HPLC-ELSD測(cè)定彭澤貝母中的貝母辛

劉紅寧， 陳麗華*， 黃興發(fā)， 饒 毅

(1.現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室江西中醫(yī)學(xué)院，江西南昌330004;2.中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心，江西南昌330006)

江西彭澤貝母(Fritillaria monantha Migo.)主產(chǎn)于江西省九江地區(qū)長(zhǎng)江流域的各縣，作為川貝母使用已有多年歷史［1，2］。現(xiàn)代藥理研究表明［3－5］，貝母生物堿具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘等功效。貝母辛為主要生物堿成分之一。文獻(xiàn)利用反相離子對(duì)色譜法及HPLC－ELSD法測(cè)定了貝母中貝母辛含量［6，7］。課題組在研究彭澤貝母化學(xué)成分和藥理作用的基礎(chǔ)上［8］，首次采用HPLC－ELSD法建立了彭澤貝母中貝母辛的含量測(cè)定方法，為彭澤貝母的藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)全面評(píng)價(jià)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀;ELSD檢測(cè)器(Alltech 2000);色譜柱:Hypersil ODS(4.6 mm ×200 mm，5 μm，依利特);貝母辛對(duì)照品由實(shí)驗(yàn)室自制，結(jié)構(gòu)經(jīng)光譜鑒定，經(jīng)高效液相色譜歸一化法分析純度大于98%;乙腈(色譜純);甲醇、二乙胺、氯仿、氨水均為分析純;超純水(Milipore);彭澤貝母(采于江西省彭澤縣天紅鄉(xiāng)武山村，四年生，經(jīng)江西中醫(yī)學(xué)院范崔生教授鑒定為百合科貝母屬植物天目貝母Fritillaria monantha Migo)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Hypersil ODS色譜柱(4.6 mm×200 mm，5 μm)，柱溫為室溫;流動(dòng)相:乙腈－0.03%二乙胺水(36 ∶64)，流速為1 mL/min;進(jìn)樣量:20 μL;檢測(cè)器(ELSD)參數(shù):漂移管溫度98.8℃，載氣流速2.7 L/min。理論塔板數(shù)按貝母辛計(jì)算不低于3 000。結(jié)果見圖1。

圖1 貝母辛HPLC-ELSD圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取貝母辛對(duì)照品適量置5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.56 mg/mL貝母辛對(duì)照品貯備液。

2.3 供試品溶液的制備 取本品粉末2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加氨水4 mL浸潤(rùn)1 h，加混合溶劑氯仿－甲醇(4∶1)40 mL，稱重，混勻，置80℃水浴加熱回流2 h，放冷，稱重，加混合溶劑補(bǔ)足重量，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，置蒸發(fā)皿中蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至2 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取2.2項(xiàng)下貝母辛貯備液依次精密稀釋 0、1/8、1/4、3/8、1/2、3/4 倍，得含量為 0.56、0.42、0.28、0.21、0.14、0.07 mg/mL 的對(duì)照品溶液，每一含量進(jìn)樣20 μL，按選定的色譜條件進(jìn)行分析，重復(fù)3次，記錄各峰峰面積。以對(duì)照品含量的自然對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以峰面積的自然對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明，貝母辛含量在1.4～11.2 μg與峰面積值呈對(duì)數(shù)線性關(guān)系，回歸方程為:Y=1.423 2X+3.341 8，r=0.999 5。

2.5 精密度試驗(yàn) 取同一供試液連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果RSD為1.96%，表明該方法精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 同批樣品，照2.3項(xiàng)下方法制備供試品5份，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果RSD=2.77%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試液于0、3、5、8、12 h測(cè)定貝母辛含量，RSD為1.76%，結(jié)果表明貝母辛在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 準(zhǔn)確度試驗(yàn) 取已知含量的彭澤貝母樣品6份，各1.0 g，精密稱定，分成3組分別加入相當(dāng)0.8、1.0、1.2倍量貝母辛的對(duì)照品溶液，依2.3項(xiàng)下的操作方法，制備供試液并測(cè)定，計(jì)算回收率，得貝母辛的平均回收率為101.07%，RSD為2.86%。

2.9 樣品含量測(cè)定 取彭澤貝母樣品3份各2 g，精密稱定，按2.3項(xiàng)下的操作方法制備供試液，以2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算貝母辛含量為0.048 7%(n=3)，結(jié)果見表1。

表1 彭澤貝母中貝母辛的測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 生物堿類化合物比較溶于氯仿等極性較弱溶劑，采用了氯仿作為提取溶劑，可以減少水溶性雜質(zhì)的提出;但氯仿的穿透能力較弱，不利于指標(biāo)成分的溶出，建議在氯仿中加入醇類作為穿透劑。本實(shí)驗(yàn)比較了不同提取溶劑系統(tǒng)、不同提取方法和提取時(shí)間等因素對(duì)貝母辛提取效果的影響，結(jié)果表明:氯仿－甲醇(4 ∶1)＞甲醇＞乙醚＞氯仿;回流法＞超聲法;2 h＞3 h＞4 h＞1 h。提取方法為:精密稱取2 g藥材，加入氨水4 mL，堿化1 h，加入混合溶劑氯仿－甲醇(4 ∶1)40 mL，80℃水浴回流提取1次，提取時(shí)間2 h。

3.2 貝母辛屬異甾類生物堿，末端吸收，受流動(dòng)相干擾，難于檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［7］，通過比較研究，調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH值抑制樣品組分的解離，調(diào)整分離度，確定了彭澤貝母中貝母辛的最佳流動(dòng)相為乙腈－0.03%二乙胺水(36∶64)。

3.3 實(shí)驗(yàn)對(duì)不同藥店銷售的川貝母和浙貝母中貝母辛的含量進(jìn)行了測(cè)定，與彭澤貝母中貝母辛的含量做比較，結(jié)果市售川貝母和浙貝母中貝母辛的含量差異較大，但都明顯低于彭澤貝母中貝母辛的含量。

［1］江西省中醫(yī)藥研究所編.江西中藥(上集)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1959:83.

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