大鼠體外循環(huán)模型研究進(jìn)展

龍 翔,晏 浩,徐建軍

自體外循環(huán)(cardiopulmonary bypass,CPB)技術(shù)上世紀(jì) 50年代運(yùn)用于臨床后,相關(guān)技術(shù)迅猛發(fā)展,但是圍 CPB期有關(guān)病理生理、物理損害和血流動(dòng)力學(xué)改變等尚有諸多不明確因素[1-6]。為了闡明這一病理生理學(xué)過程,許多學(xué)者作了相關(guān)研究,以往較多為大動(dòng)物模型,如兔、狗、羊和豬等[7-11],但建立這些模型費(fèi)用昂貴、技術(shù)要求高、管理不便以及難以長(zhǎng)期生存,故發(fā)展受到限制。大鼠的循環(huán)系統(tǒng)和人類十分相似,而且管理方便、手術(shù)操作簡(jiǎn)便和易長(zhǎng)期存活,故以大鼠為體外模型可以系統(tǒng)的研究體外循環(huán)圍手術(shù)期病理生理改變機(jī)制。至今,關(guān)于大鼠體外循環(huán)模型的報(bào)道逐漸增加,且取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步,現(xiàn)將大鼠體外循環(huán)模型研究現(xiàn)狀做一綜述。

1 研究歷史

上個(gè)世紀(jì) 60年代,Popovic等[12]首先報(bào)道了低溫大鼠體外循環(huán)模型,他們使用的裝置包括:滾壓泵、薄膜式氧合器、熱交換器、濾泡器和靜脈儲(chǔ)血器等,血液由右心室通過重力作用引流,最后泵入頸動(dòng)脈。整套系統(tǒng)的預(yù)充量為 13.7ml,其中氧合器占了 11.3m l。實(shí)驗(yàn)當(dāng)中,他們首先將穿刺好血管通道的大鼠冷卻到 14℃,然后連接好各管道進(jìn)行低溫(14.0±0.2)℃轉(zhuǎn)機(jī),之后大鼠體溫升至 22℃停止轉(zhuǎn)機(jī),轉(zhuǎn)機(jī)過程當(dāng)中,采用“平衡灌注法”,將大鼠放在天平上,根據(jù)體重調(diào)節(jié)灌注流量。灌注流量最大為 32m l/(kg·min),低溫時(shí)達(dá)到大鼠心輸出量的80%,常溫時(shí)達(dá)到 50%。75只實(shí)驗(yàn)大鼠大部分順利脫機(jī),但未報(bào)道長(zhǎng)期生存。

之后,相繼有一些學(xué)者研究大鼠體外循環(huán)模型,各有特色,但都由于灌注流量、預(yù)充量和長(zhǎng)期生存等問題未得到解決,限制了其發(fā)展。其中 Triggiani等[13]采用開胸建立大鼠體外循環(huán)模型,提出了“三叉戟狀”引流裝置,三個(gè)分支分別引流大鼠的左、右上腔和下腔靜脈,但是轉(zhuǎn)機(jī)流量只有 15～20 ml/(kg·min),轉(zhuǎn)機(jī)時(shí)間短,且脫機(jī)后存活時(shí)間短暫。Alxenade等[14]建立了轉(zhuǎn)機(jī)時(shí)間較長(zhǎng)(＞6 h)的大鼠體外循環(huán)模型,其特色是使用了旋轉(zhuǎn)的盤型氧合器,預(yù)充量為 4.4m l,總預(yù)充量 12m l,預(yù)充液包括 Hartmnan溶液和肝素。其目標(biāo)主要為檢測(cè) CPB過程中血紅蛋白、紅細(xì)胞比容等血液學(xué)指標(biāo),并未考慮大鼠存活。Wehberg等[15]為了研究體外循環(huán)中氧化亞氮調(diào)節(jié)體內(nèi)各器官水潴留的作用開胸建立了流量較大[125 ml/(kg·min)]的大鼠體外模型,右心房引流,左室心尖至升主動(dòng)脈根部的插管,但是預(yù)充量高達(dá)30ml,超過了大鼠的正常血量,所有大鼠均未存活。

2 研究現(xiàn)狀

進(jìn)入 21世紀(jì)后,大鼠體外循環(huán)模型相繼報(bào)道,其主要特色在于全流量、預(yù)充量小甚至無血預(yù)充、低溫或常溫心臟停搏和長(zhǎng)期生存。

2004年,Gua-Hua Dong等[16]報(bào)道了常溫下全流量的大鼠體外循環(huán)長(zhǎng)期存活模型,大鼠氣管插管,機(jī)械通氣,采用內(nèi)徑為 4 mm的靜脈引流管連接置入右心房的穿刺管道引流靜脈血,1.6mm內(nèi)徑的頸動(dòng)脈灌注管道,流量可達(dá)到 100～150 ml/(kg·min)。轉(zhuǎn)機(jī)過程中,保持平均動(dòng)脈血壓為 60～80 mmHg(1mmHg=0.133 kPa),大鼠的心率保持在210～280次/min。他們使用了特殊設(shè)計(jì)的專用動(dòng)物膜肺,交換面積為 0.05 m2,預(yù)充量只有 4 Ml,血?dú)夥治龅慕Y(jié)果顯示它完全可以滿足 60 min的灌流需氧量。這個(gè)模型的總預(yù)充量為 16 ml(新鮮同種異體血液和膠體液各半),恰好為成年大鼠全身血量的一半,這和臨床上的體外循環(huán)較為相似。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,10只體外循環(huán)大鼠能夠存活 2周以上。

Bettina Jungwirth等[17]為了研究深低溫停循環(huán)技術(shù)后大腦損傷的機(jī)制,在 2005年建立了一種新的可長(zhǎng)期存活的深低溫停循環(huán)體外模型,采用 4.5 Fr的多側(cè)孔靜脈引流管道引流右心房靜脈血,20 G穿刺管置入尾動(dòng)脈灌注,體外循環(huán)初始流量達(dá)到160～180m l/(kg· min),隨著降溫(熱交換器、冰袋和冰毯)流量逐漸減半,約半小時(shí)肛溫下降到 16～18℃,大鼠心臟停搏,不同的停搏時(shí)間(0 min、45 min、60 min、75 min、90 min、105 min)后大鼠復(fù)溫 ,同時(shí)恢復(fù)體外循環(huán),復(fù)溫時(shí)間超過 40 min,肛溫至少達(dá)到 35.5℃后停止轉(zhuǎn)機(jī)。他們也采用了特制的膜式氧合器,預(yù)充為 4 Ml,交換面積為 558 cm2。在深低溫停循環(huán)過程中,動(dòng)物不行機(jī)械通氣,但是,在轉(zhuǎn)機(jī)過程中給予吸入氧分?jǐn)?shù)為 0.21的持續(xù)氣道正壓通氣,避免肺膨脹不全。此模型預(yù)充量減少到10 ml,而且無血預(yù)充(使用羥乙基淀粉)。在拔除血管插管后,大鼠仍然予機(jī)械通氣 1小時(shí),同時(shí)收集殘留血液離心(2 000 r/min,10 min)后輸入大鼠體內(nèi)。大鼠恢復(fù)自主呼吸后,將其放置富含氧氣的環(huán)境中12 h自由攝食、攝水。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,大鼠的存活率和深低溫停搏持續(xù)時(shí)間呈劑量負(fù)相關(guān)性。90 min組以下的大鼠基本存活到術(shù)后 14天。

Ralf Günzinger等[18]設(shè)計(jì)了大鼠開胸主動(dòng)脈夾閉和心臟停搏的體外循環(huán)模型,這個(gè)模型也使用了一個(gè)特殊設(shè)計(jì)的膜式氧合器,它的交換面積相對(duì)較大為 0.063m2,預(yù)充量卻很小為 4 ml,此外熱交換器的預(yù)充量為 0.6ml,內(nèi)徑為4mm的12 cm長(zhǎng)的灌注泵硅膠管道預(yù)充為 1.5ml,其他管道預(yù)充為 1m l,加上預(yù)留在靜脈儲(chǔ)血器中的 1 ml,總的預(yù)充量為 8 Ml,采用 4：1的羥乙基淀粉和碳酸氫鈉。避免需要同種異體血液,這與臨床實(shí)踐相符。他們采用右頸靜脈引流和右股動(dòng)脈灌注,但為了監(jiān)測(cè)左室收縮和舒張功能,在大鼠左右頸動(dòng)脈和左頸靜脈均插入了管道,轉(zhuǎn)機(jī)前切開胸骨,阻斷主動(dòng)脈。通過一帶負(fù)壓裝置的靜脈儲(chǔ)血槽,轉(zhuǎn)機(jī)后流量可達(dá)到 120 ml/(kg·min),同時(shí)迅速將肛溫降至 32℃,之后注入高鉀晶體心臟停搏液,停搏 30m in后,主動(dòng)脈開放,復(fù)溫至 37℃。為了檢測(cè)心肌腫瘤壞死因子-a(TNF-a),白介素(IL)-6 mRNA的水平,停機(jī)后 60 min就將大鼠處死。此模型作者主要是采用導(dǎo)管技術(shù)監(jiān)測(cè)術(shù)中左心室收縮舒張功能和術(shù)后心肌組織 TNF-a,IL-6mRNA的水平,并未考慮長(zhǎng)期存活。

Fellery de Lange等[19]在 2008年報(bào)道了閉胸主動(dòng)脈阻斷的大鼠體外循環(huán)和心臟停搏模型。此模型最大的特點(diǎn)是通過 B超引導(dǎo)置入主動(dòng)脈瓣上方的雙腔導(dǎo)管,其前端有一氣囊,可充氣膨大阻斷主動(dòng)脈,也可以通過此導(dǎo)管注射入心臟停搏液。而且他們采用腹壁尾側(cè)淺動(dòng)脈監(jiān)測(cè)血壓,減小了對(duì)大鼠的創(chuàng)傷。他們使用的膜式氧合器,預(yù)充量也為4 ml,交換面積為 558 cm2。整套系統(tǒng)共預(yù)充 10m l羥乙基淀粉。氣管插管機(jī)械通氣,右心房插管引流,尾動(dòng)脈灌注。轉(zhuǎn)機(jī)后保持 150 ml/(kg·min)的流量,15 min后將插入主動(dòng)脈瓣上方導(dǎo)管的氣囊注氣膨大阻斷主動(dòng)脈,同時(shí)注射入適量心臟停搏液,讓心臟停搏30min,停搏過程中通過熱交換器保持體溫在 34℃。之后將氣囊抽空主動(dòng)脈開放,恢復(fù)流量,而且復(fù)溫至37℃。脫機(jī)后繼續(xù)保持機(jī)械通氣一小時(shí),然后將大鼠放置在溫暖和富含氧氣的環(huán)境中復(fù)活。大鼠均存活 14天以上。本實(shí)驗(yàn)還有個(gè)特別之處:采用針狀熱敏電阻置入左側(cè)顳肌下測(cè)量顱骨膜溫度。此模型有諸多優(yōu)點(diǎn):創(chuàng)傷性小、容易存活、心臟停搏時(shí)間和體外循環(huán)轉(zhuǎn)機(jī)時(shí)間的可控性。

3 建立穩(wěn)定實(shí)用、接近臨床的大鼠體外循環(huán)模型

3.1 氧合器和預(yù)充量 整個(gè)循環(huán)通路的預(yù)充量主要取決于氧合器。隨著醫(yī)療科技的發(fā)展,氧合器已經(jīng)從早期使用的鼓泡式過渡到了現(xiàn)在使用的膜式氧合器。早期使用的鼓泡式氧合器預(yù)充量太大,并不適合建立一個(gè)接近臨床的動(dòng)物模型。從目前各實(shí)驗(yàn)室使用的膜肺來看,其交換面積大約為 0.05m2,預(yù)充量為 4ml,這樣循環(huán)通路總預(yù)充量可以控制在 10ml以內(nèi),使得無血預(yù)充得以實(shí)現(xiàn),更加接近于臨床。使用 100%的氧氣在大鼠全流量[150～180 ml/(kg·min)]下,足以滿足大鼠機(jī)體的需氧量,而且在沒有行機(jī)械通氣的情況下,仍然可以達(dá)到足夠的氧合。

3.2 靜脈引流和流量控制 靜脈引流量的大小直接影響到流量的控制,也是模型成功的關(guān)鍵。不同的學(xué)者有不同的觀點(diǎn),前端多孔管道心房插管、多極管道引流、增加心房和儲(chǔ)血槽的落差、虹吸作用和保持儲(chǔ)血槽的負(fù)壓都是增加靜脈引流量的方法。成年大鼠的心輸出量為 150～180m l/(kg·min),平均動(dòng)脈血壓為80mmHg以上。只有灌注流量達(dá)到 150 ml/(kg·min)以上才為真正意義上的全流量模型,以上只有 Bettina Jungwirth[17]等和 Fellery de Lange[19]等的模型達(dá)到此流量。但達(dá)到流量的同時(shí)要考慮血壓的穩(wěn)定和維持。此外,目前實(shí)現(xiàn)主動(dòng)脈順行灌注的最佳方法為頸動(dòng)脈插管。照 Fellery de Lange[19]的插管方法,在頸動(dòng)脈置入一根三腔多功能管,既可阻斷主動(dòng)脈又可向心臟注射入心臟停搏液,還可以進(jìn)行灌注,不失為一種很好的辦法。

3.3 心臟停搏 正中開胸、直接插管、主動(dòng)脈夾閉和注射心臟停搏液,是臨床心臟手術(shù)常規(guī)的步驟。此模型中,不可能追求與臨床完全一致,Ralf Günzinger[18]等的模型除了直接插管外,基本采用臨床模式,同時(shí)雙側(cè)頸動(dòng)脈插管監(jiān)測(cè)心臟功能,大鼠均未存活。Ralf Günzinger[18]等的深低溫停循環(huán)技術(shù)和 Fellery de Lange[19]等的插管主動(dòng)脈阻斷、注射心臟停博液是目前最為實(shí)用的心臟停搏技術(shù)。但是,深低溫停循環(huán)技術(shù)中缺乏完全有效的溫度控制。后者也存在一些潛在的缺陷,動(dòng)脈導(dǎo)管需精確地置于主動(dòng)脈瓣旁。超聲影像是必須的,當(dāng)導(dǎo)管沒有置于最佳位置,會(huì)造成不完全阻斷,氣囊可能會(huì)損害頭壁干或者左心室。如果氣囊注射過大,很可能造成左心室擴(kuò)張。

3.4 術(shù)后存活 體外循環(huán)后大鼠的存活期,對(duì)研究CPB后機(jī)體的病理生理變化機(jī)制及探討臨床保護(hù)策略極其重要。目前大多數(shù)學(xué)者采用纖維喉鏡輔助下的氣管插管技術(shù)或直接插管法建立氣道,避免了氣管切開后帶來的并發(fā)癥問題[16-22]。此外不開胸利于大鼠轉(zhuǎn)流后呼吸功能的恢復(fù)。轉(zhuǎn)流中和轉(zhuǎn)流后的血?dú)?、電解質(zhì)的監(jiān)測(cè)和調(diào)整也是存活的必要條件之一。創(chuàng)傷最小化、保持胸廓的完整性是使動(dòng)物術(shù)后能夠長(zhǎng)期存活的重要條件,預(yù)充液量的大小對(duì)此也有較大影響。Bettina Jungwirth[18]等和 Fellery de Lange[19]等為了提高生存時(shí)間做了如下的處理:轉(zhuǎn)流結(jié)束后繼續(xù)機(jī)械通氣一小時(shí),同時(shí)將殘留血液離心收集紅細(xì)胞輸入大鼠體內(nèi),大鼠恢復(fù)自主呼吸后將大鼠放置溫度適宜、富含氧氣的環(huán)境中讓其自由攝食、攝水。

4 研究展望

理想的大鼠 CPB模型應(yīng)該是操作簡(jiǎn)便、無血預(yù)充、主動(dòng)脈順行灌注、全流量、可控性強(qiáng)和存活時(shí)間長(zhǎng)。Fellery de Lange[19]等的大鼠 CPB模型創(chuàng)傷性小、容易存活、心臟停搏時(shí)間和體外循環(huán)時(shí)間的可控性,似乎接近理想狀態(tài),但是臨床上的正中開胸、心臟直接插管等常規(guī)步驟沒有實(shí)施。我們的目標(biāo)是追求一個(gè)理想的和臨床大致相似的大鼠 CPB模型裝置,但是正中開胸,直接插管等必然會(huì)明顯降低大鼠存活率。為解決這一矛盾,隨著醫(yī)療科技的發(fā)展,我們可以進(jìn)一步改進(jìn)循環(huán)通路各元件,進(jìn)一步改良設(shè)計(jì)各插管途徑甚至開胸路徑,根據(jù)自己科研的需要設(shè)計(jì)出簡(jiǎn)單合理實(shí)用的理想的大鼠 CPB模型。

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