黑曲霉作為細(xì)胞工廠：知識(shí)準(zhǔn)備與技術(shù)基礎(chǔ)

郭艷梅，鄭平，孫際賓

中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308

1 概述

黑曲霉是一種廣泛存在于自然界的腐生真菌，其分生孢子頭呈褐黑色放射狀，分生孢子梗長(zhǎng)短不一。頂囊球形，雙層小梗 (圖 1)，多見(jiàn)于糧食、植物性產(chǎn)品和土壤中。黑曲霉又是重要的工業(yè)發(fā)酵微生物，在工業(yè)酶制劑、有機(jī)酸發(fā)酵方面應(yīng)用廣泛?？缮a(chǎn)淀粉酶、酸性蛋白酶、纖維素酶、果膠酶、葡萄糖氧化酶等超過(guò)30種酶制劑。因?yàn)楹谇钩錾牡鞍踪|(zhì)分泌能力，黑曲霉也被開(kāi)發(fā)為通用的異源蛋白表達(dá)載體。黑曲霉是檸檬酸、葡糖酸和沒(méi)食子酸等的主要生產(chǎn)菌。世界上檸檬酸年產(chǎn)量超過(guò)150萬(wàn)t，其中 99%以上的檸檬酸都是通過(guò)黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)的，中國(guó)檸檬酸生產(chǎn)的技術(shù)和產(chǎn)能都居世界領(lǐng)先地位。另外黑曲霉在甾體轉(zhuǎn)化、傳統(tǒng)發(fā)酵食品釀制等方面也有所應(yīng)用。

圖1 黑曲霉分生孢子梗的掃描電鏡圖[1] (本圖由愛(ài)丁堡大學(xué)瑞德博士惠供)Fig. 1 Scanning electron microscope photo of Aspergillus niger conidial head[1] (with kindly permission from Dr. Nick Read).

黑曲霉具有強(qiáng)大的聚合物降解酶系，賦予其在各種廉價(jià)的培養(yǎng)基上快速生長(zhǎng)和發(fā)酵的能力，能夠在極低的pH下保持旺盛的代謝活性因而不易染菌，能夠適應(yīng)工業(yè)發(fā)酵中粗放的物料和理化環(huán)境，這些品質(zhì)使黑曲霉成為一種不可多得的工業(yè)生產(chǎn)宿主菌，即細(xì)胞工廠。但追溯起來(lái)，是黑曲霉在檸檬酸工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用首先奠定了其在工業(yè)發(fā)酵上的特殊地位。早在1923年黑曲霉就已經(jīng)應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)檸檬酸。到目前為止，利用黑曲霉生產(chǎn)檸檬酸的發(fā)酵過(guò)程已經(jīng)成為微生物發(fā)酵工業(yè)的典范。在近一個(gè)世紀(jì)的檸檬酸生產(chǎn)過(guò)程中，檸檬酸生產(chǎn)的各項(xiàng)性能指標(biāo)突飛猛進(jìn)，黑曲霉菌種改造是主要推手，但這其中仍以傳統(tǒng)的誘變育種為主。

自上世紀(jì)90年代以來(lái)，分子生物學(xué)的進(jìn)步率先揭開(kāi)了全面研究黑曲霉細(xì)胞工廠運(yùn)作機(jī)制的序幕。一些基因得到克隆和功能表征，一些針對(duì)絲狀真菌的分子生物學(xué)操作技術(shù)也在黑曲霉中得到實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用，如敲除載體、轉(zhuǎn)化方法、篩選標(biāo)記等等。這些都為更好地研究黑曲霉的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。2007年前后，3株黑曲霉菌株基因組的公布，將黑曲霉的研究推入后基因組時(shí)代。伴隨著分子生物學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)等學(xué)科的迅猛發(fā)展，黑曲霉這個(gè)高效運(yùn)作的細(xì)胞工廠的神秘面紗正在被逐漸揭開(kāi)，對(duì)黑曲霉細(xì)胞工廠進(jìn)行重新設(shè)計(jì)和優(yōu)化的能力正在逐步形成。

2 系統(tǒng)生物學(xué)的進(jìn)步使得對(duì)黑曲霉的了解一步步深入

2.1 黑曲霉基因組

近年來(lái)，有3株黑曲霉工業(yè)菌株先后獲得測(cè)序。2000年7月荷蘭帝斯曼公司 (DSM) 率先啟動(dòng)了對(duì)其擁有的工業(yè)酶生產(chǎn)菌株黑曲霉CBS 513.88的測(cè)序計(jì)劃。采用BAC和shotgun法，2001年底完成測(cè)序，8倍覆蓋率，拼接成約500個(gè)重疊群 (Contigs)，大小34.5兆堿基對(duì)，預(yù)測(cè)有14 000多個(gè)基因，但該信息當(dāng)時(shí)僅限于在公司內(nèi)部使用。大約與此同時(shí)，美國(guó) Integrated Genomics 公司完成對(duì)黑曲霉菌株ATCC 9029測(cè)序，該菌株曾被用于多種酶制劑和有機(jī)酸生產(chǎn)的研究。測(cè)序采用shotgun法，4倍覆蓋率，約10 000個(gè)重疊群。形成的數(shù)據(jù)庫(kù)通過(guò)該公司的生物信息集成數(shù)據(jù)庫(kù)ERGO進(jìn)行銷(xiāo)售。2006年美國(guó)能源部聯(lián)合基因組學(xué)研究所 (JGI) 完成對(duì)檸檬酸生產(chǎn)菌黑曲霉ATCC 1015測(cè)序，測(cè)序質(zhì)量與帝斯曼的質(zhì)量相當(dāng)，也是8倍覆蓋率?；蚪M大小為37.1兆，較帝斯曼菌株大，預(yù)測(cè)基因數(shù)目約 11 000個(gè)。JGI采取的是開(kāi)放策略，其數(shù)據(jù)在公開(kāi)發(fā)表之前已經(jīng)提供給公眾下載[2](http://genome.jgi-psf.org/Aspni1/ Aspni1.home.html)。在這種形勢(shì)下，在對(duì)其菌株基因組信息進(jìn)行了充分的挖掘和專(zhuān)利保護(hù)之后，帝斯曼公司及其合作伙伴在Nature Biotechnology上發(fā)表論文[3]，對(duì)黑曲霉基因組進(jìn)行系統(tǒng)闡述，并公布序列和高質(zhì)量的基因組注釋。同時(shí)發(fā)表的還有對(duì)其中央代謝途徑的重建和對(duì)其蛋白質(zhì)分泌途徑的解析，成為當(dāng)時(shí)黑曲霉研究領(lǐng)域，特別是在歐洲的企業(yè)界和學(xué)術(shù)界研究者與生物信息工作者聯(lián)手合作的典范，轟動(dòng)了當(dāng)時(shí)的學(xué)術(shù)界和產(chǎn)業(yè)界。本文作者有幸參與了這一工作，在重建黑曲霉分泌途徑方面做了一點(diǎn)工作。

黑曲霉基因組數(shù)據(jù)的公布為功能基因組學(xué)的深入研究奠定了基礎(chǔ)，轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組方面的數(shù)據(jù)很快得到了發(fā)表，使細(xì)胞工廠設(shè)計(jì)和代謝工程研究變得更加便捷，也為通過(guò)工程手段提高工業(yè)生產(chǎn)菌株性能提供了新的思路和方法。

2.2 蛋白質(zhì)分泌途徑

黑曲霉具有高效表達(dá)和分泌某些蛋白質(zhì)、特別是各種水解酶的能力，但是并非所有異源蛋白都能夠通過(guò)黑曲霉實(shí)現(xiàn)過(guò)量胞外生產(chǎn)。雖然通過(guò)一些技術(shù)手段，例如采用基因融合、蛋白酶缺失、分子伴侶和折疊酶過(guò)量表達(dá)等工程菌株改造策略，在某些情況下可以提高一些異源蛋白的產(chǎn)量，但是在很多情況下仍難以奏效。蛋白質(zhì)的分泌機(jī)制和其改造是異源蛋白生產(chǎn)的瓶頸問(wèn)題。

真核生物胞外蛋白質(zhì)的分泌是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程。分泌蛋白通常在N端有信號(hào)肽序列，它引導(dǎo)分泌蛋白定位于糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的核糖體上合成，隨后信號(hào)肽被切除，并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中進(jìn)行加工、修飾；然后被運(yùn)輸?shù)礁郀柣w中進(jìn)行進(jìn)一步的翻譯后加工，形成有特定結(jié)構(gòu)和功能的蛋白質(zhì)；最后通過(guò)高爾基體發(fā)生的分泌小泡與質(zhì)膜融合，將其包含的蛋白質(zhì)分泌到細(xì)胞外，這個(gè)過(guò)程被稱(chēng)為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體 (ER-Golgi) 蛋白分泌途徑 (圖2)。

圖2 黑曲霉的蛋白質(zhì)分泌途徑[3] (括號(hào)中的數(shù)字表示涉及該過(guò)程的編碼基因數(shù)量)Fig. 2 Protein secretory pathway of Aspergillus niger[3]. The numbers in parentheses represent the number of coding genes involved in the corresponding process.

通過(guò)比較黑曲霉、構(gòu)巢曲霉、脈胞霉、釀酒酵母等20余種真核生物，我們第一次注釋了與黑曲霉蛋白質(zhì)運(yùn)輸有關(guān)的 300多個(gè)基因，約占其基因組總量的2%，初步重建了黑曲霉的蛋白質(zhì)分泌途徑[3]。與其他真核生物相比，黑曲霉表現(xiàn)了與眾不同的特點(diǎn)，比如具有更多的糖基化基因，具有與細(xì)菌類(lèi)似的IbpA蛋白穩(wěn)定蛋白質(zhì)分散，更多的蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶和肽基脯氨酰異構(gòu)酶幫助蛋白質(zhì)折疊，與哺乳動(dòng)物和酵母菌都不同的未折疊蛋白響應(yīng)系統(tǒng)(UPR) 等。

2.3 代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控

在廣泛的基因組注釋和比較基因組學(xué)研究的基礎(chǔ)上，孫際賓等重建了黑曲霉基因組規(guī)模的代謝網(wǎng)絡(luò)模型[4](圖3)，共涉及4 000多個(gè)基因，999個(gè)不同的酶序列號(hào) (EC number)，2 443個(gè)代謝反應(yīng)和2 349個(gè)代謝產(chǎn)物。這是黑曲霉第一個(gè)全面的代謝網(wǎng)絡(luò)模型，是以往文獻(xiàn)發(fā)表的黑曲霉網(wǎng)絡(luò)的反應(yīng)數(shù)目的 8倍以上。應(yīng)用此網(wǎng)絡(luò)模型首先分析了黑曲霉高產(chǎn)檸檬酸的機(jī)理[4]。發(fā)現(xiàn)黑曲霉除了豐富的多糖水解酶體系外，其糖酵解和三羧酸循環(huán)還有豐富的冗余基因，即較多的重復(fù)基因拷貝編碼催化同一步反應(yīng)的酶。典型的是檸檬酸合成酶CS和線粒體支鏈氧化還原酶AOX。與當(dāng)時(shí)基因組序列已經(jīng)公布的絲狀真菌相比，3株獲得測(cè)序的黑曲霉菌株普遍存在額外的第 5套檸檬酸合成酶，而檸檬酸生產(chǎn)菌株ATCC 1015則具有第 6套細(xì)菌來(lái)源的檸檬酸合成酶。在檸檬酸的合成過(guò)程中，氧氣被同時(shí)大量消耗。發(fā)酵過(guò)程停止通氣5 min足以導(dǎo)致整個(gè)發(fā)酵過(guò)程發(fā)生不可逆的損傷。究其原因，黑曲霉轉(zhuǎn)化葡萄糖生成檸檬酸的過(guò)程中，每一分子檸檬酸的合成，都會(huì)伴隨3分子NADH的產(chǎn)生。大量的NADH只有傳遞給氧氣才能得到氧化再生。除氧化磷酸化電子傳遞鏈外，黑曲霉被認(rèn)為擁有一條不產(chǎn)生能量的電子傳遞系統(tǒng)，稱(chēng)為支鏈氧化還原酶AOX。但是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的 AOX系統(tǒng)經(jīng)過(guò)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)證明與檸檬酸高速合成無(wú)關(guān)，其同源系統(tǒng)在所有真核生物中有著廣泛的分布。非常有趣的是，通過(guò)基因組分析，發(fā)現(xiàn)黑曲霉存在另外一套獨(dú)有的AOX，稱(chēng)之為AOX2。這一發(fā)現(xiàn)，為解釋NADH高速循環(huán)和檸檬酸快速合成提供了新的思路，也為黑曲霉細(xì)胞工廠的重新設(shè)計(jì)指出了途徑。

圖3 黑曲霉基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)模型[4]Fig. 3 Genome-scale metabolic network of Aspergillus niger[4].

在黑曲霉代謝網(wǎng)絡(luò)研究方面的一個(gè)里程碑是Jens Nielsen小組2008年發(fā)表在Molecular Systems Biology[5]上的工作在深入分析文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，他們建立了包括亞細(xì)胞定位和運(yùn)輸反應(yīng)的全細(xì)胞代謝網(wǎng)絡(luò)，包含文獻(xiàn)371篇，生化反應(yīng)1 190個(gè)。結(jié)合文獻(xiàn)中的宏觀數(shù)據(jù)、流量分析和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，他們證實(shí)了其網(wǎng)絡(luò)的可靠性，分析了黑曲霉的代謝潛力。與前面介紹的基因組規(guī)模代謝網(wǎng)絡(luò)相比，盡管反應(yīng)總數(shù)少一半左右，但是可靠性有很大提升，同時(shí)包含亞細(xì)胞定位和運(yùn)輸反應(yīng)，這些信息對(duì)于模型模擬與細(xì)胞仿真非常重要。在 Nielsen等的基礎(chǔ)上補(bǔ)充更多的可靠的代謝反應(yīng)，是黑曲霉代謝網(wǎng)絡(luò)研究的重要方向，將成為黑曲霉細(xì)胞工廠設(shè)計(jì)的重要基礎(chǔ)。

2.4 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

盡管對(duì)黑曲霉的研究有近百年的歷史，在PUBMED中可索引的文獻(xiàn)有數(shù)千條，但是限于其遺傳操作的復(fù)雜性，關(guān)于黑曲霉基因調(diào)控的機(jī)理的研究非常少。這種狀態(tài)一直到2007年黑曲霉基因組序列得以公開(kāi)后才開(kāi)始改變。Park等構(gòu)建了真菌轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫(kù) (http://ftfd.snu.ac.kr)，從 156個(gè)真菌的全基因組數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)了58 890個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄因子，包括黑曲霉CBS 513.88的679個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，為從構(gòu)建全基因組規(guī)模調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了條件。通過(guò)對(duì) 3 000余篇黑曲霉相關(guān)研究論文的分析總結(jié)，我們匯總了文獻(xiàn)中對(duì)黑曲霉基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究的成果，得到經(jīng)實(shí)驗(yàn)確證了的調(diào)控蛋白和其調(diào)控關(guān)系，同時(shí)通過(guò)各種計(jì)算生物學(xué)手段預(yù)測(cè)新的調(diào)控，初步形成了黑曲霉基因調(diào)控網(wǎng)路和數(shù)據(jù)庫(kù)。同時(shí)我們?cè)诜e極開(kāi)展高通量的蛋白質(zhì)-DNA相互作用研究，期望在不遠(yuǎn)的將來(lái)，進(jìn)一步拓展對(duì)黑曲霉調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的認(rèn)識(shí)。

2.5 黑曲霉的系統(tǒng)解析

高通量系統(tǒng)生物學(xué)分析是理解黑曲霉細(xì)胞工廠的重要基礎(chǔ)，特別是近幾年來(lái)，隨著黑曲霉基因組的發(fā)布，相關(guān)研究呈現(xiàn)井噴趨勢(shì)。甚至在基因組數(shù)據(jù)正式公布之前，Semova等就于2006年率先發(fā)表了在 7種不同培養(yǎng)條件下的 EST (Expressed sequence tags) 數(shù)據(jù)，包括12 820個(gè)EST序列，分屬于5 108個(gè)基因模型[6]。Meyer等首次通過(guò)基因芯片技術(shù)分析了在存在抗真菌藥物環(huán)境下黑曲霉的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)[7]。Nielsen研究組發(fā)布了黑曲霉、構(gòu)巢曲霉和米曲霉的三基因組整合型芯片，Affymetrix格式，方便了 3種曲霉的比較分析[8]。他們利用此芯片比較研究了3種曲霉在葡萄糖和甘油兩種碳源上基因轉(zhuǎn)錄情況，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)重要調(diào)控因子Adr1和其保守DNA結(jié)合序列，表明在曲霉屬、甚至在釀酒酵母和人類(lèi)中，該調(diào)控模式都是相當(dāng)保守的[9]。

Lu等 2007年就通過(guò)二維電泳完成了淀粉酶產(chǎn)生菌黑曲霉在誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)條件下 (分別以麥芽糖和木糖為碳源) 的蛋白質(zhì)組的比較研究，但是相關(guān)工作直到2010年才發(fā)表[10]。研究表明在誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)條件下胞漿蛋白質(zhì)組并沒(méi)有明顯的差異，主要差異體現(xiàn)在胞外分泌蛋白，特別是植物細(xì)胞壁降解蛋白。最近 J?rgensen等作了類(lèi)似條件下的轉(zhuǎn)錄組比較，但是實(shí)驗(yàn)是在控制更精確的恒化培養(yǎng)條件下完成的。他們發(fā)現(xiàn)在此條件下以麥芽糖為唯一碳源時(shí)胞外蛋白量是以木糖為唯一碳源的3倍以上，90種以上與蛋白質(zhì)分泌途徑有關(guān)的蛋白發(fā)生了上調(diào)表達(dá)，包括蛋白質(zhì) ER轉(zhuǎn)位、折疊、糖基化、質(zhì)量控制、小體裝配和運(yùn)輸?shù)龋c未折疊蛋白響應(yīng)UPR的情況非常類(lèi)似[11]。荷蘭帝斯曼公司比較研究了3種胞外酶生產(chǎn)菌株及其野生型菌株在蛋白質(zhì)生產(chǎn)條件下轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組方面的差異[12]。他們發(fā)現(xiàn)隨著產(chǎn)量和產(chǎn)物性質(zhì)的不同，細(xì)胞的響應(yīng)存在顯著差異，如碳氮代謝、氧化壓力蛋白、蛋白質(zhì)折疊和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合的蛋白質(zhì)降解系統(tǒng) (ERAD) 等。通過(guò)在β-葡萄糖苷酸酶 (GUS) 高產(chǎn)菌株中過(guò)量表達(dá) ERAD因子doaA和寡糖轉(zhuǎn)移酶sttC，GUS的產(chǎn)量確實(shí)得到了少量提升。Oliveira等最近通過(guò)LC-MS/MS研究了胞外分泌小體 microsome中蛋白質(zhì)的分布情況，也發(fā)現(xiàn)在小體中存在ERAD組分Cdc48，并且首次發(fā)現(xiàn)小體中含有14種蛋白體20S亞基組分[13]。

3 構(gòu)建黑曲霉細(xì)胞工廠的實(shí)驗(yàn)技術(shù)儲(chǔ)備

遺傳操作系統(tǒng)是基因功能分析和細(xì)胞工廠改造的必需工具。隨著黑曲霉基因組序列的公布，其遺傳操作系統(tǒng)的研究進(jìn)展十分迅速。

基因敲除是遺傳操作中的難點(diǎn)和關(guān)鍵，是基因功能研究和細(xì)胞工廠設(shè)計(jì)中的常用手段。雖然基因敲除目前在細(xì)菌、酵母及哺乳動(dòng)物中已有廣泛應(yīng)用，但對(duì)于絲狀真菌還存在一些技術(shù)問(wèn)題阻礙其應(yīng)用。主要包括：克隆和篩選步驟繁瑣，獲得所需打靶載體費(fèi)時(shí)費(fèi)力；絲狀真菌基因敲除通常需要較長(zhǎng)的同源序列；一般在絲狀真菌中發(fā)生同源重組的頻率低，打靶效率低。同源重組的頻率主要受打靶載體同源序列的長(zhǎng)度、載體構(gòu)型、打靶位點(diǎn)和菌株等因素的影響。針對(duì)上述問(wèn)題，近年來(lái)研究者提出了許多有效的改進(jìn)措施，在黑曲霉中已經(jīng)建立了高效打靶系統(tǒng)，這使得黑曲霉的遺傳操作變得簡(jiǎn)便、迅速和高效，為黑曲霉的深入研究和應(yīng)用鋪平了道路。

3.1 基因打靶系統(tǒng)

在進(jìn)行目的基因敲除過(guò)程中，載體構(gòu)建非常重要。載體一般要包括 2個(gè)分別與目標(biāo)基因兩側(cè)同源的臂序列和 1個(gè)篩選標(biāo)記基因。在絲狀真菌中進(jìn)行基因替換通常需要500 bp或更長(zhǎng)的同源臂序列[14]。融合PCR法是一種新的用于絲狀真菌打靶載體快速構(gòu)建的方法，通過(guò)三輪 PCR可直接獲得三片段的融合產(chǎn)物。首先利用融合 PCR實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因替換的是構(gòu)巢曲霉Aspergillus nidulans (Eidam) Winter、煙曲霉 A. fumigatus Fres.及禾谷鐮刀菌 Fusarium graminearum Schw.等。

利用在大腸桿菌中表達(dá)的 Lambda噬菌體的Red系統(tǒng) (gam，bet，exo) 構(gòu)建置換型打靶載體是一種獲得大片段同源臂的有效方法，該方法已成功地用于構(gòu)巢曲霉基因的敲除[15]。步驟包括：從基因組文庫(kù)中得到含有曲霉目標(biāo)基因及其鄰近基因的cosmid；擴(kuò)增帶有大腸桿菌/真菌雙重篩選標(biāo)記的PCR片段，兩端各有50 bp左右與目標(biāo)基因同源的序列；在大腸桿菌中借助Lambda噬菌體的Red系統(tǒng)用篩選標(biāo)記替換cosmid上的待敲除基因，從而獲得帶有大片段同源序列 (目標(biāo)基因的鄰近基因) 的重組cosmid；將此重組載體導(dǎo)入構(gòu)巢曲霉中，由于其同源臂很長(zhǎng)所以大大提高了同源重組的效率。

轉(zhuǎn)座子隊(duì)列敲除 (Transposon-arrayed gene knockout，TAGKO) 可以用于多個(gè)目標(biāo)基因替換載體的構(gòu)建。該方法首先構(gòu)建真菌cosmid基因組文庫(kù)，篩選含有目標(biāo)基因的cosmid。通過(guò)轉(zhuǎn)座酶的酶促反應(yīng)，攜帶篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)座子Tn7隨機(jī)整合入cosmid，破壞其中的基因。帶有被轉(zhuǎn)座子破壞的基因的cosmid可直接作為目標(biāo)載體通過(guò)原生質(zhì)體或孢子電擊轉(zhuǎn)化，對(duì)染色體上的基因進(jìn)行置換。TAGKO可以誘導(dǎo)高頻率目標(biāo)基因替換的原因可能是該方法構(gòu)建的打靶載體通常含有較長(zhǎng)的同源序列 (約40 kb)。該方法亦是發(fā)現(xiàn)新基因及對(duì)基因功能進(jìn)行分析的有效方法。

在真核生物細(xì)胞內(nèi)存在兩種 DNA雙鏈斷裂修復(fù)機(jī)制：一種是同源重組 (Homologous recombination，HR)，一種是非同源末端結(jié)合 (Non-homologous End Joining，NHEJ)?；蚯贸饕抢昧送粗亟M (HR) 的原理。非同源末端連接 (NHEJ) 是真核生物細(xì)胞在不依賴(lài)DNA同源性的情況下，為了避免因DNA或染色體斷裂造成的DNA降解或?qū)ιΦ挠绊?，?qiáng)行將2個(gè)DNA斷端彼此連接在一起的一種特殊的修復(fù)機(jī)制。這一途徑的存在使得打靶載體被隨機(jī)整合到染色體上，從而大大降低了同源重組子的獲得頻率。在哺乳動(dòng)物中 NHEJ途徑占據(jù)主導(dǎo)地位，而在酵母細(xì)胞中則主要由 HR途徑修復(fù)?，F(xiàn)已確定在絲狀真菌中NHEJ占主導(dǎo)地位，這也是為什么在黑曲霉等絲狀真菌中難以實(shí)現(xiàn)定向遺傳操作的原因。Ku70和Ku80是NHEJ途徑中的核心因子，如果將其敲除則 NHEJ途徑被破壞，那么此時(shí) HR途徑將占據(jù)主導(dǎo)地位，從而大大提高同源重組的效率。自從2004年Ninomiya等[16]成功地將粗糙鏈孢霉中的Ku70和Ku80敲除而實(shí)現(xiàn)了同源重組效率的大幅提升后，這項(xiàng)方法很快被應(yīng)用到構(gòu)巢曲霉[17]、黑曲霉[7]、米曲霉[18-19]、醬油曲霉[18-19]中。黑曲霉敲除Ku70及 (或) Ku80后可以實(shí)現(xiàn)近乎100%的同源重組率，而野生型僅為10%~30%。

Khang等開(kāi)發(fā)了針對(duì)絲狀真菌的正反雙重篩選體系[20]，正選擇標(biāo)記可以篩選出發(fā)生重組的轉(zhuǎn)化子，反選擇標(biāo)記排除發(fā)生非同源重組的轉(zhuǎn)化子，其應(yīng)用大大提高了同源重組突變體篩選的效率。這種方法中用到的反選擇標(biāo)記是皰疹單純病毒胸苷激酶(Herpes simplexvirus thymidine kinase，HSVtk)，可以將核苷類(lèi)似物 5-fluoro-2-deoxyuridine (F2dU) 轉(zhuǎn)化為一種真菌毒性化合物。將HSVtk 基因置于載體目標(biāo)基因同源區(qū)的外側(cè)，異位插入的轉(zhuǎn)化子因無(wú)法發(fā)生第2次同源重組因而攜帶該基因，在F2dU 存在的情況下無(wú)法存活；而同源突變體因發(fā)生第 2次同源重組而去除了HSVtk 基因，可以在F2dU篩選平板上形成菌落。通過(guò)上述雙重篩選體系獲得的轉(zhuǎn)化子理論上就是目標(biāo)突變體。

在構(gòu)建黑曲霉細(xì)胞工廠時(shí)，因?yàn)橐贸?改變多個(gè)位點(diǎn)，篩選標(biāo)記不能留在染色體上，因此實(shí)現(xiàn)無(wú)痕敲除非常重要。我們參照在細(xì)菌中廣泛應(yīng)用的基于反向篩選的敲除策略，提出了在黑曲霉中實(shí)現(xiàn)無(wú)痕敲除的策略 (圖 4)。將要敲除的目標(biāo)基因的左右臂連接，正向與反向篩選標(biāo)記串聯(lián)置于其一側(cè)。第1次重組的過(guò)程中利用正向篩選標(biāo)記進(jìn)行篩選 (圖4A)，第2次重組則利用反向篩選標(biāo)記篩選。第2次重組后會(huì)出現(xiàn)兩種情況：一種為重組出現(xiàn)在預(yù)定位置，基因敲除成功 (圖4B)。第二種情況為二次交換仍在第一次交換時(shí)的位置進(jìn)行，則二次重組恢復(fù)成野生型 (圖4C)。而異位插入的情況則較好排除，因?yàn)樵谥滤阑虼嬖谙绿砑酉鄳?yīng)底物會(huì)使異位插入轉(zhuǎn)化子致死。

3.2 黑曲霉表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)化

黑曲霉具有較高的蛋白質(zhì)分泌能力、與高等真核生物類(lèi)似的翻譯后加工能力、成熟的發(fā)酵工藝和生物安全性等優(yōu)點(diǎn)，因而成為新一代微生物高效表達(dá)分泌系統(tǒng)的研究熱點(diǎn)。對(duì)黑曲霉表達(dá)系統(tǒng)優(yōu)化改良的工作包括選用強(qiáng)啟動(dòng)子、增加基因拷貝數(shù)、構(gòu)建蛋白酶缺陷突變株、進(jìn)行基因融合等。

圖4 一種黑曲霉無(wú)痕敲除策略原理Fig. 4 A proposed strategy for scarless gene knockout in Aspergillus niger.

3.2.1 強(qiáng)啟動(dòng)子

利用強(qiáng)啟動(dòng)子增加外源基因在黑曲霉中的表達(dá)是一種最為常見(jiàn)的分子操作手段。在黑曲霉中獲得應(yīng)用的強(qiáng)啟動(dòng)子一般來(lái)自于絲狀真菌高效表達(dá)的基因，常用的比如構(gòu)巢曲霉和黑曲霉自身的編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因 (Glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase，gpdA) 的啟動(dòng)子[21-22]、黑曲霉糖酵解途徑組成型丙酮酸激酶基因 (Constitutive glycolytic pyruvate kinase，pkiA) 的強(qiáng)啟動(dòng)子[23-24]等。將目標(biāo)基因與強(qiáng)啟動(dòng)子偶聯(lián)，轉(zhuǎn)化黑曲霉從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的高效表達(dá)。Liu等[25]將黑曲霉糖化酶基因上游激活蛋白結(jié)合位點(diǎn)以多重拷貝的形式插入一個(gè)表達(dá)型質(zhì)粒的啟動(dòng)子區(qū)，改造后的啟動(dòng)子大大提高了外源基因的表達(dá)水平。

3.2.2 增加基因拷貝數(shù)

增加外源基因在絲狀真菌中的拷貝數(shù)，能顯著增加重組蛋白的表達(dá)產(chǎn)量。江南大學(xué)王正祥研究組發(fā)現(xiàn)，在黑曲霉染色體整合2~3倍糖化酶基因時(shí)，糖化酶的合成量比野生型提高了17.5%[26]。

3.2.3 利用蛋白酶缺陷菌株

黑曲霉自身能產(chǎn)生一些胞內(nèi)或胞外蛋白酶，能導(dǎo)致過(guò)量表達(dá)的目標(biāo)蛋白的降解。為了克服這一困難，往往采用遺傳誘變或插入失活的方法得到一些蛋白酶缺陷的黑曲霉。劉麗等[27]通過(guò)紫外誘變得到一株胞外酸性蛋白酶活力僅為原株 0.76%的菌株。其生長(zhǎng)特性和產(chǎn)糖化酶活力與原株基本一致，但報(bào)告基因VHb的分泌表達(dá)水平卻遠(yuǎn)高于原始菌株，由此證明酸性蛋白酶缺陷對(duì)保護(hù)外源蛋白產(chǎn)生了顯著效果。

3.2.4 基因融合

為了提高目標(biāo)基因的分泌表達(dá)率，防止表達(dá)蛋白被降解，在黑曲霉中也常采用基因融合的方法，即把一個(gè)在黑曲霉中能高效表達(dá)的基因截短然后與目標(biāo)基因首尾相連構(gòu)建表達(dá)載體，在黑曲霉中進(jìn)行表達(dá)。融合蛋白可以增加表達(dá)蛋白的可溶性，有利于蛋白的純化。Karnaukhova等[28]將人類(lèi)的 α蛋白酶抑制因子 (Alpha1-PI) 與黑曲霉中能夠高效表達(dá)分泌的葡糖淀粉酶G2 (Glucoamylase G2) 相融合，從而將這種原本只能極微量獲得的抑制因子產(chǎn)量大大提高，其分泌的有活性的融合蛋白達(dá)到12 mg/L。

3.3 篩選標(biāo)記

遺傳轉(zhuǎn)化通常是小概率事件，從大量的未轉(zhuǎn)化細(xì)胞(原生質(zhì)體) 背景中篩選出正向轉(zhuǎn)化子必須依賴(lài)于適當(dāng)?shù)倪z傳標(biāo)記，遺傳標(biāo)記可以是原養(yǎng)型生長(zhǎng)、藥物或抗生素抗性、報(bào)告基因產(chǎn)生顏色等視覺(jué)特征等。

最初篩選絲狀真菌轉(zhuǎn)化子多是利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，通過(guò)將目標(biāo)基因與營(yíng)養(yǎng)缺陷的野生型等位基因連鎖轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株中，在基本培養(yǎng)基中篩選原養(yǎng)型生長(zhǎng)菌落而得到轉(zhuǎn)化子。目前，主要用于黑曲霉轉(zhuǎn)化的營(yíng)養(yǎng)缺陷型標(biāo)記基因有 pyr (嘧啶)、trp (色氨酸)、niaD (硝酸還原酶) 等。但是生產(chǎn)菌株往往不具有營(yíng)養(yǎng)缺陷標(biāo)記，所以一般不能用這種方法實(shí)現(xiàn)目標(biāo)基因的遺傳轉(zhuǎn)化。

在黑曲霉中廣為使用的抗性基因包括潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 (hph) 基因 (對(duì)潮霉素具有抗性)[29-31]、鄰氨基苯甲酸合成酶基因的顯性突變基因 (trp3iar) (對(duì)5-氟吲哚具有抗性)[32]。

報(bào)告基因編碼一類(lèi)特殊的蛋白質(zhì)或者酶，其特點(diǎn)是易于定性甚至定量檢測(cè)。用于黑曲霉轉(zhuǎn)化的報(bào)告基因主要有 E.coli β-半乳糖苷酶基因 (lacZ)[33]、E. coli β-葡糖苷酶基因 (gus)[12]。這些報(bào)告基因編碼的酶可以催化指示化合物發(fā)生顯色反應(yīng)，不僅能夠直觀地指示正向轉(zhuǎn)化子，而且可以據(jù)此對(duì)基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量，用于測(cè)量啟動(dòng)子啟動(dòng)效率或者測(cè)量轉(zhuǎn)錄調(diào)控關(guān)系。

3.4 轉(zhuǎn)化方法

外源 DNA 導(dǎo)入黑曲霉中最普遍使用的方案是CaCl2/PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法。首先是用溶壁酶處理菌絲體或萌發(fā)的孢子獲得原生質(zhì)體，將原生質(zhì)體、外源載體DNA混合于一定濃度的CaCl2、PEG (聚乙二醇) 緩沖液中進(jìn)行融合轉(zhuǎn)化。然后將原生質(zhì)體涂布于再生培養(yǎng)基中培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化子。1994年日本的 Ozeki等在黑曲霉中建立了孢子電轉(zhuǎn)化法[34]。電轉(zhuǎn)化孢子的方法較原生質(zhì)體法簡(jiǎn)單、高效，在多種絲狀真菌已有應(yīng)用實(shí)例，是粗糙鏈孢霉遺傳轉(zhuǎn)化的主要方法之一。孢子電轉(zhuǎn)化的過(guò)程主要包括：收集培養(yǎng)至少8 d的孢子；將孢子用冷凍山梨醇反復(fù)沖洗3次并懸??；冰上將DNA與細(xì)胞輕柔混勻并電轉(zhuǎn)化；之后加入山梨醇混勻涂平板。

4 討論與展望

黑曲霉可以作為通用細(xì)胞工廠的一個(gè)前提是其生物安全性。FDA已經(jīng)認(rèn)定黑曲霉的安全性屬于GRAS (Generally regarded as safe，通常認(rèn)為是安全的)?；蚪M數(shù)據(jù)和對(duì)黑曲霉遺傳代謝、蛋白質(zhì)分泌分子機(jī)制的理解進(jìn)一步推動(dòng)了將黑曲霉開(kāi)發(fā)為細(xì)胞工廠的研究活動(dòng)。黑曲霉蛋白質(zhì)分泌途徑的認(rèn)識(shí)和改造研究非?；钴S，包括荷蘭帝斯曼及合作者、丹麥技術(shù)大學(xué)和德國(guó)不倫瑞克工業(yè)大學(xué)等多個(gè)有競(jìng)爭(zhēng)力的團(tuán)隊(duì)，有希望在不久的將來(lái)，全面解析其高效蛋白質(zhì)分泌的分子機(jī)理，將黑曲霉開(kāi)發(fā)成為一個(gè)通用的工業(yè)酶和異源蛋白質(zhì)表達(dá)的載體。在代謝工程改造方面，Jens Nielsen的團(tuán)隊(duì)在改造黑曲霉生產(chǎn)琥珀酸、蘋(píng)果酸和檸檬酸方面作了一些工作[35-36]。

另外黑曲霉也可以被開(kāi)發(fā)為次級(jí)代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的細(xì)胞工廠。近年來(lái)不斷發(fā)現(xiàn)黑曲霉可以產(chǎn)生多種次級(jí)代謝產(chǎn)物。經(jīng)過(guò)鑒定的不同次級(jí)代謝物就有140多種，其諸多次級(jí)代謝物在食品、飼料及生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)中都有很好的應(yīng)用并且被認(rèn)為是安全的?；蚪M數(shù)據(jù)也揭示了黑曲霉產(chǎn)生眾多次級(jí)代謝產(chǎn)物的分子基礎(chǔ)[3]，包括數(shù)個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物基因簇。黑曲霉基因組上有17個(gè)非核糖體肽合成酶 (NRPS) 和34個(gè)聚酮合成酶 (PKS)。但是近期關(guān)于曲霉次級(jí)代謝產(chǎn)物赭曲霉毒素A及煙曲霉毒素B2的毒性問(wèn)題也提醒我們不能因?yàn)楹谇咕哂蠫RAS認(rèn)證就忽視了對(duì)其安全性的關(guān)注。

構(gòu)建黑曲霉細(xì)胞工程的工作還剛剛起步，距離應(yīng)用還有相當(dāng)大的距離。隨著黑曲霉遺傳操作工具的不斷成熟，可以預(yù)見(jiàn)將有更多的團(tuán)隊(duì)加入到黑曲霉的改造活動(dòng)中，黑曲霉作為細(xì)胞工廠生產(chǎn)工業(yè)酶、異源蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、次級(jí)代謝產(chǎn)物等將呈現(xiàn)日益美好的前景。

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