細(xì)胞因子調(diào)節(jié)垂體M tT/S細(xì)胞中人生長(zhǎng)激素基因啟動(dòng)子的活性

龔鳳英 鄧潔英 朱惠娟 潘 慧 張殿喜

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科衛(wèi)生部?jī)?nèi)分泌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100730）

細(xì)胞因子調(diào)節(jié)垂體M tT/S細(xì)胞中人生長(zhǎng)激素基因啟動(dòng)子的活性

龔鳳英 鄧潔英 朱惠娟 潘 慧 張殿喜

（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌科衛(wèi)生部?jī)?nèi)分泌重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100730）

目的:探討細(xì)胞因子白介素-11（IL-11）、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（CNTF）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β）對(duì)大鼠垂體MtT/S細(xì)胞中人生長(zhǎng)激素（hGH）基因啟動(dòng)子活性的影響及其與垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子Pit-1蛋白的關(guān)系。方法:采用熒光素酶報(bào)告基因的方法。首先建立含hGH基因啟動(dòng)子（-484～30 bp）和熒光素酶融合基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化MtT/S細(xì)胞系,然后用細(xì)胞因子刺激,檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞裂解液中GH的含量,反映它們對(duì)GH分泌和合成的影響;檢測(cè)MtT/S細(xì)胞內(nèi)熒光素酶的變化,說(shuō)明細(xì)胞因子對(duì)hGH基因啟動(dòng)子活性的作用。將Pit-1蛋白表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA-pit-1-cDNA）單獨(dú)轉(zhuǎn)染或與Pit-1反義寡核苷酸（Pit-1OND）共轉(zhuǎn)染于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的M tT/S細(xì)胞中,觀察加入細(xì)胞因子后熒光素酶的變化,探討細(xì)胞因子的作用與Pit-1蛋白的關(guān)系。結(jié)果:IL-11（20 nmol/L）、CNTF（10 nmol/L）能刺激大鼠垂體MtT/S細(xì)胞中GH的分泌和合成,增強(qiáng)MtT/S細(xì)胞中熒光素酶的表達(dá),分別增加到對(duì)照組的134%、122%。TGF-β（5nmol/L）能減少GH的分泌和合成,抑制熒光素酶的表達(dá)到對(duì)照組的72%。Pit-1蛋白過(guò)表達(dá)和表達(dá)被抑制對(duì)細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用沒(méi)有影響。結(jié)論:IL-11、CNTF和TGF-β通過(guò)調(diào)節(jié)大鼠垂體MtT/S細(xì)胞中hGH基因啟動(dòng)子活性影響GH的合成,Pit-1蛋白可能不參與這一調(diào)節(jié)作用。

細(xì)胞因子;生長(zhǎng)激素基因啟動(dòng)子;MtT/S細(xì)胞;Pit-1蛋白

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn),垂體前葉細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)激素（Grow th hormone,GH）作為一種應(yīng)激激素,在感染、炎癥等應(yīng)激過(guò)程中分泌增加,與下丘腦-垂體-腎上腺軸分泌的腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素、腎上腺皮質(zhì)激素等共同調(diào)節(jié)免疫功能,維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。越來(lái)越多的研究表明,免疫細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子如 IL-1、IL-2、IL-6、腫瘤壞死因子 α（TNF-α）、白細(xì)胞抑制因子（LIF）等均能調(diào)節(jié)垂體激素的分泌[1]。在原代培養(yǎng)的人和大鼠的正?；虼贵w瘤細(xì)胞以及M tT/S、A tT-20、TtT/GF 等垂體瘤細(xì)胞系中,IL-11、睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（CNTF）能刺激GH、催乳素（PRL）和促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）的分泌[2,3],轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β）能抑制GH、PRL的分泌[4]。我們最近的研究也發(fā)現(xiàn),干擾素γ、IL-1和IL-6不僅能調(diào)節(jié)大鼠垂體GH3細(xì)胞中生長(zhǎng)激素（GH）的分泌,還能調(diào)節(jié)GH的合成[5,6]。

Pit-1蛋白是垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子,是POU蛋白家族（Pit-1、Oct-1和Unc86）成員之一,生長(zhǎng)激素釋放激素（Growth hormone releasing hormone,GHRH）通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)cAMP-蛋白激酶A信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)垂體特異性核轉(zhuǎn)錄因子Pit-1蛋白的表達(dá),后者與GH基因啟動(dòng)子上-131～-106 bp、-93～-66 bp的兩個(gè)Pit-1位點(diǎn)結(jié)合,促進(jìn)生長(zhǎng)激素基因的轉(zhuǎn)錄[7]。

本實(shí)驗(yàn)采用熒光素酶報(bào)告基因的方法,研究IL-11、CNTF和TGF-β對(duì)大鼠垂體MtT/S細(xì)胞中hGH基因啟動(dòng)子活性的影響,并探討Pit-1蛋白在其中的作用,以期對(duì)GH基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制有進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒及質(zhì)粒構(gòu)建 pGL3-484-Luc2（簡(jiǎn)稱484-Luc2）是含有熒光素酶編碼基因和人生長(zhǎng)激素（hGH）基因啟動(dòng)子-484～+30 bp序列的表達(dá)質(zhì)粒,熒光素酶的表達(dá)受hGH基因啟動(dòng)子的控制,可通過(guò)測(cè)定熒光素酶的活性,反映某些因素對(duì)基因啟動(dòng)子活性的影響。pGL3-380-Luc2（380-Luc2）,pGL3-250-Luc2（250-Luc2）,pGL3-132-Luc2（132-Luc2）和pGL3-66-Luc2（66-Luc2）是分別含有hGH基因啟動(dòng)子從-380 bp,-250 bp,-132 bp,-66 bp至+30 bp序列的質(zhì)粒,pGL3-484-Luc1（484-Luc1）質(zhì)粒含hGH基因啟動(dòng)子-484～2 bp的序列。這些質(zhì)粒的構(gòu)建在我們以前的文獻(xiàn)中有詳細(xì)描述[5]。pcDNA3.1（+）為含新霉素抗性基因的質(zhì)粒,pSV-β-Gal為內(nèi)對(duì)照質(zhì)粒,pGL3-Basic-Luc為無(wú)啟動(dòng)子、無(wú)增強(qiáng)子、含熒光素酶報(bào)告基因的空白質(zhì)粒,均為Promega公司產(chǎn)品。

1.2 穩(wěn)定轉(zhuǎn)化MtT/S細(xì)胞系的建立 M tT/S細(xì)胞（美國(guó)ATCC公司）為大鼠垂體瘤細(xì)胞株,培養(yǎng)條件為完全DMEM（Dulbecco'smodified Eaglemedium,pH 7.3,美國(guó)Gibco BRL公司）培養(yǎng)液,3～4天換一次培養(yǎng)液。

采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法。將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的MtT/S細(xì)胞以8×105個(gè)/孔接種于6孔培養(yǎng)板中,待細(xì)胞完全貼壁并生長(zhǎng)至底面積的50%～60%時(shí),換為OPTI-MEM減血清培養(yǎng)液（Gibco BRL公司）,同時(shí)配制A、B兩液:A液為250μl OPTI-MEM 培養(yǎng)液和3μl陽(yáng)離子脂質(zhì)體DMRIE-C轉(zhuǎn)染試劑 （Gibco BRL公司）;B液為250μlOPTI-MEM培養(yǎng)液和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒[包括2.0μg熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒pGL3-480-Luc和0.4μg新霉素抗性基因表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1（+）,比例為5∶1],小心混合A 、B兩液,室溫放置30分鐘,加入上述M tT/S細(xì)胞中,37℃轉(zhuǎn)染5小時(shí),更換為完全DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。收集細(xì)胞,重新接種于60 mm培養(yǎng)皿中,并加入 300μg/L Geneticin G418（Gibco BRL公司）,以篩選含新霉素抗性基因的單克隆。約2～3周后,獲得數(shù)十個(gè)單克隆,重新接種,二次克隆篩選。最后獲得8個(gè)穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶并帶有新霉素抗性基因的M tT/S細(xì)胞克隆,稱為穩(wěn)定轉(zhuǎn)化MtT/S細(xì)胞。選擇其中的4個(gè)MtT/S細(xì)胞克隆用于本實(shí)驗(yàn),并始終用含 300μg/L G418的DMEM培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞因子刺激實(shí)驗(yàn) 將生長(zhǎng)良好的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化M tT/S細(xì)胞以3×105個(gè)/孔接種于24孔培養(yǎng)板中。24小時(shí)后,將細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,對(duì)照組不作任何處理,實(shí)驗(yàn)組分別加入一定濃度的IL-11、CNTF、TGF-β（美國(guó) Calbiochem 公司）,繼續(xù)培養(yǎng) 4小時(shí)后,收集培養(yǎng)液,用于GH測(cè)定。裂解細(xì)胞,檢測(cè)熒光素酶活性。

1.4 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn) 將生長(zhǎng)良好的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化MtT/S細(xì)胞以5×105個(gè)/孔接種于12孔培養(yǎng)板中,經(jīng)與前述相似的轉(zhuǎn)染前處理后,將細(xì)胞分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組,對(duì)照組轉(zhuǎn)染1.5μg pGL3-Basic-Luc空白質(zhì)粒,實(shí)驗(yàn)組單獨(dú)轉(zhuǎn)染1.0μg pcDNA3.1-Pit-1-cDNA或與0.5μgPit-1OND共轉(zhuǎn)染（用pGL3-Basic-Luc調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)染時(shí)質(zhì)粒DNA的總量,保證每孔所轉(zhuǎn)DAN總量相同）。轉(zhuǎn)染5小時(shí)后,更換成無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)34小時(shí),再次更換為無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液,并加入細(xì)胞因子,作用4小時(shí)后,裂解細(xì)胞,檢測(cè)熒光素酶活性。

1.5 熒光素酶活性的測(cè)定和大鼠GH（rGH）的測(cè)定

按照熒光素酶檢測(cè)試劑盒（Promega公司）的操作說(shuō)明,將細(xì)胞裂解,取20μl細(xì)胞裂解液至熒光測(cè)定管中,加入100μl熒光素酶反應(yīng)底物,立即在化學(xué)發(fā)光儀上,檢測(cè)發(fā)光值,檢測(cè)時(shí)間為20秒。

按照大鼠GH酶免疫測(cè)定（EIA）試劑盒（英國(guó)Amersham公司）的操作說(shuō)明,測(cè)定每一孔細(xì)胞培養(yǎng)液和裂解液的rGH濃度,每個(gè)標(biāo)本重復(fù)測(cè)定2次,批內(nèi)和批間差異分別為6.8%和10.2%。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞因子對(duì)MtT/S細(xì)胞GH分泌和合成的影響 本實(shí)驗(yàn)中,濃度為20 nmol/L IL-11和10 nmol/L CNTF刺激穩(wěn)定轉(zhuǎn)化M tT/S細(xì)胞后,細(xì)胞培養(yǎng)液中的GH含量明顯增加,分別為對(duì)照組的151%和148%（圖1,P＜0.001）,同時(shí)MtT/S細(xì)胞裂解液中的GH含量也有輕度增加,分別增加到對(duì)照組的112%和115%。將細(xì)胞培養(yǎng)液和細(xì)胞裂解液中的GH含量相加（表示GH的合成）,發(fā)現(xiàn)IL-11和CNTF均能增加GH合成到對(duì)照組的 146%和144%（圖1,P＜0.001）。與此相反,濃度為5 nmol/L的TGF-β卻使MtT/S細(xì)胞培養(yǎng)液中的GH的含量顯著減少,為對(duì)照組的65%（圖1,P＜0.001）,同樣細(xì)胞裂解液中的GH也輕度減少,減少到對(duì)照組的85%。將二者相加后,表明 TGF-β能把GH合成抑制到對(duì)照組的64%（圖1,P＜0.001）。

2.2 細(xì)胞因子對(duì)穩(wěn)定轉(zhuǎn)化M tT/S細(xì)胞中熒光素酶表達(dá)的影響 濃度為20 nmol/L的IL-11和10 nmol/L的CNTF可促進(jìn)MtT/S細(xì)胞中熒光素酶的表達(dá),分別為對(duì)照組的134%和122%（圖2,P＜0.001）;濃度為5 nmol/L的TGF-β卻抑制MtT/S細(xì)胞中熒光素酶的表達(dá),抑制到對(duì)照組的72%（圖2,P＜0.001）。

2.3 細(xì)胞因子影響hGH基因啟動(dòng)子活性與Pit-1蛋白的關(guān)系 本實(shí)驗(yàn)中,將人Pit-1蛋白表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Pit-1-cDNA轉(zhuǎn)染于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的MtT/S細(xì)胞后,觀察到Pit-1蛋白的過(guò)表達(dá),使M tT/S細(xì)胞中熒光素酶的表達(dá)增加24%和27%（圖3,柱2與柱1,P＜0.001;圖4,柱2與柱1,P＜0.01）,而加入Pit-1反義寡核苷酸Pit-1OND將Pit-1蛋白的表達(dá)抑制后,Pit-1的促進(jìn)作用則消失。進(jìn)一步地,我們將Pit-1蛋白表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染于穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的MtT/S細(xì)胞的同時(shí)加入IL-11或CNTF,細(xì)胞中熒光素酶的活性比單獨(dú)加細(xì)胞因子時(shí)進(jìn)一步增高,分別增加了37%和20%（圖3,柱5與柱4,P＜0.01）,分別是無(wú)Pit-1蛋白過(guò)表達(dá)對(duì)照組的161%和144%（圖3,柱5和柱1,P＜0.001）。當(dāng)加入Pit-1 OND將Pit-1蛋白的表達(dá)抑制后,IL-11和CNTF對(duì)hGH基因啟動(dòng)子活性的促進(jìn)作用依然存在（圖3,柱6與柱1,P＜0.001）。

圖1 細(xì)胞因子對(duì)M tT/S細(xì)胞中GH分泌和合成的影響Fig.1 The effect of cytokines on GH secretion and synthesisin stableM tT/S cells

圖2 細(xì)胞因子對(duì)M tT/S細(xì)胞中熒光素酶表達(dá)的影響Fig.2 The effect of cytokines on the hGH gene promoter activities in stableM tT/S cells

圖3 IL-11和CNTF促進(jìn)hGH基因啟動(dòng)子活性與Pit-1蛋白的關(guān)系Fig.3 The relationship between Pit-1 protein and the stimu latory effects of IL-11 and CNTF

圖4 TGF-β抑制 hGH基因啟動(dòng)子活性與 Pit-1蛋白的關(guān)系Fig.4 The relationship between Pit-1 protein and the inhibitory effect of TGF-β

在穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的MtT/S細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染Pit-1蛋白表達(dá)質(zhì)粒并加入TGF-β后,細(xì)胞中熒光素酶的活性是對(duì)照組的102%（圖4,柱5與柱1,P＞0.05）,當(dāng)加入Pit-1OND抑制Pit-1蛋白的表達(dá)后,TGF-β的抑制作用重新又出現(xiàn)（圖4,柱6與柱1,P＜0.01）。

3 討論

GH在應(yīng)激調(diào)節(jié)過(guò)程中分泌增加的調(diào)節(jié)機(jī)制一直是目前該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。本研究成功地建立了帶有新霉素抗性基因（用于細(xì)胞克隆篩選）和表達(dá)熒光素酶的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染M tT/S細(xì)胞株。在這一穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MtT/S細(xì)胞中,由于穩(wěn)定整合有hGH基因啟動(dòng)子序列和熒光素酶的融合基因,所以熒光素酶的表達(dá)受hGH基因啟動(dòng)子的控制。也就是說(shuō)任何因素對(duì)hGH基因啟動(dòng)子的影響可以通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光素酶的活性加以反應(yīng)。本研究采用體外培養(yǎng)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染MtT/S細(xì)胞的方法,在細(xì)胞和分子水平研究了免疫細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-11、CNTF和TGF-β對(duì)GH分泌、合成以及hGH基因啟動(dòng)子活性的影響。結(jié)果表明,IL-11和CNTF促進(jìn)GH的分泌和合成,而TGF-β抑制GH的分泌和合成。Perez Catro等[2,3]和Auernhammer等[8]在原代培養(yǎng)的人和大鼠垂體細(xì)胞以及垂體瘤細(xì)胞系中,觀察到IL-11和CNTF刺激GH、PRL和ACTH的分泌。用RT-PCR的方法還發(fā)現(xiàn),IL-11和CNTF能促進(jìn)ACTH mRNA和GH mRNA的表達(dá)。Tan等[9]采用同樣的方法也發(fā)現(xiàn),TGF-β不僅能抑制大鼠垂體細(xì)胞中PRL的基礎(chǔ)分泌,還能抑制甲狀腺激素釋放激素（TRH）刺激的PRL分泌,抑制PRLmRNA的表達(dá)。這些研究均表明,免疫細(xì)胞分泌的 IL-11、CNTF和TGF-β是多效性的細(xì)胞因子,除了通過(guò)經(jīng)典的免疫通路調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫和炎癥反應(yīng)外,還能調(diào)節(jié)垂體分泌的應(yīng)激激素GH等的分泌和合成,從另外一個(gè)途徑調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能。但這些細(xì)胞因子調(diào)節(jié)GH合成的機(jī)制如何,目前文獻(xiàn)上還沒(méi)有肯定的報(bào)道。本研究采用熒光素酶報(bào)告基因的方法,首次報(bào)道IL-11和CNTF通過(guò)促進(jìn)hGH基因啟動(dòng)子的活性促進(jìn)GH基因轉(zhuǎn)錄,從而促進(jìn)GH的合成;而TGF-β則通過(guò)抑制hGH基因啟動(dòng)子的活性抑制GH基因轉(zhuǎn)錄,抑制GH的合成。

Pit-1蛋白是垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子,在GHRH促進(jìn)GH基因表達(dá)的過(guò)程中,通過(guò)與GH基因啟動(dòng)子上的兩個(gè)Pit-1位點(diǎn)結(jié)合,增加GH基因的轉(zhuǎn)錄。本實(shí)驗(yàn)用Pit-1蛋白過(guò)表達(dá)和表達(dá)被抑制的方法研究也發(fā)現(xiàn),Pit-1蛋白對(duì)hGH基因的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄具有重要的調(diào)節(jié)作用。為了進(jìn)一步探討Pit-1蛋白是否參與細(xì)胞因子對(duì)hGH基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié),本實(shí)驗(yàn)將Pit-1蛋白表達(dá)質(zhì)粒單獨(dú)轉(zhuǎn)染或與Pit-1反義寡核苷酸共轉(zhuǎn)染于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染M tT/S細(xì)胞中,然后加入細(xì)胞因子,結(jié)果發(fā)現(xiàn)Pit-1蛋白可能不參與 IL-11和CNTF所誘導(dǎo)的、TGF-β所抑制的hGH基因轉(zhuǎn)錄。這與我們以前研究的細(xì)胞因子 IL-1α、IL-6、IFN-γ對(duì)GH3細(xì)胞中hGH基因表達(dá)影響的結(jié)果相似[5,6]。Delidow等[10]也報(bào)道,TGF-β抑制大鼠垂體細(xì)胞中PRL基因和GH基因的轉(zhuǎn)錄與垂體特異性的轉(zhuǎn)錄因子Pit-1蛋白無(wú)關(guān)。上述資料提示,細(xì)胞因子對(duì)大鼠垂體MtT/S細(xì)胞中GH基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制可能與GHRH調(diào)節(jié)GH基因表達(dá)的機(jī)制不同。

M tT/S細(xì)胞系是1990年由日本學(xué)者Inoue等[11]從大鼠垂體瘤組織建立的。研究發(fā)現(xiàn),MtT/S細(xì)胞具有正常GH分泌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu),包括發(fā)育良好的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體和豐富的GH免疫反應(yīng)陽(yáng)性的分泌顆粒[11]。該細(xì)胞能夠表達(dá)包括GH、糖皮質(zhì)激素,鹽皮質(zhì)激素和甲狀腺激素在內(nèi)的多種激素的受體。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),GHRH能夠劑量依賴性地促進(jìn)M tT/S細(xì)胞中生長(zhǎng)激素的分泌[12]。Iwasaki等[13]采用體外培養(yǎng)M tT/S細(xì)胞的方法發(fā)現(xiàn),甲狀腺激素和雌激素能夠直接刺激MtT/S細(xì)胞中GH基因啟動(dòng)子的活性,而鹽皮質(zhì)激素則抑制基礎(chǔ)GH的表達(dá)。我們前期的研究也發(fā)現(xiàn),IL-1β和IL-6不僅能促進(jìn)大鼠垂體MtT/S細(xì)胞中生長(zhǎng)激素（GH）的分泌,還能調(diào)節(jié)促進(jìn)GH的合成[14,15]。由于MtT/S細(xì)胞具有多種GH分泌細(xì)胞的特點(diǎn),而且能表達(dá)IL-6、LIF、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）等受體,并對(duì)多種激素和細(xì)胞因子具有良好的反應(yīng)性,所以,近年來(lái),MtT/S細(xì)胞像GH3細(xì)胞一樣被廣泛用來(lái)研究GH激素基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的分子和細(xì)胞機(jī)制。對(duì)比本實(shí)驗(yàn)和我們以前的研究結(jié)果,發(fā)現(xiàn)MtT/S細(xì)胞和GH3細(xì)胞對(duì)同一細(xì)胞因子具有一致的反應(yīng)性[5,6,14,15]。

熒光素酶報(bào)告基因方法用于基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究,具有簡(jiǎn)便易行、定量測(cè)定、重復(fù)性較好的特點(diǎn)。細(xì)胞內(nèi)熒光素酶的表達(dá)受其上游啟動(dòng)子活性的影響,可通過(guò)檢測(cè)熒光素酶的活性,反映某些因素對(duì)基因啟動(dòng)子活性的影響。有瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染兩種方法。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染熒光素酶報(bào)告基因的方法是用轉(zhuǎn)染試劑將熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒暫時(shí)導(dǎo)入到培養(yǎng)細(xì)胞核內(nèi),其獨(dú)立于細(xì)胞基因組染色體外,不隨DNA復(fù)制而復(fù)制,隨著細(xì)胞增生傳代,表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞逐漸減少,所以這一方法不能用于連續(xù)長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn),而且實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和準(zhǔn)確性也因必須重新轉(zhuǎn)染而受到限制。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染熒光素酶報(bào)告基因方法,利用DNA復(fù)制時(shí)同源重組的原理,將熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒穩(wěn)定整合于細(xì)胞基因組的細(xì)胞克隆篩選出來(lái),并建立成穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。該質(zhì)粒DNA隨細(xì)胞基因組DNA復(fù)制而復(fù)制,可以代代相傳并穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶,這樣就大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)操作,而且重復(fù)性和準(zhǔn)確性均較好。在本實(shí)驗(yàn)和以前的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中,我們也觀察到了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的局限性和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的優(yōu)越性。Hexdall等和Blanton等[16,17]在Hela細(xì)胞和豬肌細(xì)胞中對(duì)兩種轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行比較后,也得出了相似的結(jié)論。本研究成功地建立了帶有新霉素抗性基因（用于細(xì)胞克隆篩選）并表達(dá)熒光素酶的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化M tT/S細(xì)胞系,為今后GH激素基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制的研究提供了良好的實(shí)驗(yàn)工具。

綜上所述,本研究表明,細(xì)胞因子 IL-11、CNTF和TGF-β通過(guò)調(diào)節(jié)大鼠垂體M tT/S細(xì)胞中hGH基因啟動(dòng)子活性影響GH的合成,IL-11和CNTF起促進(jìn)作用,TGF-β則起抑制作用。垂體特異性轉(zhuǎn)錄因子Pit-1蛋白可能不參與這一調(diào)節(jié)過(guò)程。

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[收稿2009-11-02 修回2009-12-07]

（編輯 許四平）

Cytokines regulate the promoter activitiesof human grow th hormonegene in rat pituitary M tT/S cells

GONGFeng-Ying,DENGJie-Ying,ZHUHui-Juan,PANHui,ZHANGDian-Xi.DepartmentofEndocrinology,KeyLaboratoryofEndocrinologyofMinistryofHealth,PekingUnionMedicalCollegeHospital,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Beijing100730,China

Objective:To study the effectof interleukin-11（IL-11）,ciliary neurotropic factor（CNTF）and transform ing grow th factor-β（TGF-β）on the hGH gene promoter activity in ratpituitaryM tT/S cells and the interaction with pituitary-specific transcription factor Pit-1.Methods:Stab le transformedMtT/S cell linewhich containshGH gene promoter-484-30 bp and luciferase reportergene firstly established,then the concentration of GH in themedium and lysate ofMtT/S cells and luciferase activities in M tT/S cellsweremeasured after treatment these cellsw ith the above cytokines,the effects of cytokines on secretion and synthesis of GH,and the promoter activity of the hGH gene were observed.Results:The Results showed that IL-11（20 nmol/L）,CNTF（10 nmol/L）and TGF-β（5 nmol/L）regu lated secretion and synthesis of GH,and the luciferase expression in stable transformed MtT/S cells.IL-11 and CNTF had the stimulatory effect,whereas TGF-βhad the inhibitory effect.Neitheroverexpression of Pit-1 nor inhibiting Pit-1 exp ression affected the regulatory roleof these cytokines.Conclusion:IL-11,CNTF and TGF-βregulate theGH p roduction in pituitaryMtT/S cell line by regulating the hGH gene promoter activity.Pit-1 may notbe involved in these actions.

Cytokine;hGH gene promoter;MtT/S cells;Pit-1 protein

R335.+1

A

1000-484X（2010）02-0146-05

龔鳳英（1967年-）,女,副研究員,碩士生導(dǎo)師,主要從事神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的研究,E-mail:fygong5074@yahoo.com.cn;

及指導(dǎo)教師:鄧潔英（1939年-）,女,研究員,博士生導(dǎo)師,主要從事神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)的研究。

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