HPLC測(cè)定辛夷鼻炎丸中升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的總含量

車曉彥， 鄧曉鴻， 余曉琴， 范靈婧

(1.四川省食品藥品檢驗(yàn)所，四川成都610036;2.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都611137)

辛夷鼻炎丸由辛夷、薄荷、紫蘇葉、甘草、廣藿香、蒼耳子、鵝不食草、板藍(lán)根、山白芷、防風(fēng)、魚腥草、菊花、三叉苦等十三味藥組成，具有祛風(fēng)清熱，消炎解毒的功效，臨床上用于鼻炎(包括過(guò)敏性鼻炎，慢性鼻炎等)，神經(jīng)性頭痛，感冒流涕，鼻塞不通等癥。該制劑標(biāo)準(zhǔn)收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十冊(cè)》，標(biāo)準(zhǔn)中只有顯微鑒別，鵝不食草和魚腥草薄層色譜鑒別，尚無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)［1］。因防風(fēng)具有解表祛風(fēng)、通竅鼻淵之功效，常用于治療感冒頭痛。本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC法測(cè)定辛夷鼻炎丸中防風(fēng)的有效成分升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量，可用于辛夷鼻炎丸的質(zhì)量控制［2］。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 美國(guó)Waters高效液相色譜系統(tǒng)(Waters2695泵，Waters2487檢測(cè)器，Empower工作站);KQ2200DB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);瑞士METTLER TOLEDO AE240電子分析天平。

1.2 試劑 升麻苷對(duì)照品(批號(hào):111522-200203，供含量測(cè)定用)、5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品(批號(hào):111523-200405，供含量測(cè)定用)均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。辛夷鼻炎丸(批號(hào):070801、070901、070902，成都九芝堂金鼎藥業(yè)有限公司提供)，甲醇為色譜純，乙醚為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Sunfire C18色譜柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動(dòng)相:以甲醇為流動(dòng)相 A，水為流動(dòng)相B，采用梯度洗脫:0～20 min，72%B;20～50 min，72% ～50%B;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;流速:0.9 mL/min;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取升麻素苷對(duì)照品12.60 mg，置25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為升麻素苷濃溶液;精密稱取5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品10.48 mg，置50 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為5-O-甲基維斯阿米醇苷濃溶液。分別精密吸取升麻素苷濃溶液4 mL和5-O-甲基維斯阿米醇苷濃溶液10 mL，置同一100 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得每1 mL含升麻素苷20.16 μg和5-O-甲基維斯阿米醇苷20.96 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取本品，研細(xì)，取約1 g，精密稱定，加乙醚40 mL，加熱回流30 min，濾過(guò)，濾液棄去，濾紙及濾渣揮干乙醚，精密加入甲醇20 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 分別取上述對(duì)照品濃溶液適量，用適量甲醇稀釋，在220～350 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，結(jié)果兩者分別在295 nm和289 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，首先選擇與兩者最大吸收接近的292 nm進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果供試品溶液在升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷色譜峰位置均干擾嚴(yán)重。后采用《中國(guó)藥典2005年版一部》防風(fēng)藥材的含量測(cè)定波長(zhǎng)254 nm，結(jié)果干擾較小，因此選擇254 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.4 專屬性試驗(yàn) 取缺防風(fēng)空白樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制得陰性樣品溶液。分別吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液，按2.1項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖。結(jié)果升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，且色譜峰對(duì)稱，陰性樣品對(duì)升麻素苷及5-O-甲基維斯阿米醇苷峰無(wú)干擾，方法具有專屬性。色譜圖見圖1。

圖1 混合對(duì)照品(A)、辛夷鼻炎丸(B)和陰性樣品(C)的HPLC圖譜

2.5 線性關(guān)系考察 精密量取上述兩種濃溶液適量，用甲醇稀釋，分別得濃度為 2.016、4.032、10.08、20.16、40.32、80.64 μg/mL 的升麻素苷系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和濃度為 2.096、4.192、10.48、20.96、41.92、83.84 μg/mL的5-O-甲基維斯阿米醇苷系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按2.1項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，以峰面積值(Y)對(duì)進(jìn)樣量(X，μg)進(jìn)行線性回歸，得升麻素苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=170 8X+5 517(r=0.999 9)，5-O-甲基維斯阿米醇苷標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=1 899X+2 988(r=0.999 9)。結(jié)果表明升麻素苷在0.020 16 ～0.806 4 μg范圍內(nèi)，5-O-甲基維斯阿米醇苷在0.020 96～0.838 4 μg范圍內(nèi)，峰面積與進(jìn)樣量呈良好的線性關(guān)系。

2.6 精密度試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液10 μL，按2.1項(xiàng)下的色譜條件，注入高效液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的峰面積，結(jié)果RSD分別為0.43%和1.64%，表明方法精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取混合對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μL，按2.1 項(xiàng)下的色譜條件，分別于0、4、8、16、24 h進(jìn)樣1次，測(cè)定峰面積值，根據(jù)峰面積變化情況考察對(duì)照品及供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性。結(jié)果混合對(duì)照品溶液及供試品溶液中的升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，混合對(duì)照品RSD分別為0.98%和1.93%，供試品RSD分別為1.25%和1.72%。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品粉末約1 g，共6份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算升麻素苷(C22H27O11)及5-O-甲基維斯阿米醇苷(C22H28O10)的總量，結(jié)果RSD為1.38%，表明方法重現(xiàn)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷含量的樣品約0.5 g，共6份，加乙醚40 mL，加熱回流30 min，濾過(guò)，濾液棄去，濾渣及濾紙揮干乙醚，分別精密加入已知升麻素苷與5-O-甲基維斯阿米醇苷濃度的混合對(duì)照品溶液(升麻素苷濃度為 18.62 μg/mL、5-O-甲基維斯阿米醇苷濃度為17.88 μg/mL)15 mL，再精密加入甲醇5 mL，按2.2.2項(xiàng)下操作制備供試品溶液，并按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的回收率，結(jié)果升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的平均加樣回收率分別為97.68%和98.05%，RSD分別為1.44%和1.36%，表明方法準(zhǔn)確度良好。見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)

2.10 樣品中升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量測(cè)定 取本品3批，按2.2.2項(xiàng)下方法制備3批樣品的供試品溶液，并按2.1項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)定峰面積，計(jì)算樣品中升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量，結(jié)果見表2。

表2 含量測(cè)定試驗(yàn)結(jié)果(n=3)

3 討論

組方較復(fù)雜的中成藥中防風(fēng)的含量測(cè)定報(bào)道較少，偶有報(bào)道，都是測(cè)定防風(fēng)中單一成分升麻素苷［3-4］。由于組方復(fù)雜的中成藥本身所具有的復(fù)雜體系，同時(shí)排除掉其他成分對(duì)升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷兩個(gè)峰的干擾存在困難。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)等度洗脫根本無(wú)法達(dá)到有效分離［5］，所以最終選擇了不同比例的梯度洗脫，既能排除干擾，又能縮短分析時(shí)間。在測(cè)定波長(zhǎng)的選擇上，發(fā)現(xiàn)與兩個(gè)測(cè)定成分最大吸收都很接近的292 nm處干擾嚴(yán)重，經(jīng)過(guò)比較選擇了響應(yīng)值尚可但干擾較小的254 nm作為測(cè)定波長(zhǎng)。樣品前處理增加了乙醚加熱回流以進(jìn)一步去除雜質(zhì)的步驟。加熱回流提取比超聲提取含量明顯較高，故選擇加熱回流提取。曾考察了Sunfire C18(250 mm × 4.6 mm，5 μm)和 Kromasil C18(200 mm ×4.6 mm，5 μm)兩種品牌、兩個(gè)規(guī)格的色譜柱，其分離效果均比較好。建立的含量測(cè)定方法專屬性強(qiáng)、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為較復(fù)雜的中成藥中防風(fēng)含量測(cè)定的參考。

［1］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn).中藥成方制劑第十冊(cè)［S］.1995:73.

［2］中國(guó)藥典［S］.一部.2005:102.

［3］李慶輝.HPLC法測(cè)定祛風(fēng)勝濕顆粒中升麻苷的含量［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2003，9(3):64.

［4］何巧君，高幼衡，魏志雄.高效液相色譜法測(cè)定鼻炎丸中升麻素苷含量［J］.中國(guó)新藥與臨床藥理，2009，20(3):256-258.

［5］邱文珍.HPLC法測(cè)定辛夷鼻炎丸中升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷［J］.中草藥，2003，34(5):422-424.