生產(chǎn)聚羥基脂肪酸酯的微生物細(xì)胞工廠

李正軍，魏曉星，陳國強

清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100084

聚羥基脂肪酸酯 (Polyhydroxyalkanoates，PHA)是一類廣泛存在于微生物細(xì)胞內(nèi)的高分子生物聚酯，一般主要作為碳源和能量的貯藏物質(zhì)[1-2]。儲存型的PHA以疏水性顆粒的形式存在，在一定條件下其含量可以超過細(xì)胞干重的 90%[3]。從化學(xué)結(jié)構(gòu)上講，PHA是羥基脂肪酸 (Hydroxyalkanoic acid，HA)的聚合物，結(jié)構(gòu)通式如圖 1所示，分子量一般為幾萬至幾百萬，不同的PHA及其單體具有不同的側(cè)鏈R基團。根據(jù)單體組成的不同，PHA具有從堅硬質(zhì)脆的硬塑料到柔軟的彈性體等一系列不同的材料學(xué)性質(zhì)。PHA可以由生物可再生資源為原料合成，進入自然界后可以被細(xì)菌等生物完全降解，其替代傳統(tǒng)的不可降解的塑料可以緩解嚴(yán)重的“白色污染”問題，從而引起世界各國科學(xué)界和工業(yè)界的廣泛重視[4-6]。

圖1 PHA的結(jié)構(gòu)通式Fig. 1 General structure of polyhydroxyalkanoates. m=1?4, n=100?30 000, R=alkyl groups C1～C15.

1 野生菌中的PHA生產(chǎn)

1.1 PHA的生物合成途徑

很多細(xì)菌能夠在自然條件下積累PHA，其生物合成途徑主要有3條 (圖2)，所需的酶及其底物特異性各有不同[3]。根據(jù)合成途徑的不同和相關(guān)酶的底物特異性，PHA的單體結(jié)構(gòu)也多種多樣，其中3-羥基脂肪酸單體包括了3-羥基丙酸到3-羥基十六酸的所有成員，此外還有 4-、5-、6-羥基脂肪酸以及含有不飽和鍵、帶有甲基側(cè)鏈或者其他功能基團的3-羥基脂肪酸作為PHA單體的情況[7]。

1.1.1 由乙酰輔酶A合成PHB途徑

聚 3-羥基丁酸酯 (Polyhydroxybutyrate，PHB)是結(jié)構(gòu)最簡單、最早被發(fā)現(xiàn)的PHA成員，其生物合成途徑以羅氏真養(yǎng)菌Ralstonia eutropha為代表 (圖2)。糖類碳源經(jīng)過糖酵解途徑生成乙酰輔酶 A，β-酮基硫解酶PhaA催化2個乙酰輔酶A縮合形成乙酰乙酰輔酶A，然后在NADPH依賴的乙酰乙酰輔酶A還原酶PhaB的作用下還原為(R)-3-羥基丁酰輔酶A，最后由PHA合酶PhaC聚合成PHB[8-9]。

1.1.2 由脂肪酸β-氧化途徑合成PHA

以銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa和豚鼠氣單胞菌Aeromonas caviae為代表的細(xì)菌能利用脂肪酸的β-氧化途徑合成PHA (圖2)。β-氧化途徑的中間產(chǎn)物烯脂酰輔酶A在水合酶PhaJ的催化下形成(R)-3-羥基脂酰輔酶 A，再由 PHA合酶聚合成PHA[3]。

圖2 PHA的生物合成途徑Fig. 2 Polyhydroxyalkanoate (PHA) synthesis pathway. PhaA: β-ketothiolase; PhaB: NADPH-dependent acetoacetyl-CoA reductase; PhaC: PHA synthase; PhaG: 3-hydroxyacyl- ACP:CoA transacylase; PhaJ: enoyl-CoA hydratase; FadD: acyl-CoA synthase; YafH: fatty acyl-CoA dehydrogenase.

1.1.3 由脂肪酸從頭合成途徑合成PHA

以惡臭假單胞菌Pseudomonas putida為代表的細(xì)菌，能夠利用脂肪酸從頭合成途徑合成 PHA (圖2)。乙酰輔酶 A進入脂肪酸的從頭合成途徑后，其中間產(chǎn)物(R)-3-羥基脂酰-ACP在?；D(zhuǎn)移酶 PhaG的催化下形成(R)-3-羥基脂酰輔酶 A，然后由 PHA合酶聚合成PHA[3]。

細(xì)菌合成PHA所利用的碳源中，結(jié)構(gòu)與PHA單體類似的被稱為相關(guān)碳源，如脂肪酸等；結(jié)構(gòu)與PHA單體不同的被稱為非相關(guān)碳源，如糖類碳源。很多細(xì)菌可以利用相關(guān)碳源合成包含有多種不同單體的PHA，如細(xì)菌可以利用3-羥基丙酸 (3HP)、4-羥基丁酸 (4HB) 和5-羥基戊酸 (5HV) 等相關(guān)碳源合成包含有3HP、4HB或5HV的PHA。

1.2 短鏈PHA的發(fā)酵生產(chǎn)

短鏈PHA (Short-chain-length PHA，scl PHA) 的單體碳原子個數(shù)在3～5個之間，主要包括聚3-羥基丁酸酯、聚3-羥基丁酸3-羥基戊酸酯 (PHBV) 和聚3-羥基丁酸4-羥基丁酸酯 (P3HB4HB) 等。R. eutropha是最常見的scl PHA生產(chǎn)菌，它能利用糖類碳源積累超過細(xì)胞干重80%的PHB，細(xì)胞干重可達(dá)200 g/L以上；當(dāng)添加丙酸或4-羥基丁酸等作為3HV或4HB的前體時，R. eutropha能夠合成 PHBV 或者P3HB4HB。廣泛產(chǎn)堿菌Alcaligenes latus也可以用來生產(chǎn)PHB或PHBV，其優(yōu)點是生長迅速，能利用蔗糖為碳源，但是PHB含量較低，一般只能達(dá)到細(xì)胞干重的50%左右。

1.3 中長鏈PHA的發(fā)酵生產(chǎn)

中長鏈 PHA (Medium-chain-length PHA，mcl PHA) 的單體碳原子個數(shù)在6～14之間。嗜油假單胞菌Pseudomonas oleovorans能夠利用烷烴為碳源合成mcl PHA，采用兩步法連續(xù)發(fā)酵，前期積累生物量，后期限制氮源供給積累PHA，能夠獲得超過細(xì)胞干重60%的mcl PHA，產(chǎn)率為1.1 g/(L·h)[10]。P. putida可以利用脂肪酸作為碳源合成 mcl PHA，采用脈動補料法，既可以防止碳源限制，又可以防止脂肪酸積累到可以產(chǎn)生抑制的濃度，36 h發(fā)酵可獲得生物量 131 g/L，PHA含量 59%，最大產(chǎn)率為2.3 g/(L·h)[11]。

1.4 短鏈中長鏈共聚PHA的發(fā)酵生產(chǎn)

短鏈中長鏈共聚PHA (scl-mcl PHA) 是指3HB與長鏈mcl 3HA單體 (C6～C14) 形成的共聚物，根據(jù)單體組成不同其性能可以從硬塑料到彈性體之間有很大調(diào)節(jié)空間。嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila可以利用超過12個碳原子的脂肪酸積累3-羥基丁酸和3-羥基己酸共聚酯 (PHBHHx)，Chen等[12]報道了在20 000 L的發(fā)酵罐中A. hydrophila兩步法培養(yǎng)生產(chǎn)PHBHHx的實驗，細(xì)胞最初在50 g/L的葡萄糖中培養(yǎng)，之后在50 g/L的月桂酸中限磷培養(yǎng)，最終培養(yǎng)46 h后得到的細(xì)胞干重和PHA含量分別為50 g/L、50%，共聚物中3HHx的單體含量為11 mol%。

2 PHA生物合成的代謝工程改造

2.1 利用輔酶工程提高PHB的生物合成

NADPH在胞內(nèi)主要作為氫的傳遞體參與生物合成反應(yīng)，例如氨基酸和脂肪酸的合成等。PHB的合成也需要 NADPH作為輔酶還原乙酰乙酰輔酶A (圖3)，胞內(nèi)可利用的NADPH的量是影響PHB合成的重要因素。Lee等在含有R. eutropha PHB合成基因的重組大腸桿菌中研究了NADPH對PHB生物合成的調(diào)節(jié)作用，包括復(fù)合Luria-Bertani (LB) 培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基加葡萄糖和化學(xué)培養(yǎng)基在內(nèi)的多種培養(yǎng)基被用于細(xì)菌培養(yǎng)，其中 LB加葡萄糖的培養(yǎng)基可以提供最高的[NADPH]/[NADH]，因此最利于PHB的積累[13-14]。在化學(xué)培養(yǎng)基中添加復(fù)合氮源、油酸或氨基酸等能夠明顯提高PHB的產(chǎn)量，由于氨基酸和油酸的生物合成需要消耗大量的還原力，因此重組大腸桿菌在化學(xué)培養(yǎng)基中生產(chǎn)PHB的效率與在復(fù)合培養(yǎng)基中相比要低很多[14]。

過表達(dá)磷酸戊糖途徑中產(chǎn)生NADPH的相關(guān)基因，包括葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因 zwf和 6-磷酸-葡萄糖酸脫氫酶基因 gnd (圖 3)，能夠提高胞內(nèi)[NADPH]/[NADP]的水平，從而促進PHB的合成，但是 NADPH濃度的提高抑制了檸檬酸合成酶的活性，使細(xì)胞生長也受到了抑制[15]。調(diào)控磷酸戊糖途徑中非氧化階段的關(guān)鍵酶也能促進PHB的合成，過表達(dá)轉(zhuǎn)醛醇酶基因talA使得重組大腸桿菌中PHB的含量由28.2%提高到了52.3%[16]，過表達(dá)轉(zhuǎn)酮醇酶基因tktA可以使PHB的合成提高1.7倍[17]。

嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶可以催化氫在NAD和NADP之間的轉(zhuǎn)化 (圖 3)，在細(xì)胞的生長代謝中起調(diào)控輔酶平衡的作用[18]。在重組大腸桿菌中過表達(dá)嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)氫酶基因udhA，能有效地提高PHB的產(chǎn)量，搖瓶實驗中，31 h培養(yǎng)后，過表達(dá)udhA的重組菌中PHB的產(chǎn)量為6.42 g/L，而對照菌僅為3.52 g/L[19]。NAD激酶催化NAD的磷酸化生成NADP，是胞內(nèi)NADP的唯一來源 (圖3)。Li等[20]的研究表明，在含有PHB合成途徑的重組大腸桿菌中，過表達(dá)NAD激酶基因yfjB能夠有效地提高胞內(nèi)輔酶NADP的水平，搖瓶實驗中，胞內(nèi)NADP的濃度提高了1.6～5.2倍。NADP濃度的提高促進了PHB的合成，6 L的發(fā)酵罐培養(yǎng)中，P3HB的產(chǎn)量提高了100%，碳源轉(zhuǎn)化率提高了76%。

圖3 重組大腸桿菌中PHB生物合成的輔因子代謝調(diào)控Fig. 3 Cofactor engineering of PHB synthesis in recombinant E. coli. PhaA: β-ketothiolase; PhaB: NADPH-dependent acetoacetyl-CoA reductase; PhaC: PHA synthase; Zwf: glucose-6-P dehydrogenase; Gnd: 6-P-gluconate dehydrogenase; UdhA: pyridine nucleotide transhydrogenase; YfjB: NAD kinase.

2.2 短鏈中長鏈共聚PHA的生產(chǎn)

Pseudomonas sp. 61-3和Pseudomonas stutzeri 1317的PHA合酶PhaC161-3和PhaC2Ps具有較低的底物特異性，能夠?qū)崿F(xiàn)不同鏈長的單體的聚合，得到短鏈中長鏈共聚PHA[21-22]。在PHA合成缺陷突變株R. eutropha PHB-4中表達(dá)phaC2Ps基因，重組菌可以合成單體組成包括C4～C12的scl-mcl PHA，占細(xì)胞干重的 15%～41%。利用葡萄糖酸鈉和脂肪酸混合碳源培養(yǎng)，通過控制脂肪酸的添加，可以有效調(diào)節(jié)scl-mcl PHA的單體組成，使3HB單體比例能夠在16～100 mol%之間進行調(diào)控。

在R. eutropha PHB-4中表達(dá)A. caviae的phaC基因，得到的重組菌能夠以豆油為碳源高效地生產(chǎn)PHBHHx，其中3HHx單體含量為5 mol%，細(xì)胞干重為123～138 g/L，PHBHHx含量高達(dá)71%～74%，由豆油生產(chǎn)PHA的轉(zhuǎn)化率為0.72～0.76[23]。

A. hydrophila 4AK4野生菌可以利用脂肪酸氧化途徑合成PHBHHx，為了獲得不同單體比例的PHBHHx，并提高菌株生產(chǎn) PHA的能力，針對其PHA合成途徑進行了一系列代謝工程改造。在A. hydrophila 4AK4中表達(dá)來源于A. caviae的phaP或phaC基因能提高菌體內(nèi)PHBHHx含量和3HHx單體比例[24]。表達(dá)來源于R. eutropha的phaAB基因可以將胞內(nèi)脂肪酸氧化產(chǎn)生的乙酰輔酶A用于PHA合成，提高從脂肪酸到 PHA的轉(zhuǎn)化率，同時提高PHBHHx中 3HB單體比例[25]。異源表達(dá)透明顫菌Vitreoscilla編碼血紅蛋白的 vgb基因可以提高細(xì)胞對氧的利用率，從而提高細(xì)胞干重和 PHBHHx含量[26-27]。

2.3 新型PHA材料的生產(chǎn)

2.3.1 高HDD含量PHA的生產(chǎn)

P. putida能夠利用月桂酸合成含C6～C12單體的mcl PHA，敲除fadB和fadA基因可以弱化其β氧化途徑，從而使碳源更多地流向 PHA的合成，提高PHA含量、提高碳源轉(zhuǎn)化率和改變PHA的單體組成。Ouyang等[28]構(gòu)建了 fadB和 fadA敲除突變株P(guān). putida KTOY06，采用兩步法培養(yǎng)，在搖瓶中達(dá)到5.31 g/L的細(xì)胞干重，其中PHA含量達(dá)到細(xì)胞干重的84.3%，單體組成中的HDD成分為40.9 mol%，是野生菌的5倍左右。

2.3.2 高HHx含量PHA的生產(chǎn)

A. hydrophila 4AK4 利用月桂酸合成的PHBHHx中3HHx比例在20 mol%以下，通過敲除內(nèi)源的 PHA合酶基因，表達(dá)異源 PHA合酶基因phaC1ps、脂酰輔酶A合酶基因fadDec和脂肪酸轉(zhuǎn)運蛋白基因 fadLpp，構(gòu)建的重組菌可以利用己酸鈉為碳源，積累占細(xì)胞干重54%的PHBHHx，其中3HHx比例為95 mol%；以辛酸鈉為碳源培養(yǎng)時，重組菌積累占細(xì)胞干重51%的三元共聚物 PHBHHxHO，其中3HHx比例為82 mol%[29]。

2.3.3 PHV和PHHp的生產(chǎn)

Shen等[30]用戊酸、庚酸、壬酸和十一酸等奇數(shù)碳脂肪酸培養(yǎng)A. hydrophila 4AK4，發(fā)現(xiàn)其能利用十一酸合成聚 3-羥基戊酸酯 (Polyhydroxyvalerate，PHV)，采用兩步法搖瓶培養(yǎng)，在第二步中添加8 g/L的十一酸，細(xì)菌能達(dá)到5 g/L的細(xì)胞干重，PHV含量超過45%。Wang等[31]的研究發(fā)現(xiàn)，fadBA敲除突變株P(guān). putida KTOY06可以利用庚酸鹽合成聚3-羥基庚酸酯 (Polyhydroxyheptanoate，PHHp)，在礦物鹽培養(yǎng)基中，添加10 g/L庚酸鹽為碳源，細(xì)菌能夠達(dá)到3.7 g/L的細(xì)胞干重，PHHp含量超過71%。

2.4 利用單一糖類碳源生產(chǎn)PHA共聚酯

通常情況下，3HB以外的PHA單體的聚合需要相關(guān)碳源的添加，例如4HB單體的聚合需要4-羥基丁酸或1,4-丁二醇等，3HV單體的聚合需要丙酸或戊酸，mcl 3HA單體的聚合需要脂肪酸或烷烴。這類相關(guān)碳源的價格普遍比糖類碳源貴很多，且對細(xì)胞毒性較大，發(fā)酵過程中需要以分批補料的方式添加，操作較為繁瑣。以相對廉價的簡單糖類碳源來生產(chǎn)PHA共聚酯，將能有效地降低其生產(chǎn)成本，促進PHA材料的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用開發(fā)，因此引起了很多研究者的興趣，目前取得的一些進展見表1。

表1 利用簡單碳源生產(chǎn)PHA共聚酯的研究Table 1 Metabolic engineering of microorganisms for production of PHA from simple carbon sources

2.4.1 利用葡萄糖生產(chǎn)P3HB4HB

Valentin等[38]通過在大腸桿菌中異源表達(dá) R. eutropha的 PHB合成操縱子 phaCAB和克氏梭菌Clostridium kluyveri的琥珀酸降解相關(guān)基因sucD、4hbD和orfZ，構(gòu)建出能夠利用葡萄糖生產(chǎn)P3HB4HB的基因工程菌 (圖4)。在搖瓶實驗中，重組菌能夠積累超過細(xì)胞干重50%的P3HB4HB，4HB單體含量為2.8 mol%，但細(xì)胞干重處于較低的水平。Li等[32]同樣利用上述代謝途徑，對基因表達(dá)進行了優(yōu)化，并對大腸桿菌的琥珀酸半縮醛脫氫酶基因 sad和gabD 進行敲除 (圖 4)，獲得了更高的細(xì)胞干重和4HB單體含量。在6 L的發(fā)酵罐實驗中，經(jīng)過32 h的培養(yǎng)，細(xì)胞干重達(dá)到24.7 g/L，含有62.0%的P (3HB-co-12.1 mol% 4HB)。熱力學(xué)及材料力學(xué)性質(zhì)的研究表明，與PHB相比，P3HB4HB共聚酯的結(jié)晶度下降，斷裂伸長率提高，表現(xiàn)出明顯的彈性體的特點。

圖4 利用葡萄糖為碳源在重組大腸桿菌中合成P3HB4HBFig. 4 P3HB4HB producing pathway in recombinant E. coli cultivated with glucose as carbon source. PhaA: β-ketothiolase; PhaB: NADPH-dependent acetoacetyl-CoA reductase; PhaC: PHA synthase; SucD: succinate semialdehyde dehydrogenase; 4HbD: 4HB dehydrogenase; OrfZ: 4HB-CoA:succinyl-CoA CoA transferase; Sad and GabD: non-CoA acylating succinate semialdehyde dehydrogenase of E. coli.

2.4.2 利用甘油生產(chǎn)PHBV

大腸桿菌中存在sbm-ygfD-ygfG操縱子，能夠催化琥珀酰輔酶 A生成丙酰輔酶 A，腸道沙門氏菌Salmonella enterica中prpC基因催化丙酰輔酶A與草酰乙酸縮合成 2-甲基檸檬酸。Aldor等[33]通過在prpC突變的S. enteric JE4199中表達(dá)sbm-ygfD-ygfG和不動桿菌 Acinetobacter 的 PHB合成操縱子phbBCA，實現(xiàn)了由甘油來生產(chǎn)PHBV，其中3HV單體含量為14 mol%，PHBV達(dá)細(xì)胞干重的40%以上。

2.4.3 利用簡單碳源生產(chǎn)短鏈中長鏈共聚PHA

Taguchi等[22,34]在R. eutropha PHB-4中表達(dá)源自Pseudomonas sp. 61-3的phaG和phaC1基因，重組菌可以利用果糖合成短鏈中長鏈共聚的PHA，其中3HB單體含量為95～97 mol%，在此基礎(chǔ)上表達(dá)R. eutropha的phbAB基因使得PHA含量由26%提高到 43%[22,34]。將肉桂地鏈霉菌 Streptomyces cinnamonensis的ccr基因以及A. caviae的phaCJ基因?qū)隦. eutropha PHB-4中，得到的重組菌能夠利用果糖合成占細(xì)胞干重48%的PHBHHx，其中3HHx單體含量為1.5 mol%，共聚物中的 C6前體是通過PhaA催化的丁酰輔酶A延伸合成的，ccr基因起了催化巴豆酰輔酶A生成丁酰輔酶A的作用[36]。

在一般培養(yǎng)中，A. hydrophila 4AK4野生菌不能利用糖類碳源合成PHBHHx或者PHB，將來源于大腸桿菌、刪除了前導(dǎo)序列的編碼硫酯酶I的tesA基因?qū)階. hydrophila 4AK4，重組菌可以利用葡萄糖酸鈉合成PHBHHx，通過限磷或限氮可使PHBHHx含量提高到10%，3HHx含量為14 mol%[35]。在P. putida GPp104中表達(dá) R. eutropha的 phaB、A. hydrophila的phaC以及本身的phaG基因，得到的重組菌可以用葡萄糖合成PHBHHx，其含量最高可達(dá)19%，其中3HHx含量為5 mol%[35]。

Ouyang等[37]刪除了P. putida KT2442的PHA合成操縱子的大部分序列，獲得了一株P(guān)HA合成功能喪失的突變株P(guān). putida KTOY01，在其中表達(dá)底物特異性較低的 phaC2Ps基因以及 R. eutropha的phbAB基因，得到的重組菌株可以在以葡萄糖為碳源的搖瓶培養(yǎng)基中獲得2.37 g/L的細(xì)胞干重，PHA含量為22.8%，其中含88 mol% HB和12 mol%中長鏈單體。

3 微氧條件下生產(chǎn)PHB的研究

在不影響產(chǎn)物形成的情況下，降低細(xì)菌發(fā)酵過程中的氧氣供給能夠減少發(fā)酵工業(yè)中最大的能量消耗——通氧攪拌。無氧發(fā)酵可以生產(chǎn)多種產(chǎn)品，如乙醇、乳酸和琥珀酸等，但是在無氧環(huán)境下生產(chǎn)PHB是非常困難的，因為現(xiàn)有的PHB生產(chǎn)菌種都是好氧生長菌，在氧氣供應(yīng)不足時菌體生長難以維持。有些實驗室嘗試?yán)脽o氧發(fā)酵來產(chǎn)生PHB，希望能夠有所突破，但是尚未取得明顯的效果[39]。目前，一些研究者的眼光逐漸由無氧生產(chǎn)轉(zhuǎn)向了微氧生產(chǎn)。相比好氧發(fā)酵，微氧發(fā)酵有著培養(yǎng)過程簡單、生產(chǎn)規(guī)模容易擴大的優(yōu)點，而且微氧培養(yǎng)也無需像嚴(yán)格厭氧發(fā)酵那樣需在氮氣保護等輔助手段下進行，因此在生產(chǎn)上更為簡單易行，對設(shè)備的要求也更低。

Alexeeva等在敲除了 ArcA的大腸桿菌突變體中發(fā)現(xiàn)，在充分好氧或嚴(yán)格厭氧的情況下菌體的代謝水平并沒有發(fā)生變化，但敲除ArcA卻能明顯提高細(xì)菌在微氧環(huán)境中的呼吸作用，同時菌體內(nèi)的氧化還原狀態(tài)也有改變[40]。Nikel等嘗試使用AcrA突變的重組大腸桿菌在微氧條件下合成PHB，取得了一定效果[41]，在微氧條件下，通過分批補料的方式添加甘油為碳源，60 h的培養(yǎng)獲得了10.8 g/L的PHB產(chǎn)量[42]。

Wei等[43]將厭氧啟動子引入到 PHB的微氧生產(chǎn)，以解除菌體在微氧環(huán)境下PHB合成基因不能正常表達(dá)的問題。經(jīng)過檢索分析篩選出 9個厭氧啟動子作為候選，通過實驗比較從中找到了微氧條件下具有較高活性的乙醇脫氫酶啟動子 PadhE，將 PadhE應(yīng)用于微氧PHB的生產(chǎn)，使得菌體中PHB的含量從30%提高到了48%。研究還發(fā)現(xiàn)改變菌體代謝流能夠提高PadhE的活性，將PadhE應(yīng)用于乙酸缺失突變體E. coli JW2293和JW2294中，在微氧條件下，兩株突變體比野生型顯示了更高的 PHB合成能力，PHB的含量分別達(dá)到了58%和67%[43]。

4 PHA合成基因作為代謝調(diào)控的因子提高工業(yè)生產(chǎn)菌的代謝潛能

4.1 PHA的合成提高微生物的抗逆性

PHA的合成與細(xì)菌的抗逆性之間存在著密切的聯(lián)系，微生物積累PHA能夠增加其在多變環(huán)境中的競爭能力。例如PHB在碳源過剩以及氮、磷等營養(yǎng)缺乏時合成，可以作為碳源和能源的儲存物；當(dāng)環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)缺乏時，PHB可以使得細(xì)胞的生存時間延長，從而渡過難關(guān)。López等[44-45]的研究發(fā)現(xiàn)，在惡劣的環(huán)境下PHB野生菌R. eutropha比其PHB積累缺陷菌有更強的耐受能力。在固氮菌中，PHB的積累還可作為調(diào)節(jié)細(xì)菌生存環(huán)境中氧含量的因子，也可用作電子供體，賦予細(xì)菌在生命進化過程中更強的競爭力[44]。

Zhao等[46]利用能生產(chǎn)共聚物 PHBHHx的A. hydrophila 4AK4野生菌和不產(chǎn)PHBHHx的PhaC突變株A. hydrophila CQ4作比較來研究PHA合成的抗性原理，發(fā)現(xiàn)野生菌 4AK4對各種環(huán)境因子包括高溫、低溫、紫外照射、有機溶劑、高滲透壓和過氧化氫等的抗逆性均高于突變菌 CQ4。分子水平上檢測rpoS表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，較高的存活率與較高水平的rpoS表達(dá)量相偶聯(lián)，在環(huán)境因子的刺激下，細(xì)菌內(nèi)PHBHHx的存在會增強胞內(nèi)包括rpoS在內(nèi)的基因的表達(dá)，而rpoS的表達(dá)則會與RNA聚合酶結(jié)合激活各種壓力蛋白的表達(dá)，從而保護細(xì)菌免受環(huán)境壓力的毒害。

4.2 PHA合成基因在工業(yè)微生物中的應(yīng)用

PHA在細(xì)菌內(nèi)的積累主要有兩方面的影響，一是作為碳源和能源的儲存物，二是消耗還原型輔酶，避免其積累對細(xì)胞代謝產(chǎn)生負(fù)面影響。PHA的合成消耗掉了胞內(nèi)的代謝資源，使整個碳源和能源的分布發(fā)生了很大的變化，由此可推測PHA合成途徑可以改變胞內(nèi)的整體代謝調(diào)節(jié)，對微生物的其他新陳代謝也產(chǎn)生了影響。PHA合成基因在工業(yè)微生物菌株中的表達(dá)，可以從整體上調(diào)控微生物的代謝，從而提高含PHA基因重組菌的產(chǎn)品產(chǎn)率。

4.2.1 PHA的合成對谷氨酸棒桿菌中谷氨酸合成的影響

Liu等[47]通過優(yōu)化基因表達(dá)，成功地在幾株谷氨酸棒桿菌 Corynebacterium glutamicum中表達(dá)R. eutropha的PHB合成基因phbCAB，搖瓶培養(yǎng)中積累PHB的重組菌的谷氨酸產(chǎn)量分別提高了17%～39%，發(fā)酵罐培養(yǎng)中，含有 phbCAB的重組 C. glutamicum ATCC14067與野生菌株相比，細(xì)胞干重提高10%，葡萄糖的消耗增加13%，谷氨酸的產(chǎn)量則提高23%。由于PHB合成基因的引入，使得胞內(nèi)NADPH的水平下降，細(xì)胞為了增加 NADPH的合成，更多的代謝流流向了糖酵解途徑和TCA循環(huán)，進而促進了谷氨酸的合成；同時由于PHB合成對碳源的分流，減少了副代謝產(chǎn)物乳酸的產(chǎn)量。

圖5 PHB合成基因在獸疫鏈球菌中表達(dá)提高透明質(zhì)酸生產(chǎn)Fig. 5 Expression of PHB synthesis genes in Streptococcus zooepidemicus improved hyaluronic acid production.

4.2.2 PHA的合成提高獸疫鏈球菌生產(chǎn)透明質(zhì)酸的能力

在獸疫鏈球菌Streptococcus zooepidemicus發(fā)酵生產(chǎn)透明質(zhì)酸的過程中，大量的碳源流向乳酸的合成，高濃度的乳酸抑制了菌體的生長和透明質(zhì)酸的生產(chǎn)。在發(fā)酵罐的低溶解氧條件下，生成乳酸是細(xì)胞再生NAD的主要途徑，Zhang等[48]通過在獸疫鏈球菌中表達(dá)R. eutropha的phbCAB基因，提供了另一條獲得氧化力的途徑，使乳酸的產(chǎn)量由64 g/L下降到41 g/L，同時增加了透明質(zhì)酸的合成 (圖5)。

4.2.3 PHA的合成對移動單胞菌中乙醇生產(chǎn)的影響

Lai等[49]在移動單胞菌Zymomonas mobilis中表達(dá)R. eutropha的PHB合成基因并實現(xiàn)了PHB的積累，48 h的搖瓶培養(yǎng)表明，PHB的積累對運動發(fā)酵單胞菌的葡萄糖利用和乙醇合成產(chǎn)生了影響，帶有PHB合成基因表達(dá)質(zhì)粒的重組菌的乙醇生產(chǎn)量比野生菌提高了約10%，說明PHB的積累能夠在一定程度上提高了運動發(fā)酵單胞菌的乙醇生產(chǎn)能力。

5 結(jié)論與展望

聚羥基脂肪酸酯 (PHA) 是一類材物化性能多樣的生物可降解聚合物，在很多領(lǐng)域都有潛在的應(yīng)用價值，具有非常好的發(fā)展前景。過去幾十年中對于PHA合成機制和代謝途徑的深入研究使得我們能夠構(gòu)建出各種生產(chǎn)PHA的基因工程菌，這些基因工程菌的生產(chǎn)能力比天然的生產(chǎn)菌株要強很多。合成生物學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、生物信息學(xué)等的迅速發(fā)展提供了強有力的分子生物學(xué)工具，將其應(yīng)用于PHA代謝工程領(lǐng)域，會有利于我們構(gòu)建更為高效的PHA生產(chǎn)菌，降低PHA材料的生產(chǎn)成本，推動其工業(yè)化生產(chǎn)和商業(yè)應(yīng)用開發(fā)，促進塑料產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

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