番瀉總苷的純化工藝研究

顧 燕， 薛 明， 劉 萌， 張思訪， 嚴(yán) 軍， 張朝波

(南京海陵中藥制藥工藝技術(shù)研究有限公司，江蘇南京210049)

番瀉葉為豆科植物狹葉番瀉或尖葉番瀉的干燥葉，味甘、苦，性寒，歸大腸經(jīng)，具瀉熱行滯、通便、利水之功效，用于熱結(jié)積滯，便秘腹痛，水腫脹滿［1］。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道番瀉苷A和番瀉苷B為番瀉葉瀉下作用的主要有效成分，其瀉下作用及刺激性較其他含蒽醌類的瀉藥更強(qiáng)，臨床常用于急性便秘［2，3］。

本實(shí)驗(yàn)采用大孔樹脂進(jìn)行純化工藝研究，以番瀉苷A與番瀉苷B的含量為指標(biāo)，篩選最優(yōu)的純化條件。

1 試藥與儀器

1.1 儀器

安捷倫1100型高效液相色譜儀，DAD檢測(cè)器、BUCHI旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、梅特勒電子分析天平。

1.2 試藥與試劑

樣品 番瀉葉(江蘇省藥材公司)，番瀉苷A對(duì)照品(批號(hào):1126070 15204229含量≥97.0%)購自SIGMA公司，番瀉苷B對(duì)照品(批號(hào):1101562 10605370含量≥96.5%)購自SIGMA公司。

試劑 乙腈為色譜純，三氟乙酸、草酸、碳酸氫鈉均為分析純。

2 方法和結(jié)果

2.1 上樣液的制備

取番瀉葉藥材，加沸水20倍量，80℃保溫浸泡兩次，每次45 min，合并濾液，并用草酸調(diào)節(jié)pH=3，離心，離心液作為上樣液。

2.2 大孔吸附樹脂的預(yù)處理

取DM301大孔吸附樹脂，以95%乙醇濕法裝柱，浸泡24 h，再用95%乙醇洗脫，再依次用2%的氫氧化鈉溶液、純化水、5%鹽酸溶液浸泡沖洗，最后用純水洗至中性，備用。

2.3 含量測(cè)定［4，5］

2.3.1 色譜條件

以八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以0.1%三氟乙酸水溶液-乙腈系統(tǒng)梯度洗脫;檢測(cè)波長為340 nm;流速:1 mL/min;柱溫:25℃。洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.3.2 樣品及對(duì)照品的制備

對(duì)照品溶液的制備:精密稱取番瀉苷A對(duì)照品適量，以40%乙醇制成每1 mL含50 μg的對(duì)照品溶液;精密稱取番瀉苷B對(duì)照品適量，以30%乙醇制成每1 mL含70 μg的對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備:取番瀉總苷提取物細(xì)粉0.025 g，精密稱定，置100 mL量瓶中，加入40%乙醇80 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 KHz，30℃)5 min，放冷，加40%乙醇至刻度，混勻，濾過，取續(xù)濾液，即為供試品溶液。

2.3.3 樣品的測(cè)定

分別精密吸取上述對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2.4 吸附樹脂篩選研究

取番瀉葉藥材，按照2.1項(xiàng)進(jìn)行上樣液的準(zhǔn)備。取預(yù)處理合格的DM-301型大孔樹脂，分裝兩根柱(柱Ⅰ、柱Ⅱ)中，取上樣液上柱Ⅰ，然后以7倍量柱體積水洗去雜，再以1 L 1 mol/L小蘇打水溶液洗脫。自流出液顏色加深時(shí)開始接收，約接收1 L。用酸調(diào)節(jié)接收液至pH=3，上柱Ⅱ，然后以7倍量柱體積水洗去雜質(zhì)，再以50%乙醇洗脫，自流出液顏色加深時(shí)開始接收。接受液蒸干，按照2.3項(xiàng)方法測(cè)定樣品中番瀉苷A、B的含量。同法對(duì)D-101、DA-201和DS-401型大孔吸附樹脂分別進(jìn)行考察。結(jié)果見表2。

表2 不同型號(hào)大孔吸附樹脂對(duì)番瀉總苷的純化作用

結(jié)果表明DM-301型樹脂的除雜效果好，所得提取物中番瀉總苷的含量最高。所以我們選擇DM-301型樹脂。

2.5 DM-301型大孔樹脂分離番瀉總苷的工藝參數(shù)考察

2.5.1 樹脂吸附量的考察

取預(yù)處理過的DM-301大孔吸附樹脂共3份，分別裝柱(柱 1，2，3)，備用。

取番瀉葉600 g，按照2.1項(xiàng)進(jìn)行上樣液的準(zhǔn)備。上樣液分成3份，分別上柱，然后用410 mL(5倍柱床體積)水洗，合并流出液和水洗液，蒸干，按照2.3項(xiàng)方法測(cè)定樣品中番瀉苷A、B的含量。結(jié)果見表3。

表3 樹脂吸附量測(cè)定結(jié)果

結(jié)論:樹脂的平均吸附量為9.7 mg/g。以番瀉葉藥材中番瀉苷A、B的平均含量1.48%計(jì)，番瀉葉∶樹脂=100∶183(g/g)。

2.5.2 吸附速度的考察

取番瀉葉藥材800 g藥材，按照2.1項(xiàng)進(jìn)行上樣液的準(zhǔn)備，均分成4 份，分別以8、12、16、20 mL/min 的速度上樣，結(jié)果流出液中均未檢出番瀉苷A和B。因而選用20 mL/min的流速上樣。

2.5.3 水洗速度及用量的確立

取番瀉葉藥材800 g藥材，按照2.1項(xiàng)進(jìn)行上樣液的準(zhǔn)備，均分成4 份，分別以8、12、16、20 mL/min 的速度水洗，按照柱體積分段接受。結(jié)果4種流速水洗液中均無番瀉苷A、B，故選擇20 mL/min作為水洗流速。當(dāng)水洗至4 200 mL時(shí)，流出液的pH值接近中性，不顯酸性。因此水洗量確定為4 200 mL，即7倍柱體積。

2.5.4 吸附pH的影響

對(duì)上樣液的pH進(jìn)行了考察，比較pH在3、4、5、6的情況下樹脂柱的吸附能力。試驗(yàn)結(jié)果表明:pH值為3時(shí)DM-301大孔樹脂對(duì)番瀉苷A、B的吸附能力最強(qiáng)，上樣及水洗流出液中均未檢測(cè)到番瀉苷A、B，因此我們確定上樣液pH值為3。

2.5.5 NaHCO3的濃度和用量考察

由于番瀉苷A、B中含有兩個(gè)羧基(-COOH)，研究中發(fā)現(xiàn)，使用NaHCO3水溶液洗脫，再用水洗，能有效洗脫番瀉苷A、B，而大多數(shù)雜質(zhì)則保留在樹脂柱上。

我們?cè)O(shè)計(jì)了不同濃度和用量的NaHCO3水溶液洗脫，結(jié)果每200 g藥材以1 L 0.5 mol/L NaHCO3水溶液洗脫，再加純水洗脫，棄去前1 400 mL，繼續(xù)接收1 000 mL為最佳工藝。

2.5.6 二次上柱洗脫用乙醇的濃度考察

DM-301大孔樹脂為非極性樹脂，其洗脫方式應(yīng)用極性從大到小的溶劑洗脫，考察不同濃度的乙醇對(duì)番瀉苷的洗脫情況。

稱取4份番瀉葉，每份200 g，按照上述條件處理后2次上柱，設(shè)計(jì)不同濃度的乙醇進(jìn)行洗脫，洗脫液蒸干后按照2.3項(xiàng)法測(cè)定。結(jié)果見表4。

表4 不同乙醇洗脫的結(jié)果

從表中看出，20%的乙醇無法將番瀉苷洗出，30%和40%的乙醇只能洗出一部分番瀉苷，50%和60%的乙醇能將大部分番瀉苷洗脫出來，但從測(cè)定的圖譜看，60%乙醇洗脫物中含有較多的雜質(zhì)，因而我們選擇50%的乙醇作為洗脫液。

2.6 番瀉總苷最終的純化工藝

取番瀉葉，加沸水20倍量，80℃保溫浸泡兩次，每次45 min，濾液冷卻至室溫，調(diào)pH至3，離心。離心液上DM-301樹脂柱，純水洗至molish反應(yīng)呈陰性。以0.5 mol/L NaHCO3水溶液洗脫，然后以純水洗脫。自色帶即將流出時(shí)開始接收，鹽酸中和接收液，上另一DM-301樹脂柱，水洗，50%乙醇洗脫，洗脫液減壓濃縮成流浸膏，60℃減壓干燥，粉碎得棕褐色粉末，即得。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)利用酸調(diào)節(jié)pH值以釋放番瀉苷中的-COOH基團(tuán)，從而增加其在非極性大孔樹脂柱上的吸附性能，然后用NaHCO3洗脫，又將-COOH基團(tuán)轉(zhuǎn)化成-COO-有利于水的洗脫，使得番瀉苷與弱極性雜質(zhì)分離，其洗脫液再調(diào)至酸性，以增加番瀉苷的極性，二次上柱，用50%乙醇洗脫純化，以使番瀉總苷的含量達(dá)到50%以上，滿足藥用要求。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:242.

［2］鄧遠(yuǎn)輝，馮 怡，黃家輝.番瀉葉提取工藝研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2004，10(1):20-21.

［3］張亞東.乙醇提取番瀉葉中總番瀉苷的工藝優(yōu)選［J］.江蘇藥學(xué)與臨床研究，2002，10(3):20-21.

［4］曹 蔚，李教社，靖 會(huì)，等.反相高效液相色譜法測(cè)定番瀉葉中番瀉苷A含量［J］.中國中藥雜志，2003，28(1):84.

［5］呂曙華，呂歸寶.HPLC法測(cè)定番瀉葉中番瀉苷A及番瀉苷B的含量［J］.中國藥品標(biāo)準(zhǔn)，2002，3(5):48.