餓螞蝗抗氧化活性研究

張前軍， 劉瑜新， 康文藝， 李傳寬

(1.貴州大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025;2.河南大學(xué)天然藥物研究所，河南開(kāi)封475004)

餓螞蝗Desmodium sambuense(D.Don)DC.，為豆科山螞蝗屬植物，生長(zhǎng)在山坡草地或林邊，分布廣西、貴州、云南、福建、臺(tái)灣等地。該藥以根或全株及種子入藥。性味甘，涼，具清熱解毒，消食，止痛的功能。民間用于治療胃痛，小兒疳積，腮腺炎，淋巴結(jié)炎，毒蛇咬傷，脘腹疼痛，創(chuàng)傷，腸胃炎、乳腺炎、尿道炎、痢疾等疾病［1］。山螞蝗屬植物在全世界約有350種，分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，我國(guó)約27種，主產(chǎn)西南部至東南部。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)該屬植物的化學(xué)成分及活性研究?jī)H局限廣金錢(qián)草(Desmoium styracifolium)、葫蘆茶(Desmodium triquetrum)、排錢(qián)草(Desmodium blandum)、椴葉山螞蝗(Desmodium tiliaefolium)、大葉山螞蝗(Desmodium gangeticum)等少數(shù)品種。該屬植物的主要成分有黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、酚類(lèi)、三萜類(lèi)及酸類(lèi)化合物，具有消炎、抗菌、止痛、抗氧化、保肝、抗腫瘤、擴(kuò)張血管和對(duì)胰島素分泌的影響等活性［2-6］。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用多種體外抗氧化方法對(duì)餓螞蝗的葉和莖的醇提物進(jìn)行抗氧化研究，為開(kāi)發(fā)和利用山螞蝗屬植物提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

餓螞蝗于2008年8月采自貴州省貴陽(yáng)市，經(jīng)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院陳德媛教授鑒定為豆科山螞蝗屬植物餓螞蝗Desmodium sambuense(D.Don)DC.。二苯代苦味酰基自由基(DPPH，日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社);Fe3+-三吡啶三啞嗪(TPTZ，比利時(shí) Acros organics 公司);6-羥基-2，5，7，8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸(Trolox，美國(guó) Aldrich 公司);［2，2′-連氨-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽］(ABTS，美國(guó)Fluka公司);沒(méi)食子酸丙酯(PG，比利時(shí)Acros organics公司)，丁基羥基茴香醚(BHA，比利時(shí)Acros organics公司)，二丁羥基甲苯(BHT，比利時(shí) Acros organics公司)。甲醇，醋酸鈉，F(xiàn)eCl3·6H2O，冰醋酸，過(guò)二硫酸鉀均為分析純。UV-2000型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海尤尼可儀器有限公司)，電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化)。

1.2 方法

1.2.1 醇提物的制備

取餓螞蝗干燥葉和莖粉碎，以1∶10料液比(即1 g原料加10 mL液體)加入70%乙醇，于圓底燒瓶中經(jīng)回流提取1 h，同法重復(fù)提取3次。合并提取液，濃縮得醇提物浸膏，再經(jīng)70℃烘干，檢測(cè)水分小于5%，稱(chēng)重，干燥器內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 DPPH方法

參照文獻(xiàn)［7］，選擇0.06 mmol/L DPPH 乙醇溶液，將一定濃度的待測(cè)定樣品對(duì)半稀釋?zhuān)?.1 mL加入到3.5 mL DPPH溶液中，充分混合均勻，在室溫下靜置30 min后，在515 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)DPPH吸光度值，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性與陰性對(duì)照，通過(guò)如下公式計(jì)算得到樣品清除自由基的能力:

Acontrol為DPPH本身在測(cè)定波長(zhǎng)的吸收度，Asample為樣品對(duì)DPPH作用后的吸收度數(shù)值(除去樣品自身吸收)。同時(shí)將樣品清除自由基的能力與Trolox清除自由基的能力比較，確定其相對(duì)抗氧化活性，當(dāng)Trolox濃度在25～400 μmol/L時(shí)，與DPPH自由基清除率有很好的線性關(guān)系，R2=0.999 9。

1.2.3 ABTS方法

參照文獻(xiàn)［8］，ABTS·+貯備液制備:5 mL 7 mmol/L ABTS的水溶液，加入88 μL濃度為140 mmol/L potassium persulphate(比例為:1∶0.35)，混合液使用前在常溫下暗室放置12～16 h。ABTS+貯備液用甲醇稀釋(比例約:1∶88)，得到在734 nm處吸光度為0.80±0.02，并在30℃得到平衡。

方法:1 mL ABTS加入50 μL提取物，在試管中混勻。試管在30℃下保溫2.5 min或者5 min或10 min，在734 nm處測(cè)吸光度。Trolox的抗氧化活性:5 mmol/L Trolox甲醇貯備液加入此系統(tǒng)中，制定一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(Trolox的終濃度為0～20 μmol/L)。

式中，Acontrol為ABTS自由基本身在測(cè)定波長(zhǎng)的吸收度，Asample為樣品對(duì)ABTS自由基作用后的吸收度數(shù)值(除去樣品自身吸收)。同時(shí)將樣品清除自由基的能力與Trolox清除自由基的能力比較，確定其相對(duì)抗氧化活性，當(dāng)Trolox濃度在25～400 μmol/L時(shí)，與ABTS自由基清除率有很好的線性關(guān)系，R2=0.999 0。

1.2.4 FRAP方法

參照文獻(xiàn)［9］，貯備液制備:0.3 mol/L醋酸鈉緩沖液，pH 3.6(3.1 g CH3COONa·3H2O，16 mL CH3COOH);10 mmol/L TPTZ溶液用40 mmol/L的鹽酸配制;20 mmol/L FeCl3·6H2O溶液。TPTZ工作液由上述3者按體積比為10∶1∶1組成。TPTZ工作液需要新鮮制備，0.2 mL樣品溶液加入3.8 mL TPTZ溶液;0.1 mL樣品溶液加入3 mL TPTZ溶液;0.15 mL樣品溶液加入2.85 mL TPTZ溶液。上述混合液在37℃水浴中反應(yīng)30 min，在593 nm處測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果 見(jiàn)表1。

表1顯示，在DPPH方法中，餓螞蝗葉的醇提物清除DPPH的活性稍大于莖的醇提物。與陽(yáng)性對(duì)照相比，兩者清除DPPH的活性約為PG的1/10，BHA的1/5，均高于陽(yáng)性對(duì)照藥BHT，可見(jiàn)餓螞蝗具有較好的清除DPPH自由基能力。從表中還可看出，餓螞蝗葉和莖的醇提物對(duì)ABTS自由基的清除能力相差也不大，與清除DPPH活性不同的是，莖的醇提取物清除ABTS的能力稍大于葉的醇提物。與陽(yáng)性對(duì)照相比，兩者清除ABTS自由基的能力約為PG的1/9，BHA的1/4，均大于BHT。在FRAP方法中，餓螞蝗莖和葉還原Fe3+-三吡啶三啞嗪(TPTZ)的能力相差較大，以葉的還原能力較好，兩者還原TPTZ的能力遠(yuǎn)小于PG和 BHA，且均小于BHT。

表1 餓螞蝗醇提物抗氧化活性

圖1顯示，餓螞蝗醇提物隨著濃度的增加，其清除DPPH自由基的活性增加，當(dāng)濃度為30 μg/mL時(shí)，其對(duì)DPPH自由基的清除能力趨于飽和(清除率為90%)，再增加提取物濃度清除率也不再增加，說(shuō)明餓螞蝗醇提物對(duì)DPPH的清除能力具有劑量依賴(lài)性。從圖中還可以看出，在相同濃度下，餓螞蝗提取物清除DPPH自由基的能力均大于陽(yáng)性對(duì)照藥BHT。說(shuō)明餓螞蝗乙醇提取物具有較好的清除自由基的能力。

圖1 不同濃度樣品對(duì)DPPH自由基的清除能力

圖2顯示，餓螞蝗莖和葉的乙醇提物的清除ABTS自由基的能力基本一致。隨著濃度的增加，其清除ABTS自由基的能力增加，當(dāng)樣品濃度達(dá)到25 μg/mL時(shí)，其清除ABTS自由基的能力達(dá)到飽和(清除率為100%)，說(shuō)明餓螞蝗提取物對(duì)ABTS自由基的清除能力也具有劑量依賴(lài)性。從圖中還可以看出，當(dāng)樣品濃度大于5 μg/mL時(shí)，其清除ABTS自由基的活性大于BHT，說(shuō)明雖然兩者的IC50值與BHT相差不大，但是在相同濃度下，其清除ABTS自由基的能力大于BHT。

圖2 不同濃度樣品對(duì)ABTS自由基的清除能力

2.2 討論

DPPH·是一種很穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，若受試物能將其清除，則表明受試物具有降低羥基自由基、烷基自由基或過(guò)氧化自由基的有效濃度和打斷脂質(zhì)過(guò)氧化鏈反應(yīng)的作用［10］。DPPH·在515 nm附近有強(qiáng)吸收。當(dāng)有供氫能力的抗氧化劑存在時(shí)，孤對(duì)電子被配對(duì)，吸收消失或減弱，而吸光度變小的程度與自由基被清除的程度呈定量關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明餓螞蝗莖和葉的醇提物具有較好的降低羥基等自由基的有效濃度和打斷脂質(zhì)過(guò)氧化的能力，作者認(rèn)為這可能與餓螞蝗所含黃酮類(lèi)成分有關(guān)。

ABTS是一種水溶性的自由基引發(fā)劑，經(jīng)活性氧氧化后生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽(yáng)離子自由基ABTS·+。向其中加入被測(cè)物質(zhì)，當(dāng)待測(cè)物質(zhì)中含有抗氧化物時(shí)，該物質(zhì)會(huì)與ABTS·+發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系顏色褪去，在734 nm處有最大吸收即可反映物質(zhì)的抗氧化活性［11］。本實(shí)驗(yàn)中餓螞蝗的醇提物具有較好的清除ABTS·+能力，顯示較好的抗氧化活性。

在低pH值的溶液中，F(xiàn)e3+-三吡啶三啞嗪(tripyridyl-triazine，TPTZ)可被抗氧化劑還原為二價(jià)鐵形式，呈現(xiàn)出明顯的藍(lán)色，并在593 nm處有最大吸收，根據(jù)吸光度的大小計(jì)算出抗氧化活性的強(qiáng)弱。它反映的不是樣品針對(duì)某一種自由基的清除活性，而是樣品總還原能力，一些學(xué)者因此認(rèn)為該法測(cè)定結(jié)果可用來(lái)反映樣品總抗氧化活性［12］。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出，餓螞蝗莖和葉的醇提物總還原能力較弱，可能與餓螞蝗所含成分有關(guān)。

通過(guò)3種方法對(duì)餓螞蝗的莖和葉的醇提物進(jìn)行抗氧化活力研究，發(fā)現(xiàn)餓螞蝗乙醇提取物清除DPPH和ABTS自由基的能力比陽(yáng)性對(duì)照BHT好，餓螞蝗乙醇提取物還原Fe3+的能力不如陽(yáng)性對(duì)照藥;研究結(jié)果表明，餓螞蝗莖和葉的醇提物都具有較好的抗氧化能力。

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