Notch信號通路在肝癌發(fā)生和發(fā)展中的研究進展

王偉敏 綜述 徐 泱 樊 嘉, 審校

(1.復(fù)旦大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院,上海 200032;2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院肝癌研究所,上海 200032)

Notch基因發(fā)現(xiàn)于1919年,它的缺失可導(dǎo)致果蠅翅緣缺刻[1]。隨后研究發(fā)現(xiàn),Notch在無脊椎動物和脊椎動物的多個物種中均有表達,它不僅在許多器官及細胞的正常發(fā)育中起作用,還與一些腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。自Notch在人類T淋巴母細胞白血病中首先被鑒定以來[2],在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)有Notch信號通路的異常激活。現(xiàn)就Notch信號通路在肝癌中的研究進展做一綜述。

1 Notch信號通路

Notch信號通路(notch signaling,以下簡稱NS)是由 Notch受體、配體、細胞內(nèi)效應(yīng)分子、調(diào)節(jié)分子及其他的效應(yīng)物等組成。N-S主要通過旁側(cè)抑制介導(dǎo)對多種不成熟細胞分化的抑制信號[3]。

1.1 參與N-S的主要分子 (1)Notch受體:Notch蛋白是由其基因編碼的單鏈跨膜受體蛋白,分子量約300 kD,由2 753個氨酸殘基組成,其基本結(jié)構(gòu)分為胞外區(qū)(ECN)、跨膜區(qū)(TM)和胞內(nèi)區(qū)(ICN)。脊椎動物中共發(fā)現(xiàn)了4個Notch同源體,分別編碼4種Notch受體(Notch1-4)。(2)配體:可結(jié)合并激活Notch受體;人的Notch同源配體有兩類:Delta樣配體(Dll1、Dll3、Dll4)和 Serrate樣配體(Jag1、Jag2)。(3)細胞內(nèi)效應(yīng)分子:一方面與ICN的RAM結(jié)構(gòu)域結(jié)合,形成ICN-CSL復(fù)合物;另一方面可與核內(nèi)特定的DNA序列結(jié)合,激活轉(zhuǎn)錄過程。

1.2 Notch的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和激活方式及調(diào)節(jié) 目前廣泛認可的是Notch3步裂解法[4]:Notch在furin樣轉(zhuǎn)化酶的作用下于S1位點發(fā)生裂解,產(chǎn)生的胞外區(qū)和跨膜區(qū)以二硫鍵相接而形成 Notch受體。當(dāng)其與配體結(jié)合后,在腫瘤壞死因子-α-轉(zhuǎn)化酶作用下,Notch在S2位點裂解為2個片段。C端裂解產(chǎn)物進一步在跨膜區(qū)S3位點發(fā)生裂變,經(jīng)γ-分泌酶水解釋放的ICN進入核內(nèi),其RAM區(qū)與CSL蛋白和MAML蛋白結(jié)合形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物,再募集轉(zhuǎn)錄輔助激活因子PCAF及P300等,激活下游靶基因轉(zhuǎn)錄。

Notch受體與配體結(jié)合后,可直接轉(zhuǎn)至核內(nèi)(放大效率低、特異性強);但多種配體共同存在,激活N-S可引發(fā)多種信號、多種調(diào)節(jié)因素通過不同機制調(diào)節(jié)Notch信號。

2 N-S和肝臟發(fā)育與再生

多種研究[5-7]顯示:N-S在肝內(nèi)膽管形成、血管發(fā)育中起重要作用。表達在胚胎膽管板上的Jag1與肝門束旁的間充質(zhì)和肝動脈內(nèi)皮上的Notch3間的相互作用,對人胎肝膽管板重塑和肝內(nèi)膽系發(fā)育起作用[5]。在Alagille綜合征患者,Jag1基因突變使肝內(nèi)膽管發(fā)育缺陷;用AlbCre轉(zhuǎn)基因小鼠進一步研究[6]發(fā)現(xiàn)Notch2缺失引起肝膽管板結(jié)構(gòu)異常、肝內(nèi)膽管結(jié)構(gòu)混亂且伴有肝門區(qū)炎性纖維化和肝細胞羽毛狀變性;其缺失程度與與肝內(nèi)膽管異常情況呈正相關(guān)。同時,研究Jag1/Notch2雙雜合子Alagille綜合征模型和肝特異性Notch2缺失模型,也發(fā)現(xiàn)Notch功能缺失突變小鼠的膽管形態(tài)形成缺陷[7]。

Fabris等[8]研究N-S在肝臟修復(fù)中的作用,發(fā)現(xiàn)其缺乏導(dǎo)致活性膽管細胞缺失和缺少肝臟核因子的肝膽管細胞堆積,最終不能轉(zhuǎn)化為膽道表型而影響肝膽管再形成。Croquelois等[9]用Notch1基因敲除小鼠模型來研究N-S在肝細胞增殖分化中的作用,發(fā)現(xiàn)Notch1缺失導(dǎo)致肝細胞持續(xù)增殖,而發(fā)展為結(jié)節(jié)性再生性增生;Notch信號通路抑制肝細胞再生和增殖。

值得注意的是,肝竇內(nèi)皮細胞(LSECs)對剩余肝的肝細胞有支持作用,從肝再生到再生肝實質(zhì)血管形成,都必須有LSECs的增殖。而Notch/RBP-J信號通路對LSECs起雙重作用:抑制剩余肝增殖;促進再生肝增殖和功能分化[10]。N-S對肝細胞的確切作用及其機制尚未明確,尚需深入研究。

3 N-S和慢性肝炎、肝硬化、肝癌

Notch和 TGF-β協(xié)同調(diào)節(jié)Foxp3表達和維持Treg細胞,γ-分泌酶抑制劑(GSI)可抑制由Notch1、CSL和Smad結(jié)合體維持的Foxp3啟動子的結(jié)合位點;活體內(nèi)給予GSI使Foxp3表達減少并產(chǎn)生自身免疫性肝炎癥狀[11]。在肝硬化中,發(fā)現(xiàn)Notch和 Toll樣受體信號通路的表達失調(diào)[12]。Gramantieri等[13]以癌旁組織為對照,分析Notch及靶基因在肝細胞肝癌(HCC)中表達情況:HCC組織中有Notch3和Notch4的異常增多;Notch3、Notch4在正常肝和癌旁慢性肝炎區(qū)不表達,Notch3在肝硬化組織為陰性,HES6 mRNA和 Notch3 mRNA在肝硬化中表達量比 HCC組織中少;Hep G2細胞系高表達Notch3,低表達Notch4及其mRNA。與HCV-4感染相關(guān)的埃及 HCC患者的c-DNA芯片顯示[14]:伴有與不伴有肝硬化的HCC有22個基因差異性表達,Notch4與HCC中高表達的基因相關(guān)。Gao等[15]把肝細胞癌組織的贅生性細胞與癌旁組織相比,前者胞質(zhì)中Notch1和胞核中Notch4高表達,Notch2低表達,胞核中Notch1、胞質(zhì)中Notch4及Notch3表達未見異同。由此可見,Notch受體在HCC組織中表達較混亂。

多項研究[13,16-17]表明,N-S抑制肝癌細胞增殖并促進其凋亡。在瞬時轉(zhuǎn)染 Notch的 SMMCICD7721細胞中發(fā)現(xiàn),p21、p53高表達,JNK信號活性增強,周期蛋白、CDK2、磷酸化Rb表達降低,Bcl-2不表達,提示N-S作用于細胞內(nèi)多條信號通路起到上述作用[13]。同樣,Qi等[16]用攜帶Notch ICN基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染SMMC7721,表達Notch1 ICN的肝癌細胞停滯于G0/G1期,并誘導(dǎo)肝癌周期蛋白減少,而p21高表達,說明Notch1能誘導(dǎo)SMMC7721細胞凋亡。Western blot還顯示p53表達增高,Bcl-2、P-JNK非磷酸化的JNK表達減少,N-S誘導(dǎo)凋亡可能與蛋白磷酸激酶途徑相關(guān)[16]。把肝癌組織塊接種到Notch受體轉(zhuǎn)錄因子RBP-J失活的小鼠體內(nèi),腫塊生長減慢,新生血管形成增加、灌流量減少,但轉(zhuǎn)移性增加[17]。同時有研究[12,18-22]顯示,N-S促進肝癌的發(fā)生和進展。利用實時定量 RT-PCR和 Western blot分析發(fā)現(xiàn),Notch-1和HES-1在肝癌組織中高表達;Notch高表達,HuH-7的增殖、侵襲能力增強[18];Jag1在肝癌中表達明顯升高,與HBx相互作用可能是肝癌發(fā)生的原因之一[19]。Dll1在肝癌組織中表達量高,并且Dll1表達升高量與肝癌的增殖能力正相關(guān)[20]。N-S還促進HepG2細胞系增殖,通過GSI抑制N-S后,腫瘤細胞的增殖也受到抑制[21]。Wurmbach等[12]發(fā)現(xiàn)晚期肝癌階段與DNA復(fù)制、修復(fù)和細胞周期相關(guān)的基因表達上調(diào),而N-S在調(diào)節(jié)細胞周期進展中有重要作用[22],至于N-S是否參與了肝癌進展尚需確證。

4 N-S和干細胞

就N-S一般作用而言,Wilson等[23]稱其為干細胞的“門衛(wèi)”。它影響著細胞的命運,誘導(dǎo)無脊椎動物的終末分化進程和哺乳動物器官系統(tǒng)的自我更新。但“肝癌干細胞”的確切起源、分子遺傳學(xué)和HCC高侵襲機制等,還處于早期探索階段。Notch與 TGF-β、Wnt、Shh等信號通路間的相互作用參與調(diào)節(jié)干細胞分化和腫瘤發(fā)生[24]?，F(xiàn)就N-S與干細胞及腫瘤干細胞的關(guān)系進行簡要描述。

4.1 N-S和干細胞 N-S在干細胞更新和分化中起重要作用,它促進干細胞自我更新和祖細胞增殖[25]。HES1是N-S的靶基因,整合基因組分析顯示[26]:HES1主要表達在未分化的胚胎干細胞、胚胎組織、再生肝、內(nèi)皮細胞和腫瘤組織中。Notch3基因在富含干/祖細胞的人乳腺球型培養(yǎng)中高度表達[27]。在未分化組織中,Notch及靶基因高表達提示其與干/祖細胞未分化狀態(tài)高度相關(guān)。

觀察小鼠胚胎定向造血干細胞集落形成,發(fā)現(xiàn)基質(zhì)細胞激活Jag1而維持造血干細胞的未分化和自我更新[28]。N-S還可與其他信號通路交叉作用維持干細胞的狀態(tài)。N-S和Wnt信號通路協(xié)同維持細胞的未分化/增殖狀態(tài),Wnt信號通路調(diào)節(jié)干/祖細胞的擴增,而N-S可影響Wnt信號通路對干細胞間隔和分化的維持作用[29]。在某些條件下,N-S與Wnt信號通路共同維持干細胞的增殖是某特定細胞系分化的基礎(chǔ)[30]。N-S參與Hippo信號通路調(diào)節(jié)哺乳動物器官體積并作用于干細胞成分;Hippo信號通路的下游成分YAP1在干細胞中高表達,激活YAP1的小鼠肝臟體積增大;YAP1可激活NS,而后者對前者有調(diào)節(jié)作用,兩者與干細胞/祖細胞、器官體積和腫瘤間有潛在聯(lián)系[31]。

4.2 N-S和腫瘤干細胞 Styczynski等[32]提出腫瘤干細胞(CSCs)的假說,稱其是一群轉(zhuǎn)化形式的干細胞或獲得自我更新成分的祖細胞。CSCs是腫瘤細胞自我更新的來源,決定了腫瘤的生物學(xué)行為(如增殖、擴散和對放化療的反應(yīng)性等)。CSCs一般都有特異性表面標志(如抗原、分子和信號通路等),信號通路調(diào)節(jié)CSCs自我更新和細胞命運的功能正逐步被闡明。

人促紅細胞生成素受體的重組體誘導(dǎo)Jag1以Notch依賴模式增加干細胞的量和自我更新,而抑制N-S可阻斷這一效應(yīng),這表明其可能維持腫瘤干細胞樣細胞表型[33]。Dontu等[34]通過激活或抑制N-S,研究其在人乳腺干/祖細胞細胞命運中的決定作用,它促進乳腺干細胞自我更新及早期祖細胞增殖但不影響完全分化的乳腺上皮細胞,乳腺癌的發(fā)生可能與異常的N-S對正常的乳腺干細胞調(diào)節(jié)異常有關(guān)。磷酸酯酶和張力蛋白同系物(PTEN)參與干細胞的維持,一旦缺失將導(dǎo)致CSCs發(fā)育而最終致瘤,激活N-S引起PTEN下調(diào)[35],表明 N-S調(diào)節(jié)PTEN對干細胞作用。

N-S和Hedgehog-Gli1信號通路與CSCs的自我更新和致瘤性有關(guān),且可能在放療后CSC再生中起重要作用[36]。與腫塊的分化細胞相比,腫瘤干細胞可能對細胞毒性藥物和放療引起的凋亡的抵抗性更強,其中N-S等信號級聯(lián)反應(yīng)的激活與DNA修復(fù)機制的增加和ABC運載體介導(dǎo)的藥物輸出可能在其對傳統(tǒng)治療方法抵抗中起作用[37]。

5 N-S和微環(huán)境

據(jù)報道[38-40],N-S調(diào)節(jié)腫瘤血管形成,但其確切作用尚有爭議。N-S抑制腫瘤新生血管過度增殖,促進發(fā)育成熟而改善其功能[39];抑制Dll4介導(dǎo)通路使不成熟血管繁殖而組織灌流量減少,腫瘤生長受到抑制[38-39]。Dll4轉(zhuǎn)導(dǎo)的荷瘤小鼠與對照組相比,其形成的血管少而小且缺氧更明顯,血管影像顯示腫瘤供血減少,Dll4的激活減少了腫瘤新生血管形成及血管灌流量而抑制腫瘤的生長[40]。Dou等[41]利用 Cre-Lox P介導(dǎo)狀態(tài)的基因缺失小鼠來研究Notch轉(zhuǎn)錄因子下游區(qū)的RBP-J在維持血管穩(wěn)態(tài)中的作用,結(jié)果顯示RBP-J介導(dǎo)的N-S通過抑制內(nèi)皮細胞增殖而維持血管內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。

Katoh等[42]提出 Wnt-FGF-Notch和 BMPShh信號通路網(wǎng)間的平衡對維持干/祖細胞間的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)非常重要,一旦被打破將引起先天性疾病或腫瘤。Notch與部分細胞或因子相互作用,調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長與侵襲性。在腫瘤微環(huán)境中,肝細胞生長因子(HGF)參與產(chǎn)生脈管系統(tǒng)和間質(zhì)及侵襲性生長過程,N-S可限制HGF的活性,負調(diào)腫瘤侵襲性生長[43]。組織特異性成纖維細胞及其產(chǎn)生IL-6,通過上調(diào)Notch3、Jag1促進乳腺癌細胞的生長和侵襲[44]。

在多種干細胞/祖細胞系中,在N-S的參與下,缺氧可維持未分化細胞的狀態(tài);激活Notch應(yīng)答啟動子和增加Notch下游基因的表達,阻斷Notch依賴的神經(jīng)元和肌原的分化狀態(tài);ICN和HIF-1α間的相互作用和HIF-1α參與N-S的激活都需要低氧環(huán)境[45]。這一現(xiàn)象也為闡明N-S控制細胞分化和維持干細胞狀態(tài)的機制提供了新視角。

6 結(jié)語與展望

綜上所述,N-S與肝癌關(guān)系相當(dāng)密切,但其在肝癌發(fā)生、發(fā)展過程中卻有不同甚至相反的作用?？赡茉蛴?成員多類型性及其作用多樣性;信號轉(zhuǎn)導(dǎo)多途徑性;與多條信號途徑間出現(xiàn)“串話”等。只有明確N-S作用,才可以在肝癌的治療中有針對性地選擇而避免治療的盲目性。GSI通過抑制N-S而抑制肝癌細胞系的增殖[22]。可以預(yù)言,以N-S為靶點的腫瘤基因治療及新藥開發(fā),將為肝癌治療研究開辟新領(lǐng)域。如:就N-S本身而言,可用外源性配體激活或者用拮抗劑抑制N-S;針對Dll,進行腫瘤的抗血管治療;針對CSCs的特性,進行肝癌干細胞的治療;改變腫瘤干細胞所處的微環(huán)境而影響其生物學(xué)行為。但前提是必須有方法特異確定“肝癌干細胞”,從細胞表面標志到干細胞標志以及相關(guān)信號通路對其進行鑒定的研究尚需探索。

目前,N-S與肝癌的關(guān)系尚待闡明的問題還有很多,如N-S在肝癌發(fā)生、發(fā)展的不同環(huán)節(jié)所起的作用及相關(guān)機制;生理狀態(tài)下與肝癌中的N-S是否相同;改變Notch表達是否會對正常細胞有不良影響;肝癌干細胞的確定及其與N-S的聯(lián)系;以及如何開展N-S的靶向治療及其臨床意義等。

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