堿性成纖維細(xì)胞生長因子緩釋膜延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮的實驗研究

田峰，田立杰，季相祿，趙巍

（中國醫(yī)科大學(xué) 附屬盛京醫(yī)院手足外科，沈陽 110004）

堿性成纖維細(xì)胞生長因子緩釋膜延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮的實驗研究

田峰，田立杰，季相祿，趙巍

（中國醫(yī)科大學(xué) 附屬盛京醫(yī)院手足外科，沈陽 110004）

目的 探索應(yīng)用堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）緩釋膜是否能夠延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮的進(jìn)程。方法 將28只大鼠左后肢制成失神經(jīng)腓腸肌模型，隨機(jī)分成2組，每組14只，A組腓腸肌內(nèi)置入含有bFGF的緩釋膜，B組腓腸肌內(nèi)置入不含bFGF的緩釋膜，術(shù)后30d取材，行腓腸肌組織學(xué)、肌濕重、肌動蛋白、肌纖維數(shù)量直徑和纖顫電位波幅測定。結(jié)果 A組腓腸肌的肌纖維數(shù)量（15.8±3.4）條和直徑（16.5750±3.8192）μm 均較 B組的（11.8±3.4）條和（10.6750±4.6760）μm 多和粗（P<0.05），A組肌肉的濕重（1.6907±0.4229）g，肌動蛋白含量（451.1241±47.1316）和纖顫電位波幅（0.1945±0.0420）μV均較 B組的（0.9320±0.0885）g，（378.2125±71.6568），（0.1552±0.0603）μV重、多和大（P<0.05）。結(jié)論 bFGF緩釋膜可以延緩失神經(jīng)肌萎縮的進(jìn)程。

堿性成纖維細(xì)胞生長因子；失神經(jīng)肌萎縮；大鼠

失神經(jīng)骨骼肌萎縮影響肢體功能恢復(fù)一直是臨床亟待解決的難題。雖然研究者對延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮進(jìn)行了許多探索［1］，但臨床上尚無確定有效的方法。本文采用在大鼠失神經(jīng)腓腸肌模型中置入含有堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）緩釋膜的方法，探索應(yīng)用bFGF緩釋膜是否能夠延緩失神經(jīng)骨骼肌萎縮的進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

健康雄性，體質(zhì)量250～350g的SD大鼠28只（購自中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心）。大鼠隨機(jī)分2組，每組14只，同體左后肢制成失神經(jīng)支配腓腸肌模型，右后肢為正常。A組：左側(cè)置入含有bFGF的緩釋膜，B組：左側(cè)置入不含有bFGF的緩釋膜。

1.2 試劑

采用沈陽醫(yī)學(xué)院研制的內(nèi)含bFGF的生物降解膜（國家發(fā)明專利號200410021474.07），此膜在體內(nèi)緩釋降解，藥物逐漸釋放，維持局部一定的藥物濃度（約 18ng/ml），緩釋時間為 25～30d。

1.3 動物模型

暴露大鼠后肢坐骨神經(jīng)并于中段切斷，神經(jīng)兩斷端分別反折固定于鄰近組織，斷端相距2cm；于實驗側(cè)腓腸肌中段肌膜下置入緩釋膜，顯微線縫合部分肌膜以固定。術(shù)后30d取材進(jìn)行多種指標(biāo)觀察。

1.4 肌纖顫電位波幅測試

觀察兩組失神經(jīng)腓腸肌纖顫電位波幅變化差異。

1.5 肌濕重測定

完整切下各組失神經(jīng)腓腸肌，用電子秤測其質(zhì)量。

1.6 組織學(xué)觀察

將實驗側(cè)腓腸肌從肌腹中央橫斷取材，經(jīng)10%中性緩沖甲醛液固定石蠟包埋，制成7μm厚的光鏡切片。部分材料經(jīng)HE染色及橫縱斷面連續(xù)切片，光鏡下觀察肌纖維結(jié)構(gòu)萎縮的差異；部分材料按ABC法（卵自素、生物素和卵自素生物素復(fù)合物免疫酶法）常規(guī)制成肌動蛋白免疫組化染色標(biāo)本（均設(shè)有陰性對照，試劑從Sigma公司購入），測量肌動蛋白染色后的灰度，鄰近陰性部位的灰度作為背景灰度，兩者的差值表示檢測部位的實際灰度。

1.7 圖像分析儀測定

兩組腓腸肌橫斷面切片400倍光鏡下測定同一單位面積內(nèi)的如下內(nèi)容：（1）肌纖維數(shù)量（條）；（2）肌纖維直徑（μm）。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

實驗結(jié)果用SPSS11.0進(jìn)行分析，兩組間比較采用t檢驗，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織學(xué)觀察結(jié)果

在縱橫斷面的HE染色切片上，兩組實驗側(cè)腓腸肌均明顯較其對照側(cè)發(fā)生萎縮，肌纖維變細(xì)、變少，橫紋不清，肌細(xì)胞核變多，肌間神經(jīng)束均變成結(jié)締組織索。實驗側(cè)腓腸肌A組較B組的肌纖維束完整，肌纖維排列緊密，肌纖維明顯較B組的多而粗，橫紋清楚的肌纖維和肌細(xì)胞核也較多（圖1）。

2.2 腓腸肌濕重測定結(jié)果

實驗側(cè)腓腸肌平均濕重A組為（1.6907±0.4229）g，與 B組的（0.9320±0.0885）g比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0196）。

2.3 肌動蛋白灰度測定結(jié)果

實驗側(cè)腓腸肌肌動蛋白平均灰度A組為（451.1241±47.1316），與 B組的（378.2125±71.6568）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0294），見圖 2。

2.4 顯微圖像分析儀測定結(jié)果

實驗側(cè)腓腸肌纖維數(shù)量A組為（15.8±3.4）條，與B組的（11.8±3.4）條比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0122）。實驗側(cè)腓腸肌纖維直徑A組為（16.5750±3.8192）μm，與 B組的（10.6750±4.6760）μm 比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0030）。

2.5 實驗側(cè)腓腸肌纖維纖顫電位波幅檢測結(jié)果

實驗側(cè)腓腸肌纖維纖顫電位波幅A組為（0.1945±0.0420）μV，與 B組的（0.1552±0.0603）μV比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.0238）。

3 討論

周圍神經(jīng)損傷修復(fù)后，由于神經(jīng)再生的速度極為緩慢，軸突需要相當(dāng)長的時間才能達(dá)到周圍靶器官，在靶器官重新獲得神經(jīng)支配之前肌肉就有可能發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的萎縮。bFGF是含155個氨基酸的促有絲分裂的陽離子多肽，對成纖維細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、腎上腺皮質(zhì)和髓質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等具有很強(qiáng)的促細(xì)胞分裂增殖活性［2］。

本研究結(jié)果表明應(yīng)用bFGF緩釋膜置入失神經(jīng)腓腸肌中能夠減輕肌纖維束萎縮進(jìn)程，延緩肌間神經(jīng)束纖維化的速度，減緩肌動蛋白、肌濕重及肌纖維顫電位的衰減速度。bFGF緩釋膜能夠保證藥物濃度在局部組織維持，比單純注射用藥更有利于藥效的發(fā)揮。

關(guān)于bFGF緩釋膜能夠延緩失神經(jīng)肌萎縮的方法為首次提出，鮮見于其他公開文獻(xiàn)中，本實驗也是對其進(jìn)行初步研究，其機(jī)制推測有以下幾方面：

首先，Borisov等［3］研究表明長期失神經(jīng)骨骼肌中肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量的下降是造成神經(jīng)修復(fù)療效欠佳的重要原因。其他學(xué)者研究［4，6］表明bFGF在促進(jìn)肌衛(wèi)星細(xì)胞活性和成肌細(xì)胞的增殖分化方面具有顯著效果。研究還表明缺血、缺氧、失神經(jīng)支配等常導(dǎo)致骨骼肌內(nèi)源性bFGF含量減少［7］。因此外源性bFGF能夠激活肌衛(wèi)星細(xì)胞向成肌細(xì)胞分化，并促使成肌細(xì)胞大量增殖分裂可能是其延緩失神經(jīng)肌萎縮的機(jī)制之一。

其次，Rifin 等［8，9］研究表明 bFGF是體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的最為有效的血管形成因子之一，它對新生血管形成過程中多個環(huán)節(jié)如毛細(xì)血管基底膜降解，內(nèi)皮細(xì)胞遷移增生，小血管腔形成等均有明顯促進(jìn)作用，因此bFGF也可以通過促進(jìn)局部毛細(xì)血管增生，改善局部血供氧供起到延緩失神經(jīng)肌萎縮的作用。

另外，bFGF還可以通過對аⅠ型前膠原基因表達(dá)的下行調(diào)節(jié)作用抑制膠原蛋白的合成，在促進(jìn)正常膠原纖維形成的同時抑制其過度沉積［10］，避免了失神經(jīng)骨骼肌間結(jié)締組織過度增生對肌組織的纏繞擠壓，這可能也是其延緩失神經(jīng)肌萎縮的原因之一。

以上僅是bFGF延緩失神經(jīng)肌萎縮的機(jī)制推測，bFGF緩釋膜如何應(yīng)用于臨床及能否取得預(yù)期的療效則需要進(jìn)一步的實踐來證明。

［1］李永平，梁炳生.失神經(jīng)骨骼肌萎縮防治研究進(jìn)展［J］.國際骨科雜志，2006：27（6）：341-343.

［2］陳惠，楊耀防.bFGF的生物作用分子機(jī)制研究進(jìn)展［J］.九江醫(yī)學(xué)，2009，24（1）：73-75.

［3］BorisovAB，DedkovEI，CarlsonBM.Differentiationof activated satellite cells in denervated muscle following single fusions in situ and in cell culture［J］.Histochem Cell Biol，2005，124（1）：13-23.

［4］Guthridge M，Wilson M，Cowling M，et al.The role of basic fibroblast muscle regeneration［J］.Growth Factors，1992，6（1）：53.

［5］Kujawa M，Baran W，Jankowska-Steifer E.Morphonmetric ultrastructural analysis of satellite cells in denervated rat soleus muscle［J］.Exp Mol Pathol，2004，76（2）：166-172.

［6］馬焰，高偉，孫月芬，等.堿性成纖維細(xì)胞生長因子對培養(yǎng)的骨胳肌細(xì)胞生長作用的研究［J］.中國臨床康復(fù)，2002，6（19）：2862-2863.

［7］Fu XB，Yang YH，Li XK，et al.Ischemia and reperfusion impair the gene expression of endogenous basic fibroblast growth factor（bFGF）in rat skeletal muscles［J］.JSurg Res，1998，80（1）：88-93.

［8］Rifin DB，Moscatelli D.Resent developments in the cell biology of basic fibroblast growth factor［J］.Cell Biol，1989，109（12）：1.

［9］俞桓錫，崔世軍，藤旭，等.血管內(nèi)皮生長因子-堿性成纖維細(xì)胞生長因子基因治療家兔肢體缺血的研究［J］.中華實驗外科雜志，2004，21（4）：406-407.

［10］Tan EM，Rouda S.Acidic and basic fibroblast growth factors downregulate collagen gene expression in keloid fibroblasts［J］.Am JPathol，1993，142（2）：463-470.

（編輯 武玉欣，英文編輯 陳 姜）

Delayed Effect of Basic Fibroblast Growth Factor on Denervated Skeletal Muscle Atrophy：An Experimental Study

TIANFeng，TIANLi-jie，JIXiang-lu，ZHAOWei
（Department of Hand Surgery，Shengjing Hospital，China Medical University，Shenyang 110004，China）

ObjectiveTo determine whether basic fibroblast growth factor （bFGF）could delay the process of denervated skeletal muscle atrophy.MethodsThe model of denervated skeletal muscle atrophy in rat left hindlimb was established.Atotal of 28rats were divided into 2groups （n=14each group）.Membrane containing bFGFand empty membrane were put into the denervated gastrocnemius in groups Aand B，respectively.Histological examination，measurement of the muscle weight，actin content，number and diameter of the muscle fiber，and electromyography were performed 30days after the operation.ResultsThere were significant differences in the number of muscle fiber，diamter of the muscle fiber，muscle weight，content of actin，and fibrillation potential amplitude between groups Aand B（number of the muslce fiber，15.8±3.4vs 11.8±3.4；diameter of the muscle fiber，16.5750±3.8192vs 10.6750±4.6760μm；msucle weight，1.6907±0.4229vs 0.9320±0.0885g；actin content，451.12411±47.1316vs 378.2125±71.6568；fibrillation potential amplitude，0.1945±0.0420vs 0.1552±0.0603μV；allP<0.05）.ConclusionbFGFcould delay the process of denervated skeletal muscle atrophy.

basic fibroblast growth factor；denervated skeletal muscle atrophy；rat

R651.3

A

0258-4646（2010）11-0925-02

田峰（1970-），男，副教授，碩士.E-mail：tianfeng2002@sina.com

2010-04-26