慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25+Treg與CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)研究

巫翠萍 覃 西 王華民 巫翠云 李文廣 林 丹 朱 洪 李 一

（海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,海口 570102）

慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25+Treg與CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的相關(guān)研究

巫翠萍 覃 西 王華民①②巫翠云③李文廣 林 丹 朱 洪 李 一①

（海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院,海口 570102）

目的:探討慢性乙型肝炎患者外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的含量和CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群分布,兩者之間相關(guān)性及與HBV的相關(guān)性。方法:采用流式細(xì)胞術(shù)檢測50例慢性乙型肝炎患者和20例健康對照者外周血中CD4+CD25high、CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞表達(dá)及CD3/CD4/CD8T淋巴細(xì)胞亞群,熒光定量PCR法檢測HBV DNA含量。結(jié)果:慢性乙型肝炎患者外周血中CD4+CD25highTreg明顯高于健康對照組（P＜0.01）,且隨HBV DNA載量增加,患者外周血中CD4+CD25highTreg細(xì)胞的水平逐漸升高。慢性乙型肝炎患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞也相應(yīng)增高,且與CD4+CD25highTreg細(xì)胞的變化成正相關(guān)（r=0.890,P＜0.001）。與健康對照組比較,患者組CD4+T細(xì)胞百分率及CD4+/CD8+比值均降低,而CD3+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞百分率差異無顯著性（P＞0.05）。CD4+CD25highTreg細(xì)胞與HBV DNA取對數(shù)后成正相關(guān)（r=0.782,P＜0.001）,與谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）成正相關(guān)（r=0.432,P＜0.005）;與 CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞水平及CD4+/CD8+比值均無相關(guān)性（P＞0.05）。CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞及CD4+/CD8+比值與HBV DNA載量之間亦無相關(guān)性（P＞0.05）。結(jié)論:慢性乙型肝炎患者外周血中CD4+CD25+Treg細(xì)胞增高,且與HBV的復(fù)制水平及ALT增高具有一致性,而T細(xì)胞亞群是否可作為監(jiān)測CHB患者免疫狀態(tài)的指標(biāo)需進一步探討。

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞;慢性乙型肝炎;T淋巴細(xì)胞亞群

乙型肝炎的肝細(xì)胞損傷主要是通過機體一系列的免疫介導(dǎo)所造成,其中以T細(xì)胞免疫為主。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell,Treg）是近十年發(fā)現(xiàn)的T細(xì)胞亞群,具有抑制效應(yīng)T細(xì)胞功能的作用。有研究資料表明,其與慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）的發(fā)生機制可能相關(guān),但目前對慢性乙型肝炎患者外周血中Treg的頻率報道并不一致[1,2],且國內(nèi)外對慢性乙型肝炎中的觀察僅限于其外周血中CD4+CD25+Treg的變化,很少結(jié)合與其T細(xì)胞亞群關(guān)系和HBV感染狀況的觀察。本研究對乙型肝炎患者外周血中CD4+CD25+Treg、CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群以及HBV DNA的表達(dá)水平和肝功能指標(biāo)及其相關(guān)性進行了觀察分析,現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 對象 2007年12月至2008年7月在海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治并臨床診斷的慢性乙型肝炎患者50例,其中男性34例,女性16例,年齡 20～75歲,平均年齡（39.10±16.71）歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2000年中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲病學(xué)分會、肝病學(xué)分會聯(lián)合修訂的《病毒性肝炎防治方案》[3]。所有病例均排除其他肝炎病毒感染和自身免疫性疾病,藥物、酒精性肝炎等。健康對照組20例,男性13例,女性7例,年齡22～ 61歲,平均年齡（37.50±9.74）歲,為我院健康體檢者,無肝炎病史,血清乙型肝炎標(biāo)志物均陰性,肝功能指標(biāo)均正常。所有病例及對照組均簽署知情同意書。

1.2 主要儀器和試劑 美國Bectond-Dickinson公司生產(chǎn)的FACS Calibur型流式細(xì)胞儀;抗CD3-PerCP、抗CD25-PE、抗 CD4-FITC、抗 Foxp3-APC及同型對照、CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4APCT細(xì)胞亞群試劑盒均購自美國Bectond-Dickinson公司;HBV DNA定量PCR試劑盒由中山醫(yī)科大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司提供,儀器為美國PE公司5700型DNA擴增儀;肝功能檢測試劑盒由廣州標(biāo)佳試劑有限公司提供,儀器為美國 Beckman Coulter公司生產(chǎn)的LX20型全自動生化分析儀。

1.3 方法

1.3.1 流式細(xì)胞儀檢測CD4+CD25highTreg細(xì)胞及胞內(nèi)Foxp3和T淋巴細(xì)胞亞群 取兩份新鮮采集的EDTA抗凝血各50μl分別置于不同的管中,分別加入抗CD3-PerCP、抗CD4-FITC、抗CD25-PE及抗CD3-PerCP、抗CD4-FITC、抗IgG1-PE各15μl,室溫避光孵育20分鐘,加入2 ml溶血素室溫避光10分鐘,1 000 r/min×5分鐘離心后棄上清液,加入PBS 2ml洗滌1次,1 000 r/min×5分鐘離心后棄上清液,加入PBS 250μl,上機使用CELLQuest軟件進行檢測,參照文獻[4]選擇熒光強度＞102的CD4+CD25high作為Treg細(xì)胞。記錄陽性細(xì)胞百分率,減去非特異性對照值。Foxp3胞內(nèi)染色時先進行細(xì)胞表面抗CD3-PerCP、抗CD4-FITC、抗CD25-PE染色20分鐘,加入2 ml溶血素室溫避光10分鐘,1 000 r/min×5分鐘離心后棄上清液,再加入破膜劑1m l避光10分鐘,破膜洗滌液洗滌2次,1 000 r/min×5分鐘離心后棄上清液,分別加入抗Foxp3-APC及同型對照抗IgG1-APC各15μl,避光孵育30分鐘,加入PBS 2m l洗滌1次,1 000 r/min×5分鐘離心后棄上清液,加入PBS 250μl,上機使用CELLQuest軟件檢測分析,以FSC、SSC、CD3-PerCP、CD4-FITC定義CD4+T 細(xì)胞,計算這細(xì)胞群內(nèi) CD25+Foxp3+細(xì)胞的比率。檢測CD3FITC/CD8PE/CD45Per-CP/CD4PE淋巴細(xì)胞亞群時另取新鮮采集的EDTA抗凝血50μl加入20μl試劑中,室溫避光孵育15分鐘,加入450μl溶血素,室溫避光10分鐘,上機使用MultiSET軟件獲取細(xì)胞并進行分析。

1.3.2 慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA的定量檢測 采用熒光定量PCR法,操作嚴(yán)格按照試劑說明書進行,檢測閾值為103copies/ml,HBV DNA＜1×103copies/m l為陰性結(jié)果。

1.3.3 肝功能檢測 使用全自動生化分析儀,操作嚴(yán)格按照試劑說明書進行。項目包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、乳酸脫氫酶、γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、總膽紅素、直接膽紅素、總膽汁酸、總蛋白、白蛋白、球蛋白、前白蛋白共12項。

2 結(jié)果

2.1 慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25highTreg表達(dá)水平 慢性乙型肝炎組CD4+CD25highTreg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞比例為（5.0±0.5）%,明顯高于健康對照組（3.9±0.8）%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01,表1、圖1）。進一步分析,根據(jù)HBV DNA載量的不同,將慢性乙型肝炎患者分為高載量組（HBV-DNA≥105copies/m l）,低載量組（HBV-DNA＜105copies/ml）,陰性組（HBV-DNA＜103copies/ml）。結(jié)果顯示隨HBV DNA載量增加,患者外周血中CD4+CD25highTreg細(xì)胞的水平升高,高載量組、低載量組和陰性組CD4+CD25highTreg細(xì)胞的表達(dá)水平分別為（5.7±0.6）%、（4.9±0.6）%和（4.3±0.5）%,高載量組均明顯高于低載量組和陰性組（P＜0.01）;低載量組高于陰性組（P＜0.01）,HBV DNA陰性組的CD4+CD25highTreg細(xì)胞高于對照組,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）,見表2。

2.2 慢性乙型肝炎患者外周血Foxp3+Treg表達(dá)水平 Foxp3是CD4+CD25highTreg細(xì)胞的一個特征性標(biāo)志。為證實在慢性乙型肝炎患者外周血中增高的CD4+CD25highTreg屬于T調(diào)節(jié)細(xì)胞,我們同時檢測了慢性乙型肝炎患者外周血中Foxp3的表達(dá)水平。慢性乙肝組和健康對照組CD4+CD25+Foxp3+表達(dá)率分別為（3.9±0.6）%和（2.9±0.5）%,慢性乙型肝炎組明顯高于正常對照組（P＜0.01,表1）。進一步分析,隨 HBV DNA載量增加,患者外周血中Foxp3+Treg細(xì)胞的水平升高,高載量組、低載量組和陰性組Foxp3+Treg細(xì)胞的表達(dá)水平分別為（4.5±0.4%）、（3.9±0.5）%和（3.2±0.5）%,高載量組均明顯高于低載量組和陰性組（P＜0.01）,低載量組高于陰性組（P＜0.01）,陰性組與健康對照組比較無明顯差異（P＞0.05）,見表2。

2.3 慢性乙型肝炎患者CD3+CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的變化 與健康對照組比較,患者組CD4+T細(xì)胞百分率及CD4+/CD8+比值均降低,分別為（28.5%±6.1%vs 33.6%±4.2%）及（1.12%±0.4%vs 1.4%±0.4%）,差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）;而CD3+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的百分率分別為（62.4%±9.2%vs 62.8%±7.4%）和（26.9%±6.4%vs 25.8%±6.2%）,與對照組比較差異無顯著性（P＞0.05）。高載量組、低載量組和陰性組CD4+T細(xì)胞百分率均低于健康對照組（P＜0.05）,但各載量組之間無明顯差異（P＞0.05）,高載量組和低載量組 CD4+/CD8+比值均低于正常對照組（P＜0.05）,而陰性組與對照組比較無明顯差異（P＞0.05）;CD3+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞百分率在各載量組無顯著性差異（P＞0.05）,見表2。

表1 慢性乙型肝炎患者外周血Treg及CD3+CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果（%）Tab.1 Testing results of Treg and CD3+CD4+CD8+T lymphocyte subgroup in peripheralblood of CHB patients（%）

表2 HBV-DNA不同載量的慢性乙型肝炎患者外周血Treg及CD3+CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群檢測結(jié)果（%）Tab.2 Testing results of Treg and CD3+CD4+CD8+T lymphocyte subgroup in peripheral blood of CHB patients with various copies of HBV DNA（%）

圖1 慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25high Treg細(xì)胞水平與健康對照組比較Fig.1 Comparision of the level of CD4+CD25high Tregs in peripheralblood between CHB patients and healthy controls

圖2 CHB患者外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平與Foxp3+Treg細(xì)胞成正相關(guān)Fig.2 Positive correlation between CD4+CD25+Tregs and Foxp3+Tregs in peripheral b lood of CHB patients

圖3 CHB患者外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平與HBV DNA取對數(shù)后呈正相關(guān)Fig.3 The number of CD4+CD25+Tregs correlated positively with logarithm of HBV DNA copies in peripheral blood of CHB patients

圖4 CHB患者外周血CD4+CD25+Treg細(xì)胞水平與ALT成正相關(guān)Fig.4 The level of CD4+CD25+Tregs correlated positively with that of ALT in peripheral blood of CHB patients

2.4 慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25highTreg水平與 CD4+CD25+Foxp3+Treg、CD3+CD4+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群、HBV DNA載量的關(guān)系 對50例慢性肝炎患者外周血CD4+CD25highTreg細(xì)胞與CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞亞群、HBV DNA載量之間采用Pearson直線相關(guān)分析,CD4+CD25highTreg細(xì)胞的變化與CD4+CD25+Foxp3+Treg水平變化成正相關(guān)（r=0.94,P＜0.001）;與HBV DNA取對數(shù)后成正相關(guān)（r=0.88,P＜0.001）;與 CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞的表達(dá)水平及CD4+/CD8+比值均無相關(guān)性（P＞0.05）,而CD3+、CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞及CD4+/CD8+比值與HBV DNA載量之間亦無相關(guān)性（P＞0.05）。見圖2、圖3。

2.5 慢性乙型肝炎患者外周血CD4+CD25highTreg水平與肝功能指標(biāo)的相關(guān)性 將CD4+CD25highTreg水平與肝功能檢測指標(biāo)做相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)CD4+CD25highTreg水平與谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）成正相關(guān)（r=0.432,P＜0.005）,見圖4。

3 討論

不同個體在HBV感染后的免疫學(xué)和臨床轉(zhuǎn)歸不同,這與宿主的人類白細(xì)胞抗原（Human leukocyte antigens,HLA）等遺傳學(xué)背景、HBV自身特性和細(xì)胞免疫應(yīng)答均相關(guān)。在慢性乙型肝炎患者,HLA-1限制性的針對HBV各類抗原表位的特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocytes,CTL）應(yīng)答常常不足或十分微弱,是肝細(xì)胞內(nèi)HBV不易清除,病情遷延不愈的重要機制之一[5]。而近年來的研究證實CD4+CD25+Treg細(xì)胞對CTL免疫應(yīng)答有調(diào)控作用,與乙型肝炎發(fā)病密切相關(guān)[1,2]。Treg細(xì)胞具有免疫無能性和免疫抑制性,在低濃度IL-2刺激下不反應(yīng),但在高濃度IL-2條件下經(jīng)TCR激活后可活化或增殖,抑制CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞IL-2的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),從而干擾其活化與增殖,而且對CD8+細(xì)胞的殺傷功能有明顯抑制[6,7]。Stoop等[2]發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者外周血中CD4+CD25+Treg細(xì)胞數(shù)量較正常人增多,去除CD4+CD25+Treg細(xì)胞后,HBV特異性增殖反應(yīng)增強。Xu等[8]研究發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者外周血中Treg細(xì)胞的水平明顯升高,且Treg細(xì)胞水平與其病毒載量呈正相關(guān),分離得到的Treg細(xì)胞具有誘導(dǎo)形成HBV抗原特異性Treg的能力,HBV抗原特異性Treg則促進了HBV感染的慢性化。我們的研究結(jié)果也表明,CHB患者外周血中CD4+CD25+Treg細(xì)胞明顯高于健康對照組,且隨HBV DNA載量增加,患者外周血中CD4+CD25highTreg細(xì)胞的水平亦升高。提示CD4+CD25+Treg細(xì)胞引起細(xì)胞免疫反應(yīng)下降,從而導(dǎo)致機體不能徹底有效清除病毒。

CD4+CD25highTreg作為天然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞,是Treg的主要組成成分。叉頭狀/翅膀狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子（forkhead/winged helix transcription factor,Foxp3）是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比較特異的標(biāo)志,特異性表達(dá)于小鼠Treg[9],而且在人胸腺和外周血及臍帶血中均分離出CD4+CD25+Foxp3+細(xì)胞[10]。Foxp3與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能密切相關(guān),是目前定義CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的最佳標(biāo)志物[11]。因此我們同時檢測CHB患者外周血中CD4+CD25highTreg細(xì)胞及其胞內(nèi)Foxp 3的表達(dá),證實患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+的水平變化與CD4+CD25highTreg細(xì)胞的數(shù)量改變相平行,且兩者之間成正相關(guān)。

研究CD4+CD25highTreg細(xì)胞水平與HBV DNA載量及ALT的水平關(guān)系發(fā)現(xiàn),CD4+CD25highTreg細(xì)胞水平與HBV DNA載量及ALT的水平之間均存在明顯的相關(guān)性。說明Treg細(xì)胞的免疫抑制效應(yīng)促進了HBV病毒的復(fù)制,從而加重肝功能的損害。動物實驗已經(jīng)證實[12],如果預(yù)先清除小鼠體內(nèi)的CD25+T細(xì)胞,通過基因治療后的小鼠體內(nèi)針對HBV特異性的效應(yīng)CD8+T細(xì)胞數(shù)量顯著升高。體外實驗表明,Treg可以抑制細(xì)胞增殖和IFN-γ分泌[4]。因此如果能將特異性阻斷CD4+CD25highTreg的方法和增強機體特異性抗HBV的免疫功能手段有機結(jié)合,也許能抑制HBV的復(fù)制,提高CHB的治療效果。

T細(xì)胞亞群是目前臨床上最常用的反映免疫功能狀態(tài)的指標(biāo),我們同時檢測了CHB患者的T淋巴細(xì)胞亞群,發(fā)現(xiàn)與對照組相比,CHB患者CD4+T細(xì)胞數(shù)量及CD4+/CD8+比值均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,CD8+T淋巴細(xì)胞雖有增高的趨勢,但與對照組比較無明顯差異。該結(jié)果提示 CHB患者外周血CD4+T細(xì)胞數(shù)量及CD4+/CD8+比值降低,顯示機體T淋巴細(xì)胞數(shù)量異常,免疫功能低下,可促進病毒的復(fù)制。其原因可能與其體內(nèi)Treg細(xì)胞含量較高有關(guān)系,Treg細(xì)胞抑制了CD4+T細(xì)胞的活化增殖和細(xì)胞因子的分泌,從而影響機體抗感染免疫應(yīng)答的發(fā)生,導(dǎo)致感染的持續(xù)。先前有報道CHB患者機體特異性的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)減弱是HBV慢性感染狀態(tài)持續(xù)存在的主要原因[13]。但我們的結(jié)果顯示CHB組CD3+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的百分率與對照組比較差異無顯著性。CD4+、CD8+、CD3+T細(xì)胞數(shù)量及CD4/CD8比值在HBV DNA各載量組之間均無明顯差異,且與HBV的復(fù)制水平均無明顯相關(guān)性?？赡苁且驗椴±龜?shù)較少,亦可能是CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞各自包含了很多功能各異的細(xì)胞群體,因此 T細(xì)胞亞群不能全面反映機體的免疫功能狀態(tài)。

本研究還發(fā)現(xiàn)CD4+CD25highTreg細(xì)胞與CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞的表達(dá)水平之間均無明顯的相關(guān)性,其確切原因不清楚,我們認(rèn)為慢性乙型肝炎患者體內(nèi)的T細(xì)胞調(diào)節(jié)是一個多因素參與的過程,CD4+及CD8+T細(xì)胞的抑制可能受多種途徑多種因素調(diào)控,CD4+CD25+Treg細(xì)胞只是其中一種。

綜上所述,CD4+CD25+Treg可能參與了慢性乙型肝炎發(fā)生、發(fā)展,CD4+CD25+Treg細(xì)胞與HBV的復(fù)制水平及ALT增高具有較好的一致性,可能是一個較好的反映細(xì)胞免疫功能狀態(tài)的參考指標(biāo),有望在臨床上用于免疫功能的監(jiān)測,而T細(xì)胞亞群是否可作為監(jiān)測CHB患者免疫狀態(tài)的指標(biāo)需進一步探討。

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[收稿2009-04-25 修回2009-12-21]

（編輯 倪 鵬）

Study on CD4+CD25+regulatory T cells and CD4+,CD8+T lymphocyte subgroup in peripheralblood of patientsw ith chronic hepatitis B

WUCui-Ping,QINXi,WANGHua-Min,WUCui-Yun,LiWen-Guang,LINDan,ZHUHong,LIYi.DepartmentofLaboratoryMedicine,HainanMedicalCollege,Haikou570102,China

Objective:To investigate thequantificationof CD4+CD25+regu latory T cellsand distributionof CD4+CD8+T lymphocyte subgroup in peripheral blood of patients in chronic hepatitis B（CHB）,and to reveal relationship between CD4+CD25+regulatory T cells,CD4+CD8+T lymphocyte subgroup and HBV infetion aswell.Methods:CD4+CD25high,CD4+CD25+Foxp3+Treg and CD3+CD4+CD8+T lymphocyte subgroup in peripheralblood from 50 patientswith CHB and 20 healthy controlswas analyzed using flow cytometry.HBV DNA was detected by fluorescence quantitative PCR.Results:The numberof CD4+CD25highTregs in patientswith CHBwas obviously higher than that in healthy controls（P＜0.01）and increased with copies of HBV DNA.The same with the change ofCD4+CD25+Foxp3+Tregs in patientswith CHB and therewasa positive correlation between CD4+CD25highTregs and CD4+CD25+Foxp3+Tregs（r=0.890,P＜0.001）.Comparedwith healthy controls,the frequency of CD4+T cells and the ratio of CD4+/CD8+in patientswith CHBwas declined,but therewas no significant difference in the frequency of CD3+T cells and CD8+T cells between them（P＞0.05）.The variation in the number of CD4+CD25highTregs was correlated positivelywith the copies of HBV DNA（r=0.782,P＜0.001）and glutam ic-pyruvic transaminase（ALT）（r=0.432,P＜0.005）separately,butnegatively with the frequency ofCD3+,CD4+,CD8+T cells and the ratio of CD4+/CD8+（P＞0.05）.The variation in the frequency of CD3+,CD4+,CD8+T cells and the ratio of CD4+/CD8+was also correlated negatively with the copies of HBV DNA（P＞0.05）.Conclusion:The number of CD4+CD25highTregs increases in patientswith CHB and is in accordance with the copies of HBV DNA and increased level of ALT.Further studies should be done to investigate weather CD4+CD8+T lymphocyte subgroup could be used to monitor the stateof community.

CD4+CD25+Treg;Chronic hepatitis B;T lymphocyte subgroup

R392.9

A

1000-484X（2010）03-0273-05

①吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院,長春130012

②同時就職于海南醫(yī)學(xué)院檢驗系,?？?71101

③海口市人民醫(yī)院,?？?70208

巫翠萍（1962年-）,女,副主任檢驗師,主要從事流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用及研究,E-mail:wucuiping2007@163.com;通訊作者及指導(dǎo)教師:覃 西（1959年-）,女,教授,主要從事臨床血液學(xué)和免疫學(xué)檢驗研究,E-mail:qinxi99@21cn.com。