方式也很重要。目前如何保持干細(xì)胞多向分化的潛能，是制約生物反應(yīng)器內(nèi)大規(guī)模培養(yǎng)擴(kuò)增的一個障礙［18］。

未來的問題是尋找出適合各種干細(xì)胞培養(yǎng)的條件，同時建立適應(yīng)于大規(guī)模細(xì)胞擴(kuò)增的培養(yǎng)體系。灌注法與持續(xù)供給營養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)在最近的研究中已被證實(shí)，但理想的培養(yǎng)條件和參數(shù)需要進(jìn)一步確定。PO2、pH、溫度和營養(yǎng)物的濃度等已經(jīng)在靜態(tài)培養(yǎng)中得到確定，而在可以受到嚴(yán)格控制和調(diào)節(jié)的生物反應(yīng)器內(nèi)的培養(yǎng)仍需要摸索出一個最佳的參數(shù)和條件。另外，值得注意的是，理想的參數(shù)值因為干細(xì)胞種類的不同而不一致；同時，不同干細(xì)胞的擴(kuò)增、分化所需要的參數(shù)也是不同的。剪切應(yīng)力對多種干細(xì)胞的影響已被研究，但需要更深入地研究在反應(yīng)器環(huán)境中的影響［19-20］。

3 生物反應(yīng)器在組織工程血管構(gòu)建中的應(yīng)用

現(xiàn)在，許多研究集中在生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行兩次細(xì)胞種植，即模擬自然血管分別種植平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞［21-23］。作為組織工程血管支架的細(xì)胞外基質(zhì)成分容易獲得，也能夠構(gòu)建成血管支架，但以下工作卻是要在生物反應(yīng)器內(nèi)實(shí)現(xiàn)，比較耗費(fèi)時間。首先，要在支架中層種植平滑肌細(xì)胞，使其分泌細(xì)胞外基質(zhì)，以形成纖維型的膠原；其次，還要種植內(nèi)皮細(xì)胞，并確保內(nèi)皮細(xì)胞層能在支架內(nèi)壁融合，以實(shí)現(xiàn)耐受 20 dyn/cm2的機(jī)械剪切應(yīng)力。Isenberg［23］應(yīng)用纖維素凝膠，需要 5周時間才能構(gòu)建成血管支架，種植的內(nèi)皮細(xì)胞完全覆蓋支架內(nèi)腔的最合適時間是2 d，功能和排列良好的內(nèi)皮細(xì)胞可以抵抗住10 dyn/cm2持續(xù)搏動的血的流力量。但是，經(jīng)過5周時間制作的支架的機(jī)械強(qiáng)度比較低，而且也不均一；制作效率低，一根血管有時只有一小段可用（約3～4 cm）。

剪切應(yīng)力對血管（尤其是血管細(xì)胞）的影響非常大，在生物反應(yīng)器內(nèi)，可以更精確地研究剪切應(yīng)力與細(xì)胞生長的關(guān)系。Macario發(fā)現(xiàn)，人主動脈ECs在剪切應(yīng)力10～20 dyn/cm2間生長及黏附良好；達(dá)到30 dyn/cm2時，6 h后細(xì)胞凋亡明顯增加，原因是由于細(xì)胞支架的變化［24］。由于支架自身張力強(qiáng)度降低，導(dǎo)致部分區(qū)域受到的流體機(jī)械力發(fā)生變化，影響細(xì)胞沿流體方向排列，從而消弱了內(nèi)皮細(xì)胞與支架間的黏附力，最終導(dǎo)致細(xì)胞脫落。而Inoguchi［25］發(fā)現(xiàn)，剪切應(yīng)力存在的狀態(tài)下可以提高ECs抵抗從生物材料分離的力，如果剪切應(yīng)力逐漸增至8.7 dyn/cm2時，細(xì)胞形態(tài)學(xué)得以保持，與材料的黏附得以加強(qiáng)，但當(dāng)達(dá)到19.6 dyn/cm2時，可以看到有細(xì)胞開始脫落。在作為外部因素的剪切應(yīng)力誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡中，F(xiàn)as/FasL基因發(fā)揮著重要作用。與此不同的是，Shirota在生物反應(yīng)器內(nèi)，進(jìn)行的血管支架種植內(nèi)皮細(xì)胞，設(shè)定泵的頻率為70次/min，產(chǎn)生的流量為60 mL/min，作用于支架上的剪切應(yīng)力為30 dyn/cm2［26］。在這種機(jī)械力學(xué)刺激下，內(nèi)皮細(xì)胞呈長梭型、沿液體流動方向排列，而且細(xì)胞保持單分子層融合生長的狀態(tài)，與自然血管類似，這些差異可能與各個實(shí)驗室所采用的材料及設(shè)備的不同有關(guān)。

通過對血管中層的平滑肌細(xì)胞的研究，Engbers-Buijtenhuijs認(rèn)為，持續(xù)的機(jī)械力對于在生物反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)的 SMCs至少有3方面不同的影響：加速SMCs的生長、加速膠原纖維束的產(chǎn)生、誘導(dǎo)細(xì)胞的表型由綜合狀態(tài)向收縮狀態(tài)轉(zhuǎn)化［27］。在他進(jìn)行的實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)，較靜態(tài)培養(yǎng)，在生物反應(yīng)器內(nèi)搏動性血流刺激下，血管支架上的平滑肌細(xì)胞數(shù)量明顯增加，細(xì)胞在支架材料上有更均勻的分布，有更多基質(zhì)膠原的mRNA表達(dá)。在反應(yīng)器內(nèi)的培養(yǎng)，促進(jìn)了營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝廢物的排泄，而且較靜態(tài)環(huán)境需要更多的氧代謝。

生物反應(yīng)器能更好地為組織過程血管提供物質(zhì)供應(yīng)，一些研究表明，灌注法可以明顯增加三維環(huán)境培養(yǎng)的支架上細(xì)胞密度［28-29］。持續(xù)的灌注可以使循環(huán)中的培養(yǎng)基攜帶足夠的養(yǎng)分，同時可以運(yùn)輸更多的氧供應(yīng)支架材料上的細(xì)胞，還可以清除代謝廢物和代謝中產(chǎn)生的一些抑制因子。

目前已經(jīng)有研究顯示，生物反應(yīng)器在提高組織工程血管機(jī)械強(qiáng)度方面有非常重要的作用。Hoerstrup在對小口徑血管支架機(jī)械性的研究中發(fā)現(xiàn)：在搏動血流狀態(tài)下的生物反應(yīng)器內(nèi)，支架的爆破強(qiáng)度在21 d后從最初的177.5 mmHg升高到326.3 mmHg；作為對照，同樣的支架在靜態(tài)環(huán)境培養(yǎng)，21 d后爆破強(qiáng)度從最初的178.8 mmHg降到50mmHg［30］。同樣地，縫合強(qiáng)度生物反應(yīng)器組比對照組高5倍。Hoerstrup的研究顯示，生物反應(yīng)器內(nèi)種植的小口徑血管支架達(dá)到了類似自然血管的組織，并且在機(jī)械強(qiáng)度方面也適應(yīng)臨床應(yīng)用。

Niklason把豬的平滑肌細(xì)胞種植在可降解的聚乙醇酸支架上，在搏動性生物反應(yīng)器內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)數(shù)周。在培養(yǎng)過程中，伴隨著支架的降解，平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生了大量的基質(zhì)蛋白，同時發(fā)現(xiàn)搏動性力學(xué)環(huán)境的培養(yǎng)并不能提高SMCs的密度，但能夠使肌球蛋白重鏈更強(qiáng)的染色，后者是SMCs成熟的最終標(biāo)志物［31］。在培養(yǎng)的后期，把豬的內(nèi)皮細(xì)胞種植在管腔內(nèi)，從而使管腔面形成完整的內(nèi)皮細(xì)胞層，這種組織工程血管在組織表現(xiàn)上與自然血管非常相似。這些組織工程血管的爆破壓（burst pressure）達(dá)到2 000 mmHg，在移植豬體內(nèi)保持24周的通暢，而非反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)的對照組爆破力卻不足300 mmHg。該組織工程血管的縫合強(qiáng)度雖已達(dá)到91 g，但仍低于自然血管。Niklason同時驗證了支架的培養(yǎng)時間與承受力量之間的關(guān)系，在生物可降解支架PGA上種植細(xì)胞，培養(yǎng)5周可以耐受570 mmHg的壓力，而培養(yǎng)8周的可以耐受2 150 mmHg的壓力。筆者最近進(jìn)行了MSCs與可降解合成材料在生物反應(yīng)器內(nèi)構(gòu)建組織工程血管的實(shí)驗，發(fā)現(xiàn)在剪切應(yīng)力作用下，MSCs向內(nèi)皮細(xì)胞定向分化，為構(gòu)建組織工程血管開辟了新的途徑［32］。

人們對機(jī)械力刺激作用于細(xì)胞信號和機(jī)械力傳導(dǎo)影響的不斷深入理解，是未來研制理想生物反應(yīng)器的基礎(chǔ)。另外，在實(shí)驗中對生物反應(yīng)器內(nèi)的組織或細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時分析、數(shù)學(xué)和計算機(jī)模式的不斷引入，也是未來反應(yīng)器發(fā)展的趨勢。

雖然在生物反應(yīng)器內(nèi)構(gòu)建組織工程血管取得了很大的進(jìn)展，但許多問題仍需解決：如何使種植細(xì)胞的組織工程血管在生物反應(yīng)器內(nèi)更好地生長；如何改進(jìn)生物反應(yīng)器，使組織工程血管獲得最佳的機(jī)械強(qiáng)度等。在把生物反應(yīng)器作為一個常規(guī)設(shè)備用于臨床之前，還有很長的路要走。

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