牛AMPK家族基因的研究進展

石秀英,房興堂,張春雷,陳 宏＊,2

(1.徐州師范大學生命科學學院,細胞與分子生物學研究所,江蘇徐州221116;2.西北農(nóng)林科技大學動物科技學院,陜西省農(nóng)業(yè)分子生物學重點實驗室,陜西楊凌712100)

1973年,Berg和Carlson等報道了一個與羥甲基戊二酸單酰CoA還原酶相關的蛋白激酶,隨后的研究表明,其活性受AMP(一磷酸腺苷)的調(diào)節(jié),故稱為AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)[1]。AMPK在真核細胞生物中廣泛存在,能感知細胞能量代謝狀態(tài)的改變,并通過影響細胞物質(zhì)代謝的多個環(huán)節(jié)維持細胞能量供求平衡。近年來研究發(fā)現(xiàn),AMPK在下丘腦攝食調(diào)控中起作用,激活 AMPK促進攝食,抑制 AMPK引起厭食[2,3]。

1 AMPK的結構

1.1 AMPK的結構及分布

AMPK作為能量調(diào)節(jié)器的最重要特征是它對細胞內(nèi)能量狀態(tài)的高敏感性,而這種性質(zhì)是由它獨特的生化結構決定的。1998年 Hardie等總結了AMPK的分子結構[4]。AMPK是一個異源三聚體蛋白,由催化亞單位α和調(diào)節(jié)亞單位β、γ構成,每個亞單位都是AMPK的活性所必需的。α和β亞單位各由兩個基因編碼(α1,α2和β1,β2),而γ亞單位則由三個基因編碼(γ1,γ2和γ3)。α亞單位的N末端是起催化作用的核心部位,含有一個典型的絲/蘇氨酸蛋白激酶的催化區(qū)域,C末端則主要負責活性的調(diào)節(jié)以及聯(lián)系β和γ亞單位[5]。α1由548個氨基酸組成,其中Thr172是一磷酸腺苷激活蛋白激酶的激酶(AMPKK)磷酸化位點,它是AMPK活性的關鍵;α2由554個氨基酸組成。α1在哺乳動物組織中分布較為廣泛,α2主要分布在骨骼肌、心臟和肝臟中[6]。β亞單位則好似一個支架,它可把α和γ亞單位連接起來[7]。β亞單位包含兩個保守區(qū)域,分別位于中心和C端,β亞單位C末端的保守結構域是形成三聚體的關鍵,是與α和γ亞單位結合的區(qū)域;而N末端含有N-異淀粉酶區(qū)域,稱作糖原結合域,其功能可能與糖原對AMPK的調(diào)節(jié)有關。β1具有廣泛的組織分布性,而β2主要分布在骨骼肌、心臟和胰腺中[8]。γ亞單位有4個串行重復的CBS(胱硫醚-β-合成酶 ,cystathionine-beta-synthase)區(qū)域,每個串聯(lián)重復序列由60個氨基酸構成,被命名為CBS模序,每一對CBS結構域可以形成一個有功能的Bateman域,可以結合一分子的AMP[9,10]。γ1和γ2分布較廣,而γ3只特異性地在骨骼肌中表達。

1.2 牛AMPK家族基因結構特征

McKay等對牛5′AMPK基因家族7個基因進行了研究,他們是 PRK AA1、PRK AA2、PRKAB1、PRK AB 2、PRK AG1、PRKAG2和PRKAG3,并初步將其分別定位于牛 20、3、17 、3、5 、4和2號染色體上[11]。牛PRKAB1共有7個外顯子,編碼的氨基酸全長為496個。Sazanov等用熒光原位雜交(FISH)分析將牛PRKAG1基因定位于5q21-q22上[12]。后來McKay等用全基因組輻射雜交圖譜證實了這一結論,Benkel等確定了牛PRKAG1基因的結構,其序列包括12個外顯子和11個內(nèi)含子[13]。各物種的PRKAG3基因序列都包含13個外顯子和12個內(nèi)含子[14]。Yu等運用韓國牛BAN文庫,確定了牛PRKAG3基因的結構和序列,PRKAG3基因包括13個外顯子,總長度約有 6.8 kb,編碼的氨基酸全長為465個,用Northern雜交分析證明牛與其他物種相似,且牛的PRKAG3基因也只在骨骼肌中表達[15]。Roux等分析了3個品種牛的PRKAG3基因序列及蛋白質(zhì)序列,確定了牛PRKAG3基因包括13個編碼外顯子,和一個3'非編碼外顯子,在豬中影響肉質(zhì)的突變位點在牛中突變頻率較低[16]。因而初步推斷牛PRKAG3基因也可能與肉質(zhì)有關。

2 AMPK的功能

2.1 AMPK活性的調(diào)節(jié)

AMPK的活性主要受細胞中AMP/ATP比值的調(diào)節(jié)。此外,AMPK的活性也受酶的調(diào)節(jié),目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)AMPK的上游激酶有兩種:腫瘤抑制蛋白LKB和兩個附屬亞單位STRAD和MO25形成的復合體;鈣調(diào)蛋白依賴蛋白激酶激酶(CaMKK)。下游激酶已發(fā)現(xiàn)達數(shù)十種。人工合成的激動劑也能夠使AMPK活化,目前研究最為廣泛和深入的是5-氨基-4-甲酰氨咪唑核糖核苷酸(AICAR)。然而AICAR并非AMPK的特異性激動劑。AICAR是一種腺苷類似物,能夠被細胞攝取,在腺苷激酶的磷酸化作用下形成一磷酸衍生物5-氨基咪唑-4-氨甲酰核苷(ZMP),具有AMP樣作用,而ZMP也能夠影響其他AMP調(diào)節(jié)的酶(磷酸酯酶,果糖-1,6-二磷酸酶)的活性。盡管AMP/ATP比值升高是激活AMPK的經(jīng)典途徑,但許多激素、細胞因子都參與了AMPK信號途徑,如瘦素、抵抗素、脂聯(lián)素、二甲雙胍和羅格列酮等也可激活AMPK。瘦素是由脂肪細胞分泌的激素,在調(diào)節(jié)脂肪酸氧化、葡萄糖攝取及阻止脂質(zhì)在非脂肪組織聚積中起重要作用,有研究表明瘦素可能是通過AMPK對代謝起調(diào)節(jié)作用的。脂聯(lián)素是一種對抗糖尿病胰島素抵抗的激素,來自脂肪細胞,具有調(diào)節(jié)能量代謝、葡萄糖和脂肪代謝的作用。

2.2 AMPK對物質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)

在哺乳動物中,AMPK的活性與細胞能量水平密切相關。AMP/ATP比率的增加,能促使AMPK得到激活。AMPK被激活則ATP消耗的途徑將被關閉,而ATP生成的途徑將被開啟。近來的研究表明,AMPK可能在更大范圍內(nèi)對全身的能量代謝起重要的調(diào)節(jié)作用。

2.2.1 AMPK對脂質(zhì)代謝的作用 AMPK激活后不僅能增加脂肪酸氧化,而且還有抑制脂肪合成的作用。AMPK 活化使β-羥基-β-甲基-戊二酸單酰輔酶A還原酶(HMGR)和乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合成酶(FAS)以及甘油磷酸?；D(zhuǎn)移酶(GPAT)磷酸化失活,從而抑制膽固醇和脂肪酸的合成[17,18]。AMPK對脂質(zhì)的另一調(diào)節(jié)途徑表現(xiàn)在對激素敏感脂酶(HSL)的作用上。

2.2.2 AMPK對糖代謝的作用 AMPK調(diào)節(jié)葡萄糖攝取可能通過兩種方式起作用:促進葡萄糖轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)位和葡萄糖轉(zhuǎn)運子(GLUT)表達增加[19]。Halse在對離體骨骼肌細胞的研究中發(fā)現(xiàn) AMPK不僅促使葡萄糖攝取,還抑制糖原的合成,從而促進葡萄糖向糖酵解方向轉(zhuǎn)化。大量研究結果表明,用不同方法活化AMPK可以增加肌細胞對葡萄糖的攝取,其機制可能是由于激活葡萄糖轉(zhuǎn)運體GLUT1和GLUT4所致。AMPK的激活引起糖酵解的限速酶-磷酸果糖-2-激酶(PFK2)磷酸化,刺激2,6-二磷酸果糖產(chǎn)生,從而促進糖酵解產(chǎn)生更多ATP。此外,AMPK的活化還能減少糖異生酶(如1,6-二磷酸果糖激酶、烯醇化酶)的表達,抑制糖異生,以及通過磷酸化糖原合成酶(GS)抑制糖原的合成[20]。

2.2.3 AMPK對蛋白質(zhì)代謝的作用 AMPK對蛋白質(zhì)合成代謝的抑制作用體現(xiàn)在對真核延長因子(eEF-2)激酶和哺乳動物的雷帕霉素靶體(mTOR)的作用上。eEF-2是蛋白質(zhì)合成中肽鏈延伸所必需,可調(diào)節(jié)蛋白的轉(zhuǎn)錄,參與肽鏈的延長,其活性可被eEF-2激酶通過磷酸化而抑制。而AMPK可能通過激活eEF-2激酶,使eEF-2磷酸化失活,導致蛋白質(zhì)合成受到抑制。mTOR作為胞漿內(nèi)的激酶,是蛋白質(zhì)翻譯中的重要調(diào)節(jié)物,生長因子可激活它,而營養(yǎng)撤除可抑制其介導的信號通路。有研究表明,AMPK和mTOR信號通路相關聯(lián),活化的AMPK通過抑制mTOR及其效應器的活性,并增加eEF2的磷酸化,從而抑制蛋白質(zhì)合成[21]。

2.2.4 對膽固醇合成的調(diào)節(jié) 3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶是膽固醇合成的關鍵酶。ATP減少時,AMPK激活使HMG-CoA還原酶的ser871位磷酸化而失活,因而膽固醇合成減少。有報道稱細胞與纖維粘連蛋白(Fn)分離后激活AMPK,HMG-CoA還原酶受抑制,使細胞膜膽固醇合成減少,Fn附著細胞則相反[22]。

2.2.5 AMPK與動物應激情況下動物代謝的關系AMPK在動物應激(生理、營養(yǎng)、環(huán)境和疾病等)過程中起著重要作用[23]。動物生產(chǎn)過程中,機體常遭受到來自外環(huán)境和生理因素的多種應激,而不管是外界應激還是自身應激因素,都會給機體造成重大的影響,輕者造成采食量下降,生產(chǎn)性能降低,重者導致死亡。雖然目前仍缺乏這方面的試驗證據(jù),但可以推斷AMPK在該過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。應激條件下,AMPK被激活,抑制機體合成代謝,促進分解代謝,從而導致生長速率下降甚至失重。根據(jù)AMPK存在的廣泛性、進化的保守性和功能的專一性,不難假設,AMPK也與家畜應激的調(diào)節(jié)有關。高產(chǎn)奶牛的酮病,可能與應激使AMPK的活化有關。

3 牛AMPK家族基因的研究現(xiàn)狀

3.1 AMPK家族基因遺傳多態(tài)性的研究

Zhang等在4個牛品種PRKAB1基因7個外顯子及外顯子-內(nèi)含子區(qū)發(fā)現(xiàn)29個單核苷酸多態(tài)性(SNPs):4個位于5'-UTR;8個位于編碼區(qū),包括1個無義突變,1個錯義突變,6個同義突變;17個位于內(nèi)含子區(qū)。此外在啟動子區(qū)發(fā)現(xiàn)了 12個SNPs和一個 10 bp的插入和一個 4 bp的缺失[24,25]。Benkel等在三個優(yōu)秀的肉牛品種中,檢測了PRKAG1基因外顯子9到11的序列,在內(nèi)含子10中發(fā)現(xiàn)4個SNPs[13]。Yu等在PRKAG3基因四個牛品種中發(fā)現(xiàn)7個SNPs。Roux等在3個牛品種中共發(fā)現(xiàn)了PRKAG3基因的32個SNPs,其中13個位于編碼區(qū),1個位于3'非翻譯區(qū),18個位于內(nèi)含子中。5個導致了氨基酸的改變,且位于編碼區(qū)等位基因突變的頻率較低。在該基因的兩個位置上發(fā)現(xiàn)了可變剪切位點,導致了群體中出現(xiàn)異種蛋白[26]。McKay等利用混合測序法在牛PRKAG3外顯子2中發(fā)現(xiàn)2個突變其中1個同義突變和1個無義突變。

3.2 AMPK家族基因在其他方面的研究

Zhang等關于AMPK家族基因不同物種間密碼子使用頻率的研究顯示,基因的功能是決定密碼子使用偏好性的優(yōu)勢因子,而物種差別只是很小的因素[27]。Benkel等的研究表明牛AMPKγ1蛋白編碼區(qū)其核苷酸序列與人和鼠的同源性分別為93%和90%,而牛AMPKγ1蛋白的氨基酸序列與人和鼠的一致性分別為98%和95%[11]。Roux等的研究結果表明牛AMPKγ3蛋白與人、豬和鼠的一致性分別為84%、83%和81%[26]。

4 AMPK家族基因的應用前景

AMPK廣泛存在于真核細胞中,哺乳動物的AMPK屬于高度保守的蛋白激酶家族,它是蛋白激酶級聯(lián)系統(tǒng)中的中心元件,在調(diào)節(jié)能量代謝的信號轉(zhuǎn)導機制中起著樞紐作用。AMPK在功能上的特點及進化上的保守性,說明該酶系在生物的遺傳與進化過程中起重要作用,有研究顯示在其他物種上的一些突變,可以改變AMPK的信號傳導和多個代謝途徑,也可推斷其在牛上亦有相同的作用,通過對其代謝的影響進一步影響其生長狀況;應激條件下,AMPK被激活,機體合成代謝受抑制,分解代謝加快,從而生長速率下降甚至失重;該基因在其他物種上與疾病的相關性,也可以認定為是牛抵抗疾病的候選基因;AMPK在下丘腦攝食調(diào)控中起作用,激活AMPK促進攝食,抑制AMPK引起厭食,從這一研究結果可以推測AMPK的突變也可能會對牛的體重產(chǎn)生影響。此外,人工激活劑AICAR可以通過激活AMPK進而對牛卵母細胞的核成熟有抑制作用[28],這一結果可以較好的為牛業(yè)同期發(fā)情處理提供理論資料。隨著對AMPK研究的日趨深入,人們對AMPK的功能已經(jīng)有很多方面的了解。在牛上對該基因的研究及其對功能的驗證,可以促進其對生產(chǎn)的指導作用,進一步為動物的遺傳育種提供理論依據(jù)。當然,目前階段的研究尚不成熟,還需要進行進一步的研究,尤其是與生產(chǎn)性能相關的研究報道很少。

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