腫瘤骨轉移動物模型研究進展

劉福英

(河北醫(yī)科大學 河北省實驗動物重點實驗室，石家莊 050017)

腫瘤骨轉移動物模型研究進展

劉福英

(河北醫(yī)科大學 河北省實驗動物重點實驗室，石家莊 050017)

骨轉移是乳腺癌、前列腺癌及肺癌等腫瘤的常見并發(fā)癥，是預后不良的獨立危險因素。腫瘤骨轉移動物模型是研究骨轉移發(fā)生機制及評價治療策略的重要工具?，F(xiàn)對骨轉移動物模型的研究進展進行綜述。

腫瘤;骨轉移;模型，動物

骨轉移是惡性腫瘤的常見并發(fā)癥，主要見于乳腺癌、肺癌及前列腺癌，發(fā)生率在70%左右。骨轉移發(fā)生后一般會引起溶骨性病變，即造成骨丟失、骨痛、高鈣血癥、骨折、神經(jīng)壓迫及運動喪失等癥狀［1］。有關骨轉移發(fā)生的機制還不確切;另外，骨轉移發(fā)生后一般是不能治愈的，是導致腫瘤患者死亡的重要原因之一。因此，研制骨轉移動物模型對于深入研究腫瘤骨轉移發(fā)生機制及新的治療方法有重要意義。建立的骨轉移動物模型應具備如下兩個特點:(1)與人類腫瘤骨轉移過程相似;(2)模型易于建立、具有可重復性，成瘤時間一致，且成瘤后存活時間較長。

由于自發(fā)腫瘤的骨轉移發(fā)生率較低，腫瘤骨轉移的轉基因動物制備方法還不成熟，因此，腫瘤骨轉移模型一般采用腫瘤移植的方法，即將來源于自發(fā)性或誘導性動物或人類腫瘤細胞株，通過原位或異位移植，制備動物模型。該模型的優(yōu)點是成本低、周期短、成瘤時間一致。

1 腫瘤細胞“親骨”的分子基礎

骨特殊的解剖結構和分子特征是腫瘤發(fā)生骨轉移的重要原因。骨的干骺端擁有豐富的竇狀結構，且血流流動緩慢，為腫瘤細胞與內(nèi)皮細胞間的相互作用及腫瘤細胞在骨髓中集落形成提供了保證［2］。更為重要的是，骨髓中的造血祖細胞及成纖維細胞表達VEGFR-1(血管內(nèi)皮生長因子-1)、整合素配體及纖維結合蛋白的受體，這些分子的表達為腫瘤細胞的遷徙提供了合適的環(huán)境［3，4］。此外，各種生長因子、細胞因子如內(nèi)皮素、TGF-β、IL-1、IL-6及IL-8通過旁分泌的方式調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長。表達于骨髓間質(zhì)細胞的受體如尿激酶受體(uAPR)、血管細胞粘附分子(VCAM-1)、纖維結合蛋白等通過與腫瘤細胞高表達的相應配體結合，促進了骨髓中腫瘤細胞集落的形成［5，6］。細胞外基質(zhì)蛋白，特別是I型和IV型膠原蛋白、玻璃粘連蛋白、骨橋蛋白、骨唾液蛋白、骨結合素等，作為腫瘤細胞的趨化因子，對腫瘤細胞集落的形成起著重要作用［7，8］。

骨基質(zhì)是多種潛在生長因子的儲存庫，如胰島素樣生長因子、TGF-β、血小板衍生生長因子及血管內(nèi)皮生長因子等，這些因子在骨的再建過程中釋放，可促進最初腫瘤細胞克隆增殖;如果在溶骨及成骨細胞損傷過程中釋放這些因子，可刺激腫瘤細胞惡性生長并引起骨的損傷。

根據(jù)X光透視結果，骨轉移造成的骨損傷分為溶骨型和成骨細胞型，骨轉移表型與腫瘤細胞與骨髓微環(huán)境中的破骨細胞和成骨細胞的相互作用有關。細胞因子類型可決定骨損傷的類型。如人前列腺癌因高表達與溶骨損傷有關的細胞因子IL-1、RANKL、TNF-α，這些細胞因子參與破骨細胞的分化和激活。另外，人前列腺癌細胞分泌骨保護素、TGF-β，則會形成成骨細胞損傷［9］。

2 腫瘤移植骨轉移動物模型

腫瘤移植骨轉移動物模型即用已建立的人/鼠腫瘤細胞株種植于免疫缺陷動物體內(nèi)(裸鼠或SCID小鼠等)所建立的動物模型。按照種植的途徑不同可分為:通過血流播散制作的骨轉移模型;局部注射制備的骨轉移模型;腫瘤原位種植骨轉移模型。

2.1 通過血流播散制作的腫瘤骨轉移模型

2.1.1 骨靶向性亞克隆腫瘤細胞株的篩選:不論是人源性還是動物源性腫瘤細胞株，雖然可以篩選出有較高骨轉移傾向的細胞株用于建立模型，但在實際應用中，尤其通過全身或原位接種時，不一定能全部發(fā)生骨轉移。如乳腺癌MDA-MB-231及MDAMB-435細胞株能使30%～90%的動物形成骨轉移模型，但該模型還可同時伴有腦、卵巢和腎上腺的轉移;還有前列腺癌細胞株 RM1，除了有骨轉移傾向外，還可向不同軟組織轉移。骨靶向性亞克隆技術較好地解決了這一問題。其理論基礎為，骨轉移處的腫瘤細胞與原發(fā)灶處的腫瘤細胞在表型和多個免疫指標的檢測中都有所不同，可能是腫瘤細胞為不斷調(diào)整和適應骨微環(huán)境而出現(xiàn)表型變化，或者原發(fā)腫瘤中包含有骨特異性轉移的亞群。而亞克隆技術通過人為給予骨微環(huán)境的刺激，在此壓力下誘導或篩選出骨靶向性亞克隆細胞株。親代細胞株和亞克隆細胞株有一定區(qū)別，總趨勢顯示移植瘤在逐漸惡化，骨轉移能力在逐漸增強。以目前研究較多的MDA-MB-231骨亞克隆(MDA-231-B)為例，將親代的 MDA-MB-231細胞注入裸鼠左心室后，引起骨轉移的組織于體外擴增篩選，再注入裸鼠左心室，如此反復幾個循環(huán)后，即可獲得骨高轉移能力的腫瘤細胞株。

另外，常用的動物源性乳腺癌細胞株是來源于BALB/c小鼠的乳腺癌細胞株4T1、TM40D。將該細胞株經(jīng)體內(nèi)反復傳代并進行亞克隆化，得到穩(wěn)定的可移植的骨轉移細胞株。使用動物源性乳腺癌細胞移植模型的優(yōu)點是接種動物免疫功能正常，符合臨床情況，費用較裸鼠或SCID動物模型低，且解決了細胞移植所帶來的免疫排斥反應問題，尤其可用于研究腫瘤轉移過程中的免疫相關機制和免疫細胞的過繼治療等，缺點是種系要求嚴格，必須是同系或同種受體動物。

2.1.2 靜脈注射法:靜脈注射法與臨床上骨轉移產(chǎn)生機制不符，以前很少使用。但最近 Teres等［10］報道，將MDA-MB-231細胞株在裸鼠體內(nèi)連續(xù)多次傳代后，篩選出多株不同細胞克隆，給這些細胞克隆轉染熒光素酶報告基因，通過活體成像技術發(fā)現(xiàn)，B02克隆株與其它細胞克隆不同，該細胞株具有快速形成溶骨型骨轉移的能力。實驗發(fā)現(xiàn)將B02通過小鼠尾靜脈注射后，10 d即可形成明顯的骨轉移。與其它MDA-MB-231平行的細胞系相比，研究組成員發(fā)現(xiàn)B02細胞株表達促進骨轉移的基因表達標簽，即骨轉移能力強的B02細胞株與MDA-MB-231相比，有14個基因表達上調(diào)，而有44個基因表達下調(diào)。另外，Otsuka等［11］報道，將肺癌細胞株ACC-LC-319/bone2靜脈注射到SICD小鼠，經(jīng) X光檢查發(fā)現(xiàn)，溶骨性病變出現(xiàn)在28 d，成骨性病變出現(xiàn)在35 d。

2.1.3 心臟注射法:左心室注射法產(chǎn)生的骨轉移模型與腫瘤患者骨轉移灶無論在生長狀況還是形態(tài)學上都非常相似，是目前最常用的方法之一。該模型不僅有許多優(yōu)點，還符合Paget提出的“種子與土壤學說”:腫瘤細胞充當“種子”，骨髓腔微環(huán)境充當“土壤”。支持該學說的證據(jù)有:腫瘤細胞經(jīng)左心室注射后，一些細胞在骨微環(huán)境中選擇性生長進而形成骨轉移瘤;抑制溶骨反應可以抑制轉移腫瘤的生長。利用該方法制備的模型的缺點是引起腦、肺、腎上腺皮質(zhì)等的多發(fā)性轉移，還可造成某些實驗鼠骨轉移尚未出現(xiàn)而因其它的轉移灶致死。

最近 Power等［12］報道了用正常有免疫功能的小鼠，采用心臟注射方法成功制備了前列腺癌骨轉移模型。研究者首先將前列腺癌細胞株RM1注射到小鼠心臟，然后從該小鼠的骨組織中分離腫瘤細胞，再將該細胞株注射到小鼠心臟，繼續(xù)從骨中分離腫瘤細胞，如此反復三次，得到一株骨轉移率高、且在軟組織轉移率低的腫瘤細胞株 RM1(BM)。95%的C57BL/6小鼠在腫瘤注射后3周左右出現(xiàn)骨轉移。組織學及 X線斷層術檢查發(fā)現(xiàn)，RM1(BM)腫瘤細胞株形成的骨轉移屬于溶骨型，但有明顯的成骨細胞的改變。另外，體外試驗進一步發(fā)現(xiàn)RM1(BM)腫瘤細胞高表達E-cadherin(上皮細胞鈣粘蛋白)，但不表達彈性蛋白(vimentin)。

2.1.4 局部血管注射制備的骨轉移模型:近年來，有學者提出建立特定部位骨轉移的動物模型。Neudert等［13］報道在裸大鼠一側下肢動脈結扎后將MDA-MB-231細胞灌注入股動脈，形成下肢溶骨性病灶，但有50%的病灶在注射42 d后出現(xiàn)自發(fā)性緩解。Bauerle等［13］改進方法，利用裸大鼠股動脈分支及其血供分布特點，將MDA-MB-231細胞注入一側下肢股動脈與髂動脈的交通支即腹壁淺動脈，阻斷股動脈血流后通過腹壁淺動脈改變血流方向，使腫瘤細胞進入營養(yǎng)膝關節(jié)和小腿血供的膝降動脈和腘動脈。93%動物接種3～4周出現(xiàn)明顯的骨轉移。

2.2 局部骨內(nèi)注射制作骨轉移模型

該法將針尖直接刺透骨皮質(zhì)，將移植腫瘤細胞注入脛骨或股骨的骨干。具有致瘤率高、制作方法簡單、不受臟器轉移影響等優(yōu)點。缺點是造成了骨皮質(zhì)和骨髓腔的損傷，且所制作的模型主要為骨干轉移，與臨床上常見的骨骺端轉移不同。骨內(nèi)注射方法常被用來制作成骨性或成骨/溶骨混合性骨轉移模型［14］。常見于前列腺癌骨轉移模型，如給免疫缺陷小鼠的脛骨內(nèi)注入人前列腺癌細胞系CWR22成功地制作出前列腺癌骨轉移模型［15］，與臨床前列腺癌骨轉移進展比較類似，為研究骨轉移發(fā)生機制和藥物療效提供了一個極具價值的模型工具。還有人采用經(jīng)股骨內(nèi)直接注射法，在裸鼠前列腺癌LNCaP骨轉移率為0%(0/8)，而在SCID小鼠中其骨轉移率為75%(6/8)。因此免疫缺陷鼠比裸鼠更容易產(chǎn)生骨轉移灶。

2.3 腫瘤原位移植模型

原位移植是指將乳腺癌或前列腺癌細胞或組織塊種植于裸鼠胸壁的乳腺脂肪墊內(nèi)或前列腺組織從而發(fā)生骨轉移。用該方法形成的骨轉移模型保留了從腫瘤原發(fā)灶到骨轉移的完整過程，是研究乳腺癌骨轉移發(fā)生機制的最佳方法。理論上小鼠乳腺癌細胞系所形成的原位接種骨轉移模型與臨床狀況極為相似，因這種模型可在非免疫缺陷鼠體內(nèi)復制，且骨轉移均為自發(fā)形成，唯一的區(qū)別在于采用小鼠乳腺癌細胞系。該模型對于研究乳腺癌發(fā)生機制及治療對策的評價均有重要價值。但該復制方法也存在缺點，即與上述介紹的血流播散、骨內(nèi)注射等方法相比，骨轉移的發(fā)生率偏低，且伴有其他臟器的轉移。

相對于乳腺癌原位骨轉移模型，前列腺癌原位骨轉移模型則較成功。Zhau等［16］報道，將人前列腺癌細胞種植于小鼠前列腺原位，在體內(nèi)成功地形成了前列腺進展的不同階段模型:前列腺癌雄激素依賴性生長，雄激素非依賴(但敏感)生長，雄激素非敏感生長，雄激素阻礙生長階段，最終形成腫瘤轉移，其中包括骨轉移。前列腺原位注射腫瘤細胞懸液，骨轉移發(fā)生率較低，而瘤塊前列腺原位(SOI)種植則更易于形成骨轉移灶。因此，一般先將前列腺癌細胞給小鼠皮下注射，待腫瘤塊形成后，將瘤塊切下并切割成1mm3的小塊，包埋于前列腺包膜下而形成原位腫瘤和骨轉移瘤。該方法制備的骨轉移模型是一種比較完善的前列腺癌骨轉移模型，它保留了從腫瘤原發(fā)灶到骨轉移的完整過程，為研究前列腺骨轉移提供了可靠的實驗手段。

2.4 其他類型腫瘤骨轉移模

將人骨移植給NOD/SCID小鼠，人骨在小鼠體內(nèi)可存活20周以上。這種攜帶人骨的NOD/SCID小鼠，為人源細胞株提供了生存環(huán)境［17］。已觀察到有幾種乳腺癌細胞株可在人骨-NOD/SICD系統(tǒng)內(nèi)生長，但不同細胞株的行為不完全一樣。人們用穩(wěn)定轉染綠色熒光蛋白(GFP)的乳腺癌細胞株GFPMDA-MB-231觀察到，該細胞株可特異性地轉移到植入的骨在組織。

最近利用人骨-SICD系統(tǒng)制備骨轉移模型的方法有了新的進展［18］。具體方法是，給 SICD小鼠在背部皮下移植人骨，然后將1×106人乳腺癌干細胞樣細胞的一個亞克隆細胞株(表型為 CD44+/CD24lower)和1×106人乳腺癌 MDA-MB-231細胞株分別通過尾靜脈注射。CD44+/CD24lower表型代表了一個小的乳腺癌亞型，該亞型具有很強的自我更新的潛能，且表現(xiàn)出高的親骨能力。該方法制備的荷瘤小鼠的骨轉移率高達77.8%，且沒有發(fā)現(xiàn)伴有其他部位的轉移。進一步研究發(fā)現(xiàn)，將女性股骨頭內(nèi)有活性的松骨質(zhì)植入T、B及NK缺陷的SICD小鼠，4周內(nèi)移植的人骨可建立起人骨血液循環(huán)，骨活性保持8周以上，成為人源性骨轉移的“土壤”。因此，“人源性”乳腺癌轉移小鼠模型的人骨轉移發(fā)生率優(yōu)于“非人源性”乳腺癌轉移小鼠模型。人源性乳腺癌細胞親人骨轉移的機制，應與人骨中的人源性成骨細胞、破骨細胞、骨基質(zhì)細胞等分泌的骨趨化因子誘導人乳腺癌細胞定向轉移到人骨有關。

3 小結

腫瘤骨轉移動物模型依然是研究腫瘤骨轉移的分子機制、骨轉移防治及病理不可或缺的必要工具。很顯然，骨髓微環(huán)境中不同細胞(包括內(nèi)皮細胞、間質(zhì)細胞、造血細胞及骨細胞)之間的相互作用，對于腫瘤細胞在骨中定位和克隆形成具有重要作用。骨轉移是一非常復雜的過程，涉及許多基因參與，因此，后續(xù)的工作應利用現(xiàn)有的骨轉移動物模型，通過基因組學和蛋白組學的方法對涉及腫瘤骨轉移的基因進行鑒定，以發(fā)現(xiàn)可用于骨轉移早期診斷及防治的靶子。

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The Research Progress for Animal Models of Bone Metastasis

LIU Fu-ying
(Hebei Key Lab of Laboratory Animal Science，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050017，China)

Bone metastasis is not only a common complication for breast cancer，prostatic carcinoma as well as lung cancer，but also a independent risk factor of prognosis mala for tumor patients.Animal models of bone metastasis are important tools for researching the bone metastasis mechanisms and evaluating the therapy strategies.A summary was done for the progress of animal models of bone metastasis.

Tumor;Bone metastasis;Model，animal

R73

A

1671-7856(2010)07-0001-04

2010-01-25

劉福英，男，教授，主要研究方向:實驗動物管理及人類疾病動物模型。E-mail:lfy5579@126.com