魚油對外周動脈疾病的治療作用和機制研究

石 駿

(四川省南溪縣人民醫(yī)院 644100)

本研究證明CD44和CD44v3在炎癥性疾病PAD患者外周血單核細(xì)胞上有較高的表達,并且該高表達可以被魚油下調(diào)。

1 臨床資料

1.1 研究人群 研究方案包括了PAD患者和健康受試者,該研究獲得了倫理委員會的同意,并給每位受試者簽署了知情同意書。納入患有癥狀性PAD(穩(wěn)定的間歇性跛行)、踝臂壓力指數(shù)小于0.9的男性患者和健康男性對照。排除了嚴(yán)重下肢缺血或在3個月前曾接受任何形式治療的患者;排除患有任何部位動脈疾病或踝臂壓力指數(shù)小于0.9的健康對照。健康對照均不能患有糖尿病、慢性炎癥疾病,或正在接受免疫抑制治療;被排除者還包括未受到良好控制的高血壓患者(收縮壓大于160 mm Hg,舒張壓大于90mm H g),或在過去的5年內(nèi)曾患有惡性疾病的患者,未服用魚油膠囊或每周吃1條以上的魚的患者。受試者在采血前2周內(nèi)無感冒或輕度感染。

1.2 實驗設(shè)計 試驗開始時,所有患者和受試者在饑餓狀態(tài)下采血以檢測各項指標(biāo)的基線水平,血樣收集在 CPDA或EDTA抗凝的樣品管中,并讓血樣在室溫下凝集1 h。所有的受試者每天服用6×1 g的魚油膠囊共12周,這樣能夠保證每天攝入1.02 g二十五碳五烯酸和0.69 g的二十二碳六烯酸。12周后第2次采集饑餓狀態(tài)下的血樣。

1.2.1 血漿三酰甘油和膽固醇的測量 采用標(biāo)準(zhǔn)色度法,檢測血漿三酰甘油、總高密度脂蛋白膽固醇和總低密度脂蛋白膽固醇的濃度。

1.2.2 血液單核細(xì)胞分離 從CPDA保存的血樣中分離單核細(xì)胞。采用6%的葡聚糖沉淀法除去紅細(xì)胞,得到的富含白細(xì)胞的血漿在Nycoprep1.068上進行分層,并在室溫下采用650 r/m in離心15m in,除去上層成分,含單核細(xì)胞的成分轉(zhuǎn)移入新鮮的試管,然后用含0.3%的小牛血清清蛋白的PBS的洗滌。在6 m L的PBS-A中重新懸浮細(xì)胞,300 r/m in離心7m in以除去血小板。

1.2.3 流失細(xì)胞儀 對CPDA保存的全血樣進行流式細(xì)胞分析。采用Serotec公司生產(chǎn)的結(jié)合藻紅蛋白(PE)的抗CD14抗體和結(jié)合異硫氰酸熒光素(FITC)的抗CD54或抗CD44抗體進行標(biāo)記。采用抗鼠的IgG1-FITC抗體和抗鼠的IgG2a-PE抗體作為同種型的對照抗體以明確背景色情況。黑暗狀態(tài)下在飽和濃度的抗體培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞30 min,用PBS-A洗滌,在BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀上采用Ce llquest軟件進行分析。表達CD14的細(xì)胞被認(rèn)為是單核細(xì)胞。采集單核細(xì)胞表面的CD44或CD54的中位熒光強度。

1.2.4 CD44v3測定 在平底96孔組織培養(yǎng)皿上培養(yǎng)單核細(xì)胞,培養(yǎng)基包括:0.75 mmoL的 L-谷氨酸、0.1 mg/m L的鏈霉素、0.1mg/m L的青霉素和5%的自體血清。每孔加入100 uL的培養(yǎng)基和3×104個細(xì)胞。部分培養(yǎng)的細(xì)胞接受10mg/m L的細(xì)菌內(nèi)毒素的刺激。20 h后,采用500 g(重力常數(shù))的離心力對培養(yǎng)皿進行離心,并將培養(yǎng)基換成冰塊冷卻的100 u L 2%甲醛,在4℃下固定細(xì)胞15m in。棄去甲醛,風(fēng)干細(xì)胞,將培養(yǎng)皿用石蠟封口,-20℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

解凍培養(yǎng)皿后,用含0.15%的 Tw een20(Sigma公司)的PBS液沖洗。1%的清蛋白阻斷非特異性結(jié)合后,培養(yǎng)孔用PBS-Tw een液洗滌,再和 100μL 1μg/m L的鼠抗人CD44v3克隆或?qū)φ湛贵w共同孵育。用2%山羊血清阻斷非特異性結(jié)合,100μL 0.5μg/m L的辣根過氧化物酶結(jié)合的羊抗鼠多克隆抗體STAR77(Sigma公司)共同孵育。再用PBS-Tw een洗滌培養(yǎng)皿,鄰苯二胺(Dako Cytomation)著色,100μL 1 mol/L的硫酸阻斷反應(yīng)。將培養(yǎng)皿在490 nm下,用Titretek+MS2平皿閱讀器閱讀。記錄 2次光密度值(OD)的平均值,以CD44v3孔減去兩個對照孔的平均值作為最后結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 PAD患者和健康受試者的一般情況比較 48例PAD患者(年齡45～84歲)和 54例健康對照(年齡 46～84歲)被納入研究。兩組受試者的一般情況比較見表1。高密度脂蛋白膽固醇比率和血漿三酰甘油濃度這一指標(biāo)兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義,C反應(yīng)蛋白的濃度PAD組高于對照組。

表1 PAD患者和健康對照組的一般情況比較

表1(續(xù)) PAD患者和健康對照組的一般情況比較

2.2 魚油在調(diào)節(jié)PAD患者單核細(xì)胞CD44表達中的作用來源于PAD患者的單核細(xì)胞CD44的表達高于對照組,中位熒光強度分別為(480±27.8)OD和(336±25.1)OD(P＜0.05)。給予膳食補充魚油12周后,PAD患者血單核細(xì)胞CD44的表達有所下降,中位熒光強度給藥前為(480±27.8)OD,給藥后為(427±26.2)OD(P＜0.05),但對照組患者的變化不明顯,中位熒光強度給藥前為(336±25.1)OD,給藥后為(355±28.0)OD,圖 1。

圖1 兩組外周血單核細(xì)胞的CD44表達在服用魚油前后的變化(P＜0.05)

2.3 培養(yǎng)單核細(xì)胞CD44v3的表達 PAD患者來源的單核細(xì)胞CD44v3的表達低于健康對照者來源的單核細(xì)胞,PAD患者(0.15±0.15)OD,對照組(0.22±0.14)OD,P＜0.05。補充魚油能夠增加PAD患者來源的單核細(xì)胞的CD44v3的表達,給藥前(0.15±0.15)OD,給藥后(0.27±0.23)OD,P＜0.05。但是不能增加對照組來源的單核細(xì)胞CD44v3的表達,給藥前(0.22±0.14)OD,給藥后(0.17±0.1)OD,P＜0.05。

3 討 論

本研究顯示,PAD患者外周血單核細(xì)胞CD44表達量高于健康對照組。K rettek等[1]的Western blot檢驗結(jié)果表明血管粥樣斑塊中CD44的含量高于對照組,與本研究結(jié)果相似。本研究發(fā)現(xiàn)動脈粥樣硬化患者外周血單核細(xì)胞CD44表達量較健康對照組高,且飲食中添加魚油可降低動脈粥樣硬化患者外周血單核細(xì)胞CD44的表達量,而對健康對照組無影響。

CD44與HA的結(jié)合對 HA的分解代謝起重要作用,而HA分解后產(chǎn)生的20 kDa亞單位可激活炎性細(xì)胞因子和基質(zhì)金屬蛋白酶,以及促進內(nèi)皮細(xì)胞損傷[2]。魚油飲食可降低某些炎性反應(yīng)標(biāo)志物的水平[3]。因此,魚油飲食降低炎性反應(yīng)的作用機制,很可能是降低外周血單核細(xì)胞CD 44表達量,從而降低HA的分解代謝。

根據(jù)魚油飲食可降低血管疾病患者外周血單核細(xì)胞CD44表達量的研究結(jié)果,作者提出假設(shè)——魚油飲食通過降低外周血單核細(xì)胞CD44的表達量,從而降低H A的分解代謝,減少HA分解所產(chǎn)生的炎癥誘發(fā)因子,最終減弱泌物阻塞,在中葉開口周圍分布有三組淋巴結(jié),當(dāng)受到炎癥刺激后,局部的淋巴結(jié)變得腫大,壓迫支氣管從而導(dǎo)致管腔狹窄[3]。但據(jù)本組病例中在纖維支氣管鏡下所見,在右中葉管口除了有炎癥改變之外,大部分未見管口狹窄引流不暢改變,絕大多數(shù)管腔是完整的。因此我們認(rèn)為,右中葉肺不張發(fā)生率相對較高,右中葉不張可能與肺泡表面活性物質(zhì)相對減少有關(guān)[4]。

3.3 纖維支氣管鏡檢查及治療 病因的檢出率:本組76例老年肺不張患者,病因經(jīng)纖維支氣管鏡檢出率達92.1%。病因中肺癌占據(jù)首位,占總數(shù)的64.5%,故應(yīng)積極進行檢查,以便及早進行相關(guān)治療。

纖維支氣管鏡檢查及治療:通過纖維支氣管鏡可直接窺見患者肺不張支氣管內(nèi)的形態(tài)變化。從鏡檢與病理結(jié)果的對比中可以發(fā)現(xiàn),癌癥肺不張通常病變多表現(xiàn)為結(jié)節(jié)、菜花樣及息肉樣,向管壁阻塞、浸潤,多見于未分化癌[6];表面有壞死組織及水腫偽膜,活檢質(zhì)脆,容易出血者一般為鱗癌。支氣管內(nèi)膜結(jié)核表現(xiàn)為黏膜肥厚狹窄、糜爛潰瘍、充血水腫、瘢痕狹窄,與鄰近支氣管黏膜無明顯界限,有較廣泛的浸潤病變,有時呈多形性、多發(fā)性肉芽腫,腫塊質(zhì)軟韌。炎癥所致肺不張大部分為水腫、黏膜充血、膿性分泌物形成膿栓或堵塞。

通過纖維支氣管鏡可以對患者病變部位活檢、刷檢,可以明確病因。本組76例患者的診斷率為92.1%。通過纖維支氣管鏡檢查不但可以對惡性病變得出明確的診斷結(jié)果,進而指導(dǎo)以后的治療,對于良性病變,更可以通過纖維支氣管鏡吸凈血塊、分泌物等異物,促進患者的肺部復(fù)張。對于吸引出的分泌物進行細(xì)菌學(xué)培養(yǎng),使得結(jié)果更為可靠,從而可以指導(dǎo)對患者進行相關(guān)的抗感染用藥治療。纖維支氣管鏡檢查操作方便,只要術(shù)中注意監(jiān)護,操作熟練輕巧,很少出現(xiàn)嚴(yán)重的并發(fā)癥,本組中無1例出現(xiàn)氣胸、喉痙攣、心搏呼吸驟停等嚴(yán)重并發(fā)癥。因此,老年人肺不張經(jīng)纖維支氣管鏡檢查是一項有效、安全、必不可少的診斷手段。

綜上所述,運用纖維支氣管鏡檢查老年肺不張,是明確病因的一種非常重要的方法。應(yīng)及早進行,及早確診,為患者的治療掌握先機。

[1]李一耕.纖維支氣管鏡在肺科疾病中的應(yīng)用[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2001,24(7):389.

[2]劉淑華,陳志雄.肺不張的臨床纖維支氣管鏡及病理檢查特征分析[J].醫(yī)師進修雜志,2004,27(11):31.

[3]鄭逸華,毛娟華,王偉華.床邊纖維支氣管鏡治療肺不張47例分析[J].中國基層醫(yī)藥,2004,11(10):1224.

[4]侯長毅,趙淑娟,趙秉坤.67例肺不張纖維支氣管鏡檢查分析[J].中國基層醫(yī)藥,2006,13(10):1728.

[5]段敏超,李家萱.纖維支氣管鏡檢查肺不張86例臨床分析[J].廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2006,23(2):297.

[6]劉健,欒燕,胡小平,等.纖維支氣管鏡檢查107例肺不張

病因分析[J].江西醫(yī)藥,2006,41(12):1029.