花粉管通道法在玉米轉(zhuǎn)基因育種中的應(yīng)用

李向龍，張力全，張曉東

（北京農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，北京 100089）

玉米是世界主要糧食飼料和工業(yè)原料之一，隨著社會的不斷進(jìn)步，世界各國對玉米的需求量逐年增加。預(yù)計到2020年，發(fā)展中國家對玉米的需求量估計會比1995年增加50%，到2030年,我國的玉米需求量將會達(dá)到1.60億 ～1.75億t[1]。但是，目前的玉米生產(chǎn)和玉米育種中面臨著推廣品種單一化、育種材料遺傳基礎(chǔ)越來越狹窄、基因庫日益貧乏的問題，加之常規(guī)育種周期長，預(yù)見性差，故20世紀(jì)70年代以來，研究者開始利用基因轉(zhuǎn)化方法 （如EFG介導(dǎo)原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法、電激轉(zhuǎn)化法、子房注射法以及花粉管通道法等）定向改造玉米的某些性狀，加快了玉米的育種進(jìn)程[2]。本文就目前玉米自交系轉(zhuǎn)基因育種中花粉管通道法應(yīng)用的研究成果作一綜述。

1 花粉管通道法的提出

花粉管通道法是我國科學(xué)家周光宇在1983年首次在“Methods in Enzymology”報道的研究成果。其原理是將外源DNA片段在作物受粉后特定時期注入柱頭或花柱，外源DNA沿著花粉管通道或傳遞組織通過珠心進(jìn)入胚囊，轉(zhuǎn)化不具備正常細(xì)胞壁的受精卵、合子及早期胚胎細(xì)胞[3]?；ǚ酃芡ǖ婪ㄗ詥柺酪詠?，引起國際上的廣泛關(guān)注，美、歐、亞等一些實驗室將這一技術(shù)應(yīng)用于稻、麥、棉、豌豆、牧草等基因重組和總DNA導(dǎo)入的研究中，其中在水稻、小麥等糧食作物上的應(yīng)用比較多，在一定程度上拓寬了其種質(zhì)基礎(chǔ)，但在改良玉米育種中應(yīng)用較少。

2 花粉管通道法在玉米改良上的應(yīng)用

2.1 研究內(nèi)容

目前，花粉管通道法用于改良玉米自交系的研究主要集中在抗蟲、抗除草劑以及提高植株抗逆性上，其中抗除草劑和抗Bt蟲蛋白基因的研究成果顯著，孟山都和先正達(dá)兩個國際知名公司已將其推廣應(yīng)用于生產(chǎn)中。

2.2 研究成果

在玉米自交系改良中，國內(nèi)外學(xué)者利用花粉管通技術(shù)獲得的品種有30多個。1986年Ohta在美國科學(xué)道技術(shù)取得了大量有價值的成果，據(jù)統(tǒng)計，每年利用此院報上報道應(yīng)用外源 DNA與玉米花粉混合授粉，得到F0轉(zhuǎn)化率高達(dá)10%的胚乳基因轉(zhuǎn)移[4]。王秀君等采用花粉管通道法將含有耐草甘膦基因mG2-epsps的植物表達(dá)載體pUmG2導(dǎo)入優(yōu)良玉米自交系X90中，經(jīng)檢測有陽性植株為29株[5]。張慧英等提取甘蔗DNA，采用該方法將其導(dǎo)入普通玉米自交系普7313，從自交后代中選出2個葉綠素、可溶性糖、蛋白質(zhì)含量均比對照提高的優(yōu)良株系；他們還將提取的糯質(zhì)玉米12-9-10 DNA導(dǎo)入甜玉米自交系孟加拉超甜玉米，其后代產(chǎn)生了株高、穗位高、葉面積等性狀上的變異[6,7]。王罡等采用該技術(shù)，以生產(chǎn)上7922等9個優(yōu)良玉米自交系為材料，將Bt殺蟲蛋白基因?qū)肫渲?，最終得到3株抗性轉(zhuǎn)化植株[8]。關(guān)淑艷等利用該技術(shù)將淀粉分支酶基因的反義表達(dá)載體轉(zhuǎn)入玉米自交系鐵7922、吉853、丹 340、Mo17、5003 和春 09 中，初步證明外源目的基因已整合到玉米基因組中，并得到了轉(zhuǎn)化植株的種子[9]。劉丹梅以抗蟲的胰蛋白酶抑制劑基因(CpTI)為供體，以8個品種玉米為受體進(jìn)行外源DNA直接導(dǎo)入，通過對抗性植株的初步分子鑒定，證實外源CpTI基因存在并整合入獲得的玉米基因組植主中[10]。此外，研究者還在玉米自交系抗逆性上取得一定成果，例如丁群星等研究發(fā)現(xiàn)玉米矮花葉病毒 (MDMV)B株外殼蛋白在轉(zhuǎn)基因植株中表現(xiàn)出對MDMV的抗性；張永勝等人還研究了將抗旱耐鹽基因以及抗葉斑病基因?qū)胗衩鬃越幌抵?，并獲得了初步成功[11,12]。

2.3 花粉管通道法轉(zhuǎn)化方式

花粉管通道法將外源DNA導(dǎo)入玉米自交系中的轉(zhuǎn)化方式有柱頭滴加法、花粉粒攜帶法、子房微注射法、開苞導(dǎo)入法等。但筆者結(jié)合自身經(jīng)歷，認(rèn)為柱頭滴加法不論從轉(zhuǎn)化效率還是對幼穗的傷害程度上都有一定的優(yōu)勢。該方法的主要技術(shù)手段是選取自交授粉后18～26 h的玉米果穗，剪去距穗頂部l cm以上的苞葉和花絲，將DNA滴在切口處，外源DNA經(jīng)花粉進(jìn)入時形成的通道進(jìn)入幼胚，從而完成外源DNA導(dǎo)入過程。1995年祁永紅等報道了利用豬頭滴加法成功將外源總DNA導(dǎo)入玉米自交系，此后又有研究者陸續(xù)報道了利用該法獲得了具有廣泛變異的不同類型的玉米自交系[13 ～15]。

3 花粉管通道法應(yīng)用前景展望

花粉管通道法優(yōu)勢眾所周知，其在玉米自交系轉(zhuǎn)基因育種中應(yīng)用越來越普遍，但其轉(zhuǎn)化效率低仍然是制約其應(yīng)用的瓶頸，如何進(jìn)一步提高其導(dǎo)入率將是今后很長一段時間研究的重點；此外，對玉米受粉后花粉管通道形成的生理機制、導(dǎo)入外源DNA的最佳時間以及轉(zhuǎn)基因后代可能產(chǎn)生的變異等還不能很好的解決，這在一定程度上將限制其發(fā)展。今后，應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步完善分子育種技術(shù)的理論和應(yīng)用研究，以充分發(fā)揮其簡便快速的優(yōu)勢，提高育種水平，培育出更多更好的優(yōu)良新品種。

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