檢疫性實(shí)蠅快速鑒定方法研究進(jìn)展

王文祥, 于 飛, 章 柱, 林曉紅

(1.廣州機(jī)場(chǎng)出入境檢驗(yàn)檢疫局,廣州 510470; 2.惠州出入境檢驗(yàn)檢疫局,惠州 516001)

實(shí)蠅屬雙翅目(Diptera)實(shí)蠅科(Tephritidae),其幼蟲主要為害果實(shí)使受害樹大量落果,受害果商品價(jià)值受到嚴(yán)重影響造成巨大經(jīng)濟(jì)損失,其中植物檢疫性實(shí)蠅是實(shí)蠅的主要類群之一,在國(guó)際貿(mào)易中具有重要經(jīng)濟(jì)意義[1]。檢疫性實(shí)蠅主要分布在果實(shí)蠅屬(Bactrocera)、寡鬃實(shí)蠅屬(Dacus)、小條實(shí)蠅屬(Ceratitis)、按實(shí)蠅屬(Anastrepha)和繞實(shí)蠅屬(Rhagoletis)5個(gè)屬,其中果實(shí)蠅屬是最具經(jīng)濟(jì)意義的實(shí)蠅類群[2-3]。

1 檢疫性實(shí)蠅快速鑒定的意義

在水果國(guó)際貿(mào)易中許多檢疫性實(shí)蠅發(fā)生國(guó)家與未發(fā)生國(guó)家有頻繁的貿(mào)易往來(lái),這必將使檢疫性實(shí)蠅入侵?jǐn)U散的風(fēng)險(xiǎn)大大增加[4],嚴(yán)重威脅世界水果生產(chǎn)安全。在不斷變化的新形勢(shì)下需要采取有效的措施和手段保護(hù)目前穩(wěn)定的水果生產(chǎn)狀況,這就要求植物檢疫工作在《實(shí)施衛(wèi)生和動(dòng)植物檢疫措施的協(xié)議》(SPS)框架下,通過(guò)可靠的實(shí)蠅鑒定來(lái)識(shí)別外來(lái)物種并阻止其侵入蔓延,避免自然生態(tài)環(huán)境和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)受到不可逆影響及重大經(jīng)濟(jì)損失。在防止檢疫性實(shí)蠅入侵工作中,植物檢疫作為傳統(tǒng)的植物保護(hù)措施往往起到事半功倍的作用,實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)作為其重要環(huán)節(jié)要求對(duì)截獲的實(shí)蠅進(jìn)行準(zhǔn)確而快速的種類鑒定,鑒定周期的長(zhǎng)短決定了開展下一步應(yīng)急快速反應(yīng)、預(yù)警測(cè)報(bào)和防治效果?？诎吨参餀z疫實(shí)驗(yàn)室面對(duì)大量實(shí)蠅的幼蟲和蛹通常將其飼養(yǎng)至成蟲蟲態(tài)才可進(jìn)行準(zhǔn)確的形態(tài)學(xué)鑒定,這一過(guò)程往往需要20～30 d,顯然,過(guò)長(zhǎng)的鑒定周期不利于水果國(guó)際貿(mào)易順利發(fā)展。因此,各國(guó)科研工作者為突破這一束縛進(jìn)行了積極而迫切的探求,從分子生物學(xué)角度進(jìn)行深入研究取得了一系列令人矚目而卓有成效的科研成果。本文將檢疫性實(shí)蠅的快速鑒定方法進(jìn)行對(duì)比和分析,探討方法的研究思路和優(yōu)缺點(diǎn),強(qiáng)調(diào)了準(zhǔn)確選擇分子標(biāo)記的重要性,旨在為建立有效的檢疫性實(shí)蠅快速鑒定方法提供基本思路。

2 快速鑒定方法

快速鑒定方法通常是指與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定相區(qū)別的用于檢疫性實(shí)蠅種類鑒定的分子生物學(xué)方法,它具有檢測(cè)周期短、對(duì)樣品質(zhì)量和數(shù)量要求低和結(jié)果準(zhǔn)確可靠等特點(diǎn)。分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展為豐富和充實(shí)檢疫性實(shí)蠅鑒定方法提供了必要條件,其研究成果在檢疫性實(shí)蠅快速鑒定中得到了廣泛應(yīng)用和實(shí)踐,目前主要包括電泳、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA和核酸序列分析鑒定技術(shù)。

2.1 電泳技術(shù)

電泳技術(shù)中同工酶電泳應(yīng)用研究較為廣泛,它是以生物分類和系統(tǒng)進(jìn)化為理論基礎(chǔ),利用分子生物學(xué)、生物化學(xué)和群體遺傳學(xué)的手段和方法,根據(jù)不同物種之間酶和蛋白質(zhì)表征基因位點(diǎn)和等位基因的不同來(lái)研究昆蟲的分類和進(jìn)化[5-7]。在實(shí)蠅種屬快速鑒定中同工酶電泳技術(shù)首先得到了應(yīng)用,Berlocher采用6種酯酶同工酶電泳技術(shù)成功鑒定了繞實(shí)蠅屬的不同種實(shí)蠅,并建立了電泳酶譜檢索表[8],Drew和Hardy進(jìn)一步將染色體組型與同工酶電泳技術(shù)結(jié)合起來(lái)以區(qū)分橘小實(shí)蠅和達(dá)爾文實(shí)蠅幼蟲[9],梁廣勤等采用此方法鑒定橘小實(shí)蠅、芒果實(shí)蠅、番石榴實(shí)蠅、南瓜實(shí)蠅和瓜實(shí)蠅5種3齡實(shí)蠅幼蟲并驗(yàn)證了應(yīng)用效果[10]。楊國(guó)海等對(duì)芒果實(shí)蠅、番石榴實(shí)蠅、南瓜實(shí)蠅和瓜實(shí)蠅4種實(shí)蠅幼蟲單獨(dú)用酯酶同工酶電泳進(jìn)行快速鑒定[11],獲得較好的結(jié)果,Saelee等也通過(guò)電泳分析異型酶多態(tài)性甄別了不同寄主飼喂的7種南瓜實(shí)蠅復(fù)合種[12]。詹開瑞等還首次采用PCR結(jié)合變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技術(shù)分析了橘小實(shí)蠅及其6種近緣種的線粒體CO Ⅱ和16s rDNA基因序列,根據(jù)不同實(shí)蠅的電泳譜圖可以確定種間特異性[13]。電泳技術(shù)雖具有突變檢出率高、操作簡(jiǎn)便且費(fèi)用低廉等優(yōu)勢(shì),但其結(jié)果重現(xiàn)性差且樣品酶還易受昆蟲發(fā)育階段和保存條件的影響,因而在檢疫性實(shí)蠅快速鑒定應(yīng)用中不斷推陳出新,其他分子生物學(xué)技術(shù)和方法逐漸取代了常規(guī)電泳檢測(cè)方法。

2.2 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)是較早發(fā)展起來(lái)的分子標(biāo)記技術(shù)之一,它是根據(jù)不同種生物的線粒體DNA(mtDNA)限制酶切位點(diǎn)數(shù)目和位置差異來(lái)分析比較被限制性內(nèi)切酶切割的DNA片段序列[14],該技術(shù)廣泛應(yīng)用于檢疫性實(shí)蠅的快速鑒定研究中,其方法具有快速、經(jīng)濟(jì)、結(jié)果可靠的優(yōu)勢(shì)。Masahiko等以mtDNA 1.6 kb片段作為分子標(biāo)記利用PCRRFLP技術(shù)分析成功鑒定了橘小實(shí)蠅等18種果實(shí)蠅屬實(shí)蠅[15]。吳佳教等應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù)設(shè)計(jì)兩種引物對(duì)橘小實(shí)蠅、銹實(shí)蠅、瓜實(shí)蠅、南瓜實(shí)蠅、具條實(shí)蠅和木姜子實(shí)蠅6種果實(shí)蠅mtDNA進(jìn)行擴(kuò)增,其PCR擴(kuò)增片斷大小分別約為350 bp和450 bp,以限制性內(nèi)切酶MSE I和DRA I對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后得到的酶切位點(diǎn)可區(qū)分供試實(shí)蠅[16]。吳佳教等運(yùn)用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)口岸截獲頻率較高的地中海實(shí)蠅、橘小實(shí)蠅、番石榴實(shí)蠅和辣椒實(shí)蠅等9種檢疫性實(shí)蠅mtDNA的PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行酶切,得到的酶切位點(diǎn)可清晰地區(qū)分供試實(shí)蠅[17]。Barr等通過(guò) PCR-RFLP技術(shù)分析線粒體 12S rRNA、16S rRNA和NADH脫氫酶亞基6基因區(qū)分小條實(shí)蠅屬25種實(shí)蠅也達(dá)到了良好效果[18]。林麗莉等利用4組引物對(duì)供試實(shí)蠅的CO Ⅱ和ITS1基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,借助MnlⅠ、MseⅠ、AseⅠ、DraⅠ和SspⅠ5種限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后可把蜜柑大實(shí)蠅與橘大實(shí)蠅分開,其方法不受目標(biāo)實(shí)蠅食物源、地理來(lái)源和標(biāo)本保存條件的影響[19]。PCR-RFLP實(shí)蠅快速鑒定方法具有較好的應(yīng)用效果,但也存在著一定局限性,如它是否能對(duì)檢疫性實(shí)蠅復(fù)合種進(jìn)行鑒定分析還有待論證,不同的染色方法(放射性物質(zhì)標(biāo)記或EB染色)所得DNA片段多態(tài)性結(jié)果有差異,所得DNA片段內(nèi)序列變異不能分析等,這些不確定性表明PCR-RFLP方法還有待進(jìn)一步深入研究才能得到更廣泛的應(yīng)用。

2.3 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)是近年來(lái)涌現(xiàn)的新技術(shù)之一,其標(biāo)記突破了表達(dá)型標(biāo)記的局限性,DNA序列差異決定了RAPD能夠快速、容易地提供遺傳變異的信息,具有信息含量高、不同層次和類群之間廣泛可比等優(yōu)越性[20]。Baruffi等利用RAPD和多位點(diǎn)酶電泳對(duì)非洲6個(gè)野生和5個(gè)室內(nèi)地中海實(shí)蠅種群的基因多樣性進(jìn)行了分析,使用 4對(duì)引物擴(kuò)增出174條多態(tài)性片段,在26個(gè)酶切位點(diǎn)獲得74個(gè)等位基因,為不同地理種群地中海實(shí)蠅的分子生物學(xué)

2 快速鑒定方法

快速鑒定方法通常是指與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定相區(qū)別的用于檢疫性實(shí)蠅種類鑒定的分子生物學(xué)方法,它具有檢測(cè)周期短、對(duì)樣品質(zhì)量和數(shù)量要求低和結(jié)果準(zhǔn)確可靠等特點(diǎn)。分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展為豐富和充實(shí)檢疫性實(shí)蠅鑒定方法提供了必要條件,其研究成果在檢疫性實(shí)蠅快速鑒定中得到了廣泛應(yīng)用和實(shí)踐,目前主要包括電泳、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA和核酸序列分析鑒定技術(shù)。

2.1 電泳技術(shù)

電泳技術(shù)中同工酶電泳應(yīng)用研究較為廣泛,它是以生物分類和系統(tǒng)進(jìn)化為理論基礎(chǔ),利用分子生物學(xué)、生物化學(xué)和群體遺傳學(xué)的手段和方法,根據(jù)不同物種之間酶和蛋白質(zhì)表征基因位點(diǎn)和等位基因的不同來(lái)研究昆蟲的分類和進(jìn)化[5-7]。在實(shí)蠅種屬快速鑒定中同工酶電泳技術(shù)首先得到了應(yīng)用,Berlocher采用6種酯酶同工酶電泳技術(shù)成功鑒定了繞實(shí)蠅屬的不同種實(shí)蠅,并建立了電泳酶譜檢索表[8],Drew和Hardy進(jìn)一步將染色體組型與同工酶電泳技術(shù)結(jié)合起來(lái)以區(qū)分橘小實(shí)蠅和達(dá)爾文實(shí)蠅幼蟲[9],梁廣勤等采用此方法鑒定橘小實(shí)蠅、芒果實(shí)蠅、番石榴實(shí)蠅、南瓜實(shí)蠅和瓜實(shí)蠅5種3齡實(shí)蠅幼蟲并驗(yàn)證了應(yīng)用效果[10]。楊國(guó)海等對(duì)芒果實(shí)蠅、番石榴實(shí)蠅、南瓜實(shí)蠅和瓜實(shí)蠅4種實(shí)蠅幼蟲單獨(dú)用酯酶同工酶電泳進(jìn)行快速鑒定[11],獲得較好的結(jié)果,Saelee等也通過(guò)電泳分析異型酶多態(tài)性甄別了不同寄主飼喂的7種南瓜實(shí)蠅復(fù)合種[12]。詹開瑞等還首次采用PCR結(jié)合變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)技術(shù)分析了橘小實(shí)蠅及其6種近緣種的線粒體CO Ⅱ和16s rDNA基因序列,根據(jù)不同實(shí)蠅的電泳譜圖可以確定種間特異性[13]。電泳技術(shù)雖具有突變檢出率高、操作簡(jiǎn)便且費(fèi)用低廉等優(yōu)勢(shì),但其結(jié)果重現(xiàn)性差且樣品酶還易受昆蟲發(fā)育階段和保存條件的影響,因而在檢疫性實(shí)蠅快速鑒定應(yīng)用中不斷推陳出新,其他分子生物學(xué)技術(shù)和方法逐漸取代了常規(guī)電泳檢測(cè)方法。

2.2 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)

限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)是較早發(fā)展起來(lái)的分子標(biāo)記技術(shù)之一,它是根據(jù)不同種生物的線粒體DNA(mtDNA)限制酶切位點(diǎn)數(shù)目和位置差異來(lái)分析比較被限制性內(nèi)切酶切割的DNA片段序列[14],該技術(shù)廣泛應(yīng)用于檢疫性實(shí)蠅的快速鑒定研究中,其方法具有快速、經(jīng)濟(jì)、結(jié)果可靠的優(yōu)勢(shì)。Masahiko等以mtDNA 1.6 kb片段作為分子標(biāo)記利用PCRRFLP技術(shù)分析成功鑒定了橘小實(shí)蠅等18種果實(shí)蠅屬實(shí)蠅[15]。吳佳教等應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù)設(shè)計(jì)兩種引物對(duì)橘小實(shí)蠅、銹實(shí)蠅、瓜實(shí)蠅、南瓜實(shí)蠅、具條實(shí)蠅和木姜子實(shí)蠅6種果實(shí)蠅mtDNA進(jìn)行擴(kuò)增,其PCR擴(kuò)增片斷大小分別約為350 bp和450 bp,以限制性內(nèi)切酶MSE I和DRA I對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后得到的酶切位點(diǎn)可區(qū)分供試實(shí)蠅[16]。吳佳教等運(yùn)用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)口岸截獲頻率較高的地中海實(shí)蠅、橘小實(shí)蠅、番石榴實(shí)蠅和辣椒實(shí)蠅等9種檢疫性實(shí)蠅mtDNA的PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行酶切,得到的酶切位點(diǎn)可清晰地區(qū)分供試實(shí)蠅[17]。Barr等通過(guò) PCR-RFLP技術(shù)分析線粒體 12S rRNA、16S rRNA和NADH脫氫酶亞基6基因區(qū)分小條實(shí)蠅屬25種實(shí)蠅也達(dá)到了良好效果[18]。林麗莉等利用4組引物對(duì)供試實(shí)蠅的CO Ⅱ和ITS1基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,借助MnlⅠ、MseⅠ、AseⅠ、DraⅠ和SspⅠ5種限制性內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物酶切后可把蜜柑大實(shí)蠅與橘大實(shí)蠅分開,其方法不受目標(biāo)實(shí)蠅食物源、地理來(lái)源和標(biāo)本保存條件的影響[19]。PCR-RFLP實(shí)蠅快速鑒定方法具有較好的應(yīng)用效果,但也存在著一定局限性,如它是否能對(duì)檢疫性實(shí)蠅復(fù)合種進(jìn)行鑒定分析還有待論證,不同的染色方法(放射性物質(zhì)標(biāo)記或EB染色)所得DNA片段多態(tài)性結(jié)果有差異,所得DNA片段內(nèi)序列變異不能分析等,這些不確定性表明PCR-RFLP方法還有待進(jìn)一步深入研究才能得到更廣泛的應(yīng)用。

2.3 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(random amplified polymorphic DNA,RAPD)是近年來(lái)涌現(xiàn)的新技術(shù)之一,其標(biāo)記突破了表達(dá)型標(biāo)記的局限性,DNA序列差異決定了RAPD能夠快速、容易地提供遺傳變異的信息,具有信息含量高、不同層次和類群之間廣泛可比等優(yōu)越性[20]。Baruffi等利用RAPD和多位點(diǎn)酶電泳對(duì)非洲6個(gè)野生和5個(gè)室內(nèi)地中海實(shí)蠅種群的基因多樣性進(jìn)行了分析,使用 4對(duì)引物擴(kuò)增出174條多態(tài)性片段,在26個(gè)酶切位點(diǎn)獲得74個(gè)等位基因,為不同地理種群地中海實(shí)蠅的分子生物學(xué)鑒定奠定了基礎(chǔ)[21]。張紅梅等以31種隨機(jī)引物對(duì)4種實(shí)蠅的基因組進(jìn)行RAPD擴(kuò)增,篩選出的S126引物可將南瓜實(shí)蠅和具條實(shí)蠅,具條實(shí)蠅和三點(diǎn)棍腹實(shí)蠅兩兩分開,但不能區(qū)分南瓜實(shí)蠅和三點(diǎn)棍腹實(shí)蠅[22]。張亮等通過(guò)RAPD技術(shù)構(gòu)建果實(shí)蠅屬的南瓜實(shí)蠅、黑漆實(shí)蠅、具條實(shí)蠅、瓜實(shí)蠅、橘小實(shí)蠅和番石榴實(shí)蠅6種實(shí)蠅的指紋圖譜,在131個(gè)引物中篩選出 5個(gè)重復(fù)性好、多態(tài)性高的引物并擴(kuò)增出302條譜帶,其中111條譜帶具有遺傳多態(tài)性,擴(kuò)增譜帶的聚類分析和傳統(tǒng)分類結(jié)果基本一致,由此表明5種引物均可用于6種實(shí)蠅的分類鑒定[23]。在鑒定方法的建立過(guò)程中,Atienzar和Jha分析后指出RAPD存在的重復(fù)性和序列同源性問(wèn)題使其廣泛應(yīng)用受到了限制,需要不斷優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件增強(qiáng)其結(jié)果可重復(fù)性和擴(kuò)增穩(wěn)定性[24],相信隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷成熟與完善,RAPD用于檢疫性實(shí)蠅快速鑒定的應(yīng)用研究也將繼續(xù)深入和發(fā)展。

2.4 核酸序列分析技術(shù)

核酸序列分析在昆蟲基因研究和系統(tǒng)發(fā)育中是最為常用的手段之一,它通過(guò)測(cè)定昆蟲DNA和RNA序列比較不同種屬昆蟲類群個(gè)體的同源序列,來(lái)推斷不同昆蟲類群之間的演化關(guān)系,建立符合自然發(fā)育的分子系統(tǒng)譜系[25]。在檢疫性實(shí)蠅快速鑒定研究過(guò)程中,通過(guò)比對(duì)不同地理類群和種屬檢疫性實(shí)蠅的特定分子標(biāo)記基因可以準(zhǔn)確、便捷地得出鑒定結(jié)果,在口岸實(shí)驗(yàn)室實(shí)際應(yīng)用中具有現(xiàn)實(shí)意義。目前研究較多的分子標(biāo)記基因主要有核糖體DNA(rDNA)、mtDNA和微衛(wèi)星DNA等,檢疫性實(shí)蠅的分子鑒定可選擇其中之一或多種標(biāo)記基因作為研究對(duì)象[26-27]。其中mtDNA序列是目前檢疫性實(shí)蠅快速鑒定應(yīng)用最為廣泛的遺傳物質(zhì)之一,它是一個(gè)大小為1514～1613 kb的封閉環(huán)狀雙鏈,由于其變異速率高于保守的核基因,因此,mtDNA的各個(gè)基因被廣泛用于昆蟲系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析、種群進(jìn)化、種群遺傳變異和分化、近緣種鑒別和種下分類單元鑒定等方面[28-31]。Baliraine等以地中海實(shí)蠅23個(gè)微衛(wèi)星DNA作為分子標(biāo)記比較分析了納塔爾實(shí)蠅、C.f asciventris和非洲芒果實(shí)蠅,明確了其分子標(biāo)記在鑒定、分析4種實(shí)蠅種群地理來(lái)源和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究中的可行性[32]。唐侃采用微衛(wèi)星位點(diǎn)擴(kuò)增情況0/1的組合進(jìn)行實(shí)蠅鑒定,只需4次或6對(duì)微衛(wèi)星引物1次PCR擴(kuò)增即可將地中海實(shí)蠅、橘小實(shí)蠅、南瓜實(shí)蠅、瓜實(shí)蠅、銹實(shí)蠅和油橄欖實(shí)蠅等4亞屬9種實(shí)蠅區(qū)分開來(lái)[33]。葉軍等對(duì)從秘魯進(jìn)口的葡萄中截獲實(shí)蠅幼蟲進(jìn)行ITS區(qū)和線粒體CO Ⅰ、COⅡ、CO Ⅲ、ND5基因序列的擴(kuò)增和測(cè)序,與GenBank中對(duì)應(yīng)的序列進(jìn)行比對(duì)后結(jié)果表明截獲樣品ITS區(qū)序列和地中海實(shí)蠅相似性為95.16%(其中 ITS1為99.52%,ITS2為86.2%),線粒體CO Ⅰ 、COⅡ、CO Ⅲ、ND5基因序列和地中海實(shí)蠅相似性分別為 100%、99.9%、99.5%、99.8%,基于COⅠ序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中幼蟲樣品和地中海實(shí)蠅最為接近,因此,序列分析和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析的結(jié)果均表明截獲的實(shí)蠅類幼蟲為地中海實(shí)蠅[34]。余道堅(jiān)采用SYBR Green染料實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)建立了地中海實(shí)蠅等10種檢疫性實(shí)蠅的快速鑒定方法,據(jù)此建立的檢疫性實(shí)蠅基因片段庫(kù)為實(shí)蠅分子生物學(xué)鑒定和分子系統(tǒng)發(fā)育等研究提供了重要參考[35]。利用這一技術(shù)建立的辣椒實(shí)蠅快速檢測(cè)方法其檢測(cè)限達(dá)1 pg,最適模板DNA濃度為1～20 ng,幼蟲、成蟲和蛹3種不同蟲態(tài)的辣椒實(shí)蠅熔解曲線分析和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果均一致[36]。以此鑒定技術(shù)制定并公布的地中海實(shí)蠅卵、幼蟲、蛹和成蟲出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)志著地中海實(shí)蠅常規(guī)和SYBR Green實(shí)時(shí)熒光 PCR鑒定方法已成熟并將逐步推廣使用,并印證了檢疫性實(shí)蠅快速鑒定方法的可行性[37]。

Smith和Bush利用mtDNA COⅡ基因和tRNA亮氨酸至COⅡ之間基因?qū)?8個(gè)繞實(shí)蠅屬種群及6個(gè)近緣種群進(jìn)行序列分析,結(jié)果表明目前定義的繞實(shí)蠅種群由5個(gè)地理種群組成[38]。Jamnongluk等對(duì)南瓜實(shí)蠅復(fù)合種的mtDNA COⅠ基因經(jīng)克隆測(cè)序,以橘小實(shí)蠅種群對(duì)應(yīng)基因作為對(duì)照分析明確一段639 bp突變區(qū)域序列差異百分率為19%～29%,并將此復(fù)合種群劃分為4個(gè)分化單元[39]。Jeomhee等對(duì)南瓜實(shí)蠅亞洲種群的mtDNA COⅠ基因、核延長(zhǎng)因子1α、微管蛋白β1和β3序列進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn),高度遺傳分化的韓國(guó)和日本兩地南瓜實(shí)蠅都不是外來(lái)入侵種[40]。施偉和葉輝對(duì)云南橘小實(shí)蠅5個(gè)地理種群的mtDNA COⅠ基因進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序,在5個(gè)種群中具有27個(gè)多態(tài)位點(diǎn)和23種單倍型,分析認(rèn)為地理種群間存在一定程度的遺傳分化應(yīng)與地理隔離有關(guān)[41]。朱振華等經(jīng)過(guò)對(duì)橘小實(shí)蠅和瓜實(shí)蠅等6種實(shí)蠅線粒體細(xì)胞色素b(mtDNA Cyt b)基因中420 bp片段進(jìn)行序列分析,得到38種單倍型和116個(gè)變異位點(diǎn),不同種實(shí)蠅間mtDNA Cyt b序列存在差異,其堿基替換數(shù)為13～37,遺傳距離在0.059 24～0.191 33之間,而同種實(shí)蠅不同個(gè)體之間差異較小,適于將mtDNA Cyt b基因作為這6種實(shí)蠅鑒定的分子標(biāo)記基因[42]。崔俊霞等采用PCR技術(shù)從截獲的可疑橘小實(shí)蠅幼蟲和蛹樣本中均擴(kuò)增得到224 bp的特異性條帶,經(jīng)測(cè)序比較發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物序列與橘小實(shí)蠅目的基因序列完全相同,由此證明可疑樣本為橘小實(shí)蠅的幼蟲和蛹,其余幼蟲和蛹羽化后經(jīng)形態(tài)鑒定也驗(yàn)證了此方法的準(zhǔn)確性[43]。

在檢疫性實(shí)蠅快速鑒定方法研究過(guò)程中,如何從實(shí)蠅眾多基因中選擇高效且遺傳信息豐富的基因作為快速鑒定分子標(biāo)記基因一直得到重視和研究,但還沒有文獻(xiàn)進(jìn)行不同分子標(biāo)記基因尤其是研究較為成熟的mtDNA分子標(biāo)記基因之間效率、穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性的比較,這就為選擇最佳分子標(biāo)記基因的深入研究增加了難度。Muraji和 Nakahara以1.6 kb線粒體片段基因分析了19種果實(shí)蠅屬實(shí)蠅的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,除對(duì)果實(shí)蠅屬?gòu)?fù)合種不能較好區(qū)分外,其他均可以確定分類地位[44]。Smith等通過(guò)線粒體16S rRNA和COⅡ+tRNALys+tRNAAsp基因構(gòu)建進(jìn)化樹分析了24種果實(shí)蠅屬實(shí)蠅的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,表明線粒體基因作為重要分子標(biāo)記基因?qū)麑?shí)蠅屬的分類和進(jìn)化研究具有積極作用[45]。通過(guò)篩選檢疫性實(shí)蠅基因數(shù)據(jù)庫(kù)中的mtDNA COⅠ和Cyt b基因充分發(fā)揮了快速鑒定的優(yōu)勢(shì),但標(biāo)記基因之間的系統(tǒng)比較與分析還有待進(jìn)一步研究。此外,由于實(shí)蠅復(fù)合種的復(fù)雜性,使用不同分子標(biāo)記基因也可能產(chǎn)生不同的結(jié)果。Virgilio等分別利用mtDNA COⅠ、NADH脫氫酶亞基6和ITS1分子標(biāo)記基因系統(tǒng)分析C.f asciventris復(fù)合種的來(lái)源,以最大似然法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹說(shuō)明復(fù)合種來(lái)自黑羽小條實(shí)蠅和納塔爾小條實(shí)蠅的不同地理種群,得到互不相同的結(jié)論[46]。因此,選擇不同的分子標(biāo)記基因?qū)Σ煌N屬的檢疫性實(shí)蠅快速鑒定效率和結(jié)果可能存在一定影響,恰當(dāng)?shù)姆肿訕?biāo)記基因以及進(jìn)行必要的驗(yàn)證在快速鑒定中尤其顯得重要。

3 展望

分子生物學(xué)技術(shù)與手段的發(fā)展為實(shí)現(xiàn)檢疫性實(shí)蠅快速鑒定帶來(lái)了良好契機(jī),但在研究過(guò)程中也發(fā)現(xiàn)快速鑒定方法存在一定程度的不足或缺陷,阻礙了快速鑒定的推廣應(yīng)用。有學(xué)者指出目前口岸實(shí)驗(yàn)室仍然要以常規(guī)形態(tài)鑒定為主,即形態(tài)學(xué)鑒定在檢疫性實(shí)蠅鑒定中起主導(dǎo)作用,分子生物學(xué)鑒定技術(shù)應(yīng)作為極好的補(bǔ)充[47-48]。在實(shí)踐中每一種實(shí)驗(yàn)技術(shù)和方法都有其優(yōu)勢(shì)和缺陷,只有仔細(xì)研究并在實(shí)際運(yùn)用中注意取長(zhǎng)補(bǔ)短才能發(fā)揮最大的作用。伴隨著分子生物學(xué)及相關(guān)學(xué)科的飛速發(fā)展與突破,例如基因芯片等新技術(shù)層出不窮并取得應(yīng)用,建立和推廣檢疫性實(shí)蠅的一系列快速鑒定方法必將成為全球性趨勢(shì)?；蛐酒墙臧l(fā)展起來(lái)的新型高通量檢測(cè)技術(shù),它是將核酸片段作為識(shí)別分子,按預(yù)先設(shè)置的排列固定于特定的固相支持載體的表面形成微點(diǎn)陣,利用反向固相雜交技術(shù),將標(biāo)記的樣品分子與微點(diǎn)陣上的核酸探針雜交來(lái)實(shí)現(xiàn)雜交反應(yīng),通過(guò)特殊的檢測(cè)系統(tǒng)來(lái)高通量分析檢測(cè)樣品中多個(gè)基因的表達(dá)狀況或特定基因分子[49]?；蛐酒瑱z測(cè)技術(shù)成熟后很快就被應(yīng)用到檢疫性實(shí)蠅快速鑒定的研究中,李文芬等采用mtDNA COⅠ分子標(biāo)記基因篩選獲得通用引物P3和P5并設(shè)計(jì)地中海實(shí)蠅及其近緣種芯片檢測(cè)探針8條,其中特異性檢測(cè)探針可十分準(zhǔn)確地將不同蟲態(tài)和地理種群的地中海實(shí)蠅、非洲芒果實(shí)蠅和納塔爾實(shí)蠅區(qū)分和鑒定[50]。類似設(shè)計(jì)的4條橘小實(shí)蠅特異性探針可準(zhǔn)確鑒定橘小實(shí)蠅、楊桃實(shí)蠅、木瓜實(shí)蠅、菲律賓實(shí)蠅和芒果實(shí)蠅,依據(jù)這一技術(shù)建立的地中海實(shí)蠅及其近緣種和橘小實(shí)蠅復(fù)合種芯片為檢疫性實(shí)蠅快速鑒定提供了新的有效技術(shù)平臺(tái)[51]。

相信隨著植物檢疫與分子生物學(xué)之間的學(xué)科交叉、融合和發(fā)展,以電泳、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA、核酸序列分析和基因芯片為鑒定核心技術(shù)的檢疫性實(shí)蠅快速鑒定方法必然得到不斷完善和進(jìn)步。可以預(yù)見建立以高通量檢測(cè)為平臺(tái)的快速鑒定技術(shù)已成為今后研究的主要方向,檢疫性實(shí)蠅由傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定逐漸過(guò)渡到微量、快速和準(zhǔn)確的分子生物學(xué)鑒定已成為可能。

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