非水毛細管電泳測定黃柏飲片中4種生物堿的含量

劉訓(xùn)紅， 宋建平， 李俊松， 蔡寶昌， 韓 樂， 傅興圣

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥炮制重點實驗室，江蘇南京210029;2.鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鹽城224006)

黃柏為傳統(tǒng)常用中藥，歷版藥典均有收載，《中國藥典》2005年版分列為黃柏(川黃柏)、關(guān)黃柏兩種，分別來源于蕓香科植物黃皮樹 Phellodendron chinense Schneid、黃檗 Phellodendron amurense Rupr.的干燥樹皮，具有清熱燥濕，瀉火除蒸，解毒療瘡功效［1］。主要含有小檗堿、藥根堿、巴馬汀、木蘭堿等多種生物堿成分［2］。其炮制品鹽黃柏可增強滋腎陰、瀉相火、退虛熱等作用，臨床上多用于治療陰虛發(fā)熱、骨蒸勞熱，遺精、盜汗、足膝酸軟等癥。目前對黃柏飲片質(zhì)量評價的分析方法以高效液相色譜法(HPLC)報道較多［1，3－4］，以測定其中小檗堿、藥根堿、巴馬汀的含量，作為藥材飲片質(zhì)量的控制指標。

毛細管電泳技術(shù)具有高效、高速、高靈敏度、高自動化以及樣品和試劑耗用量少等一系列優(yōu)點［5］。與高效液相色譜法相比，毛細管電泳清洗容易，不存在污染問題，對樣品預(yù)處理要求低，進樣體積小，化學(xué)試劑用量少、價廉。而且毛細管電泳方法本身需要分析帶有一定電荷的物質(zhì)，生物堿在結(jié)構(gòu)上以含有氮原子為特點，所以毛細管電泳廣泛應(yīng)用于生物堿類成分的分析［6－9］。

1 儀器與試藥

G1600－AX型高效毛細管電泳儀(美國Agilent公司)，配惠普化學(xué)工作站、二極管陣列檢測器(DAD)、自動進樣器;未涂漬標準熔融石英毛細管(64.5 cm ×75 μm，i d，有效長度56 cm，Agilent科技有限公司);Rotavapor R－3型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(瑞士BUCHI公司);ShimadzuAY220電子分析天平(SPM.);pHS－25數(shù)顯pH計(上海精密科學(xué)儀器有限公司);KQ－500 B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

小檗堿(berberine，批號:110713－200609)、巴馬汀(palmatine，批號:110732－200506)及藥根堿(jatrorrhizine，批號:733－9203)對照品購于中國藥品生物制品檢定所;木蘭堿(magnoflorine，批號:090219)對照品購于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司。硼砂、乙酸鈉、氫氧化鈉、乙酸銨、鹽酸、甲醇、無水乙醇等化學(xué)試劑為分析純，均購置南京藥業(yè)股份有限公司;配制緩沖溶液和供試品溶液所用的水均為重蒸餾水。

不同品種、產(chǎn)地、批次黃柏飲片樣品編號如下:S1－關(guān)黃柏(遼寧，080802，亳州中藥飲片廠提供)，S2－關(guān)黃柏(吉林，亳州市藥材總公司提供)，S3－關(guān)黃柏(遼寧，081001，亳州市藥材總公司提供)，S4－關(guān)黃柏(東北，090326，貴州裕仁標準藥材飲片開發(fā)公司提供)，S5－川黃柏(四川，081201，亳州市藥材總公司提供)，S6－鹽川黃柏(四川古藺，080804浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠提供)，S7－鹽川黃柏(湖南，080806，浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠提供)，S8－川黃柏(四川古藺，080805，浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠提供)，S9－川黃柏(四川，江蘇省中醫(yī)院提供)，S10－川黃柏(四川，南京市傳統(tǒng)中醫(yī)門診部提供)，S11－川黃柏(四川，南京中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂提供)，S12－川黃柏(四川，20081100，南京中醫(yī)藥大學(xué)百草堂提供)。炮制品S6、S7，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠按2005年版中國藥典加工制得，S6相對應(yīng)的生品為S8。以上樣品均經(jīng)品種鑒定。留樣憑證存放于南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定實驗室。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對照品溶液制備

分別精密稱定小檗堿對照品8.20 mg、巴馬汀對照品4.41 mg、藥根堿對照品3.28 mg、木蘭堿對照品1.30 mg，均置于同一個10 mL量瓶中，用鹽酸－甲醇溶液(體積比為1∶100)溶解并定容至刻度，制成小檗堿、巴馬汀、藥根堿、木蘭堿的質(zhì)量濃度分別為820、441、328、130 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液制備［11－12］

精密稱取1 g經(jīng)50℃干燥2 h后的樣品粉末(過60目篩)，加入80 mL 50%(體積分數(shù))乙醇超聲提取2 h，抽濾，濾液濃縮約2 mL，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用40 mL鹽酸－甲醇溶液(體積比為1∶100)超聲10 min使溶解，用鹽酸－甲醇溶液(體積比為1∶100)定容，用 0.45 μm濾膜過濾，濾液供NACE分析。

2.3 電泳條件

項目總預(yù)算約18.83億元（其中中央財政約占64.9%，地方預(yù)算約占35.1%），按照3年基本建成、5年基本完善的原則安排進度。

經(jīng)優(yōu)化選擇，確定下述電泳條件:運行緩沖液40 mmol/L乙酸鈉－40 mmol/L乙酸銨－無水甲醇(pH5.8);檢測波長:210 nm;分離電壓:25 kV;壓力進樣:5 kPa×6 s;毛細管溫度:20℃。毛細管使用前以0.1 mmol/L氫氧化鈉溶液、重蒸餾水和運行緩沖液依次通過壓力沖洗5、10、5 min，樣品分析間隔用緩沖液平衡5 min。上述試劑使用前均經(jīng)0.45 μm濾膜濾過，并超聲脫氣。

2.4 標準曲線、檢測限與定量限

精密吸取混合對照品溶液0.5、1.25、2.5、5 mL，用鹽酸－甲醇(1∶100)定容于10 mL量瓶中，制備對照品系列溶液，取對照品系列溶液及原母液，按上述電泳條件進樣測定，以對照品的濃度(Y)對相應(yīng)的峰面積(X)進行線性回歸，得回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線性范圍;以各化合物的信噪比等于3(S/N=3)時的相應(yīng)濃度確定最低檢測限(LOD);以各化合物的信噪比等于10(S/N=10)時的相應(yīng)濃度確定最低定量限(LOQ)。結(jié)果見表1。

表1 標準曲線、檢測限與定量限

2.5 系統(tǒng)適用性試驗

在選定的條件下，取2.2項下的供試品溶液，按n=5.54(tR/Wh/2)2分別計算色譜柱理論板數(shù)(n);按R=2(tR2－tR1)/(W1+W2)分別計算分離度(R)。結(jié)果表明，理論板數(shù)、分離度均達到相關(guān)要求。結(jié)果見圖1，表2。

圖1 黃柏樣品HPCE色譜圖

表2 系統(tǒng)適用性試驗

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 精密度試驗 取一定濃度的混合對照品溶液，重復(fù)進樣5次，各對照品平均遷移時間、峰面積的相對標準偏差(RSD)見表3。

2.6.2 穩(wěn)定性試驗 取供試品(S2)溶液，分別在1、4、8、16、24 h 進樣 5 次，4 種生物堿的平均遷移時間、峰面積的相對標準偏差(RSD)見表3。

表3 精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗結(jié)果(n=5)

2.6.3 重復(fù)性試驗 精密稱取供試品(S2)5份，每份1 g，分別按供試品溶液制備方法制備供試液，進樣測定，4種生物堿的平均遷移時間、峰面積的相對標準偏差(RSD)見表3。

2.6.4 加樣回收率試驗 取已知含量的樣品(S3)0.5 g，5份，精密稱定，分別加入一定量的小檗堿、巴馬汀、藥根堿及木蘭堿對照品，按供試品溶液制備方法制備加樣回收供試品液，并按樣品測定方法進行測定，計算回收率，結(jié)果見表4。

2.7 樣品測定

將供試品溶液注入高效毛細管電泳，進行測定。根據(jù)相應(yīng)線性關(guān)系計算樣品中小檗堿、巴馬汀、藥根堿、木蘭堿的含量。結(jié)果見表5。

3 討論

3.1 實驗對電泳條件進行了優(yōu)化［10］。以電泳色譜圖中小檗堿、巴馬汀、藥根堿及木蘭堿的分離度、峰形、遷移時間等為考察指標，對緩沖液體系、緩沖液濃度、緩沖液pH、分離電壓、運行溫度、檢測波長的優(yōu)化選擇，確定了上述電泳條件。

3.2 實驗結(jié)果表明，不同來源、不同產(chǎn)地(批次)黃柏中4種生物堿的含量具有一定差異。關(guān)黃柏中小檗堿含量較低，巴馬汀及木蘭堿含量較高;川黃柏中小檗堿含量較高，巴馬汀含量較低或未檢出。關(guān)黃柏中4種生物堿的含量均以遼寧產(chǎn)樣品為高;川黃柏以南京市傳統(tǒng)中醫(yī)門診部提供的樣品(S10)中小檗堿、藥根堿及木蘭堿含量為高，樣品(S9)中小檗堿含量較低;關(guān)、川黃柏少數(shù)批次樣品中小檗堿含量未達到2005版《中國藥典》規(guī)定的HPLC法測定限量指標(≥0.6%，≥3.0%)，至于測定方法的差異尚需進一步實驗比較研究。

黃柏炮制前后生物堿的含量也有一定變化，川黃柏生品(S8)與相應(yīng)鹽炙品(S6)比較，鹽川黃柏中4種生物堿的含量均有所下降，其4種生物堿的含量變化規(guī)律仍需進一步實驗探討。

表4 加樣回收率試驗結(jié)果(n=5)

表5 不同產(chǎn)地、種屬的黃柏及其炮制品中4種生物堿測定結(jié)果(mg/g，n=2)

3.3 本實驗建立了非水毛細管電泳檢測法同時測定黃柏飲片中小檗堿、巴馬汀、藥根堿及木蘭堿含量的方法。該方法簡單、準確，重復(fù)性好，可用于黃柏飲片內(nèi)在質(zhì)量的評價和控制。

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