知母中α-葡萄糖苷酶抑制劑的提取分離及鑒定

藍(lán) 萍， 葉小利， 李學(xué)剛， 王 亮， 黃文文， 柳 明

(1.深圳市南山區(qū)赤灣學(xué)校，廣東深圳518068;2.西南大學(xué)藥學(xué)院藥用資源研究所，重慶400716;3.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶400715;4.國(guó)家海洋局第三海洋研究所，廈門361005)

知母為百合科植物知母(Anemarrhena asphodeloides Bge.)的干燥根莖，是我國(guó)傳統(tǒng)的常用中藥，有清熱瀉火，生津潤(rùn)燥等功效［1］。知母具有悠久的降血糖應(yīng)用歷史，早在《神農(nóng)本草經(jīng)》就已有知母用于治療消渴癥的記載，市場(chǎng)上許多降糖中成藥如降糖舒膠囊、降糖膠囊、人知降糖膠囊等其主要降糖成分均為知母，現(xiàn)代也有研究表明知母多糖［2－3］、知母多酚［4］、知母皂苷［5］等都具有降血糖的作用。本研究以α－葡萄糖苷酶為作用靶標(biāo)，以降糖舒膠囊及其主要成分知母為研究對(duì)象，對(duì)兩者的降糖效果進(jìn)行了比較，并且對(duì)知母中抑制α－葡萄糖苷酶活性單體進(jìn)行了提取、分離、純化以及結(jié)構(gòu)鑒定，并研究了各組分對(duì)糖尿病小鼠的降血糖作用。

1 材料

1.1 藥材

試驗(yàn)材料知母購(gòu)自重慶眾景中藥飲片有限責(zé)任公司，由西南大學(xué)藥學(xué)院李學(xué)剛研究員研究鑒定。

1.2 試劑

4－硝基酚－α－D－吡喃葡萄糖苷(pNPG)，sigma 公司;谷胱甘肽sigma公司;四氧嘧啶標(biāo)準(zhǔn)品5 g包裝，sigma公司;阿卡波糖片(拜糖平)GMP產(chǎn)品，拜耳醫(yī)藥保健有限公司北京分公司;降糖舒膠囊(批號(hào):080504)，吉林省輝南天泰藥業(yè)股份有限公司;5秒血糖儀及血糖試紙，北京怡成生物電子技術(shù)有限公司;芒果苷對(duì)照品購(gòu)于sigma公司，蒸餾水為雙蒸水，其他試劑均為分析純。

1.3 儀器

RE－52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);LC－6AD液相色譜系統(tǒng)(日本島津公司)，D101大孔樹(shù)脂(天津南開(kāi)大學(xué)化工廠)。Hitachi U－1800型紫外分光光度計(jì)(日本Hitachi儀器公司);CS1013電熱鼓風(fēng)干燥箱(中國(guó)重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠);X－4顯微熔點(diǎn)測(cè)定儀(溫度未校正)(上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1.4 動(dòng)物

清潔級(jí)昆明種小鼠，體重18～22 g，由重慶第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物室提供。

2 方法

2.1 降糖舒膠囊及知母各組分對(duì)體外α－葡萄糖苷酶抑制活力的測(cè)定

在 Matsui［12］法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn):取 pH 6.8磷酸鹽緩沖液 2 010 μL，待測(cè)樣品溶液 250 μL，3 mmol/L的谷胱甘肽80 μL和實(shí)驗(yàn)室提取的α－葡萄糖苷酶各80 μL于4 mL的離心管中，在37℃恒溫水浴中反應(yīng)10 min后，將反應(yīng)液倒入比色皿中，加入 80 μL 硝基苯基－α－D－吡喃葡萄糖苷(pNPG)，于400 nm處測(cè)定在酶的作用下釋放出對(duì)硝基苯酚pNP的量，不加待測(cè)品溶液作為空白對(duì)照，每2 min讀一次吸光度值并記錄。每個(gè)樣品同時(shí)做3個(gè)平行，取平均值，然后做吸光度隨時(shí)間變化的關(guān)系曲線，可以發(fā)現(xiàn)吸光度與時(shí)間成正比例關(guān)系。取斜率K值，計(jì)算個(gè)組分抑制率。

2.2 降糖舒膠囊與知母測(cè)定樣品的制備

取10粒降糖舒膠囊，用1%吐溫80溶解，配置成0.001 g/mL的溶液待測(cè)。稱取干燥并粉碎好的知母粉末2.0 g，按照2.3.1項(xiàng)的方法制備得到知母浸膏0.65 g，1%吐溫80溶解，配置成濃度0.005 g/mL的溶液，用2.1項(xiàng)的方法測(cè)定并比較降糖舒膠囊與知母浸膏的降糖效果。

2.3 知母中α－葡萄糖苷酶抑制劑的提取分離及結(jié)構(gòu)鑒定

2.3.1 知母中α－葡萄糖苷酶抑制劑的提取及分離

稱取知母500 g于CS1013電熱鼓風(fēng)干燥箱58℃烘干，粉碎至全部通過(guò)100目篩孔，用2 500 mL(1∶5W/V)工業(yè)乙醇超聲波提取3次，每次提取時(shí)間為30 min，合并浸提液減壓濃縮，得到知母醇提物205 g。取知母醇提物50 g，用適量水充分溶解，水溶液經(jīng)400 mL D101大孔樹(shù)脂充分吸附，依次用水、30%甲醇、60%甲醇、純甲醇洗脫，每個(gè)溶液濃度各收集800 mL洗脫液，減壓濃縮，得到4個(gè)組分:水洗脫組分Ⅰ(24.08 g)，30%甲醇洗脫組分Ⅱ(3.73 g)，60%甲醇洗脫組分Ⅲ(9.86 g)，純甲醇洗脫組分Ⅳ(10.58 g)。見(jiàn)圖1。

圖1 提取分離過(guò)程流程圖

將以上4個(gè)組分用1%的吐溫80充分溶解，配制成不同濃度的溶液，其中組分Ⅰ與組分Ⅳ所配濃度為0.01 g/mL，組分Ⅱ與組分Ⅲ濃度為0.001 5 g/mL，然后按照2.1項(xiàng)的方法測(cè)定其活力。有關(guān)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3.2 知母中α－葡萄糖苷酶抑制劑單體的提取和結(jié)構(gòu)鑒定

對(duì)于抑制α－葡萄糖苷酶活性的組分(30%甲醇洗脫部位)，減壓濃縮除掉甲醇后，用適量水充分溶解(升溫、超聲)，然后在冰箱中放置，出現(xiàn)淡黃色結(jié)晶。過(guò)濾，分出結(jié)晶，再溶于甲醇中，冷卻結(jié)晶3次，得到淡黃色粉末0.52 g。薄層層析為一個(gè)斑點(diǎn)(給出2種展開(kāi)劑)，對(duì)該粉末進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，有關(guān)如下:

淡黃色粉末;mp 267～272℃;氯仿－乙酸乙酯－甲酸(6 ∶2∶2)Rf=0.32，甲苯－正丁醇－甲酸(3 ∶4 ∶5)Rf=0.35;UV(CH3OH)λmax(nm):258;HPLC 檢測(cè)與芒果苷對(duì)照品出峰位置一致;1H NMR(DMSO－d6;300 MHz)δ (ppm):13.76(s，1H，1－OH)，10.58(s，2H，3－OH，6－OH)，9.72(s，1H，7－OH)，7.38(s，1H，8－H)，6.86(s，1H，5－H)，6.36(s，1H，4－H)，4.86(s，2H，3′－OH，4′－OH)，4.60(d，J=9.50 Hz，1H，1′－H，)，4.56(s，1H，6′－OH)，4.48(t，J=9.18 Hz，1H，2′－H)，3.69(d，1H，2′－OH)，3.67(d，J=2.55 Hz，1H，6′H)，3.34(dd，J=5.22 Hz，1H，6″H)，3.18(m，J3′H/4′H=9.18，J4′H/5′H=9.17 Hz，3H，3′，4′，5－H)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6］報(bào)道一致，故鑒定為芒果苷。

2.4 芒果苷的測(cè)定方法［7］

色譜條件DiamonsilTMC18(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇－0.1%甲酸(30:70);檢測(cè)波長(zhǎng):256 nm;流速:1.0 mL/min;柱溫:室溫。精密稱取芒果苷對(duì)照品10 mg，加甲醇溶解，并稀釋至100 mL的量瓶中至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。以峰面積對(duì)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果線性方程:Y=39 164X－44 442，R2=0.999 7。試驗(yàn)結(jié)果表明:芒果苷在10～80 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.5 對(duì)糖尿病小鼠的降血糖作用

2.5.1 對(duì)四氧嘧啶所致糖尿病小鼠血糖的影響［7］

取健康小鼠100只小鼠，♀♂各半，平衡飼養(yǎng)3 d。采用尾部靜脈注射四氧嘧啶70 mg/kg，即每只小鼠注射0.15 mL新配置好的9 mg/mL四氧嘧啶溶液。3 d后，測(cè)定空腹血糖，取血糖值大于10.0的作為造模成功小鼠，總計(jì)80只。將80只小鼠隨機(jī)分成4組，每組20只，分別為高糖模型組組，阿卡波糖組，降糖舒膠囊組，知母浸膏組，芒果苷組，按表3中劑量給藥，1次/d，分別給藥后第3天、6天，第9天采用尾靜脈取血，血糖儀測(cè)定餐后空腹血糖值。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)α－葡萄糖苷酶的抑制作用

按照2.1項(xiàng)所描述的方法，測(cè)得吸光度隨時(shí)間的變化值，并繪制吸光度A對(duì)時(shí)間t的曲線，利用2.1項(xiàng)中的公式計(jì)算各組分對(duì)α－葡萄糖苷酶的抑制活力。見(jiàn)表1。

表1 各組分對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用

結(jié)果顯示，知母中各提取組分中30%甲醇洗脫組分對(duì)α－葡萄糖苷酶的抑制活性最強(qiáng)。而從30%甲醇洗脫組分中分離純化出的芒果苷對(duì)α－葡萄糖苷酶有更強(qiáng)的抑制活性，其抑制效果比降糖舒膠囊還好，由此可見(jiàn)知母為降糖舒膠囊主要有效成分，而芒果苷為知母中的α－葡萄糖苷酶抑制劑。

3.2 浸膏及各分離組分中芒果苷的含量 見(jiàn)表2。

表2 各分離組分中芒果苷的含量

3.3 知母浸膏及芒果苷的降血糖作用 見(jiàn)表3。

表3 知母生藥及芒果苷對(duì)糖尿病小鼠的降糖作用

從表3的統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，知母浸膏與芒果苷均具有較好的降血糖功效，知母浸膏組的降血糖效果略優(yōu)于芒果苷組，但是差異不顯著。

4 討論

傳統(tǒng)測(cè)定α－葡萄糖苷酶抑制效果的方法如Matsui［8］法和 Pieere［9］法等都是在加入酶、抑制劑，于37℃水浴孵育10 min后，加入pNPG啟動(dòng)反應(yīng)，然后在37℃水浴中反應(yīng)30 min，加入0.1 mol/L Na2CO31 mL終止反應(yīng)。于400 nm下測(cè)得在處測(cè)定在酶作用下從 pNP－G中釋放出的對(duì)硝基苯(pNP)的吸光度值。抑制率計(jì)算公式為:抑制率 =(A空白－A樣品組)/A空白。而本研究在酶、抑制劑 37 ℃水浴孵育10 min后，加入直接將反應(yīng)在比色皿中進(jìn)行，2 min測(cè)定一次吸光度A，以A隨時(shí)間t變化的斜率K值作為計(jì)算抑制率的依據(jù)。此種測(cè)定方法是以檢測(cè)時(shí)間內(nèi)的平均值作為計(jì)算的依據(jù)，比傳統(tǒng)的方法更準(zhǔn)確，同時(shí)也容易觀察各抑制劑的抑制效果隨時(shí)間變化的關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象知母是降糖舒膠囊的主要活性成分。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于知母不同成分降血糖的報(bào)道很多，但是對(duì)知母進(jìn)行系統(tǒng)提取分離，篩選降血糖活性成分的文獻(xiàn)報(bào)道并不多(僅有一篇)，而且該文獻(xiàn)報(bào)道的方法比較復(fù)雜，得用水提醇沉法得知母浸膏后，溶解調(diào)pH值，用不同溶劑萃取得到知母總酚過(guò)后過(guò)硅膠柱，然后用乙酸乙酯－MeOH進(jìn)行梯度洗脫(500 ∶0→0 ∶250)，共收集 100 個(gè)流份［3］。本實(shí)驗(yàn)所用提取方法操作簡(jiǎn)單，不耗時(shí)，經(jīng)濟(jì)，分離效果好，不管是實(shí)驗(yàn)室操作還是工業(yè)化生產(chǎn)可行性強(qiáng)。試驗(yàn)結(jié)果證明，知母和芒果苷作為一種α－葡萄糖苷酶抑制劑在治療糖尿病特別是Ⅱ糖尿病領(lǐng)域中具有較大的開(kāi)發(fā)利用前景。

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