雙黃連注射液的氣相色譜指紋圖譜及其化學(xué)成分的相關(guān)性分析

茹 鑫， 梁 悅， 于 翠， 張寒琦， 師宇華

(吉林大學(xué)化學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130012)

雙黃連注射液收載于衛(wèi)生部部頒標(biāo)準(zhǔn)第十一冊(cè)，由金銀花250g、黃芩250g和連翹500g組成，為棕紅色澄明液體。有抗菌消炎，清熱解毒之功效，適用于球菌的各種感染。處方中金銀花、連翹、黃芩性寒味苦，含有揮發(fā)性成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，這些揮發(fā)性成分具有解熱、抗菌的作用［1］，應(yīng)加以利用。

目前雙黃連制劑的研究多以高效液相色譜法對(duì)其主要藥效成分分析為主。如張潔等［2］和馬百平等［3］采用HPLCPDA(二極管陣列檢測(cè)器)/ELSD(蒸發(fā)光散射)檢測(cè)器，將雙黃連粉針的指紋圖譜與各組成單味藥的指紋圖譜進(jìn)行比較分析，并進(jìn)行了各峰的藥味歸屬及定性。羅奇志等［4］采用液相色譜-質(zhì)譜方法快速、全面地分析了雙黃連粉針中的成分，為雙黃連粉針的二次開(kāi)發(fā)提供參考。李方等［5］建立了注射用雙黃連(凍干)的液相色譜指紋圖譜，用于該藥生產(chǎn)過(guò)程的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)。劉琳等［6］采用采用多波長(zhǎng)反相-高效液相色譜法建立了同時(shí)測(cè)定雙黃連口服液中黃芩苷、綠原酸和連翹苷的分析方法。此外，孫妍［7］和林林等［8］采用石墨爐原子吸收分光光度法分別檢測(cè)了雙黃連注射液中鎘和鉛元素，通過(guò)檢測(cè)有害金屬的含量控制雙黃連注射液的安全性。馬滿玲等［9］采用紫外光譜法對(duì)雙黃連注射液的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。中藥制劑的成分具有復(fù)雜性，采用一種方法進(jìn)行分析難以實(shí)現(xiàn)整體的質(zhì)量控制，實(shí)現(xiàn)藥品的安全和可靠。因此，為全面反映藥品整體的質(zhì)量狀況，有必要對(duì)其中多組分、多指標(biāo)進(jìn)行分析和研究。目前，對(duì)雙黃連注射液揮發(fā)性成分的研究少有報(bào)道。為有效控制雙黃連注射液中揮發(fā)性成分的質(zhì)量，針對(duì)制劑所含揮發(fā)性成分的特性，參照國(guó)家藥品監(jiān)督管理局頒布的中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求［10］，對(duì)雙黃連注射液中揮發(fā)性成分的提取和檢測(cè)條件進(jìn)行了考察和方法學(xué)驗(yàn)證。利用中藥色譜相似度評(píng)價(jià)軟件建立了雙黃連注射液的GC對(duì)照譜圖并與各組成單味藥進(jìn)行了對(duì)比和相關(guān)性分析，為雙黃連注射液的質(zhì)量控制和進(jìn)一步研發(fā)提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥

HD揮發(fā)油提取器;DHT型攪拌恒溫電熱套(山東鄄城華魯電熱儀器有限公司);Varian CP-3800氣相色譜儀;SPB-3全自動(dòng)空氣源(北京中惠普分析技術(shù)研究所);GCN1300氮?dú)獍l(fā)生器(北京中惠普分析技術(shù)研究所);SGH-300高純氫氣發(fā)生器(北京東方精華苑科技有限公司);FID檢測(cè)器;Star 5.0色譜工作站;島津QP2010型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀;雙黃連注射液(黑龍江多多藥業(yè)有限責(zé)任公司，市售10批次);正十二烷(色標(biāo)，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);正己烷為(分析純，北京化工廠);實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾用水。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 參照物溶液的制備

精密量取正十二烷50 μL，置于5 mL量瓶中，加入適量正己烷定容，作為參照物溶液。以正十二烷為標(biāo)準(zhǔn)參照物，計(jì)算各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。

1.2.2 供試品溶液的制備

準(zhǔn)確量取雙黃連注射液180 mL，置500 mL圓底燒瓶中，參照《中華人民共和國(guó)藥典》2005年版一部附錄XD揮發(fā)油測(cè)定法［11］，加熱回流提取8 h。停止加熱后，收集揮發(fā)油。加入10 μL參照物溶液，混勻、定容至0.3 mL，密封置于4℃冰箱中保存，作為供試品溶液。

1.3 氣相色譜及質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1 氣相色譜條件

進(jìn)樣量:0.5 μL，不分流進(jìn)樣;進(jìn)樣口溫度:280℃;FID檢測(cè)器溫度:280 ℃;色譜柱:DB-5MS(30 m ×0.25 mm，0.25 μm);柱溫:程序升溫，初始溫度50℃保持10 min，以5℃/min升至70℃后，以2℃/min升至100℃，再以10℃/min升至250℃保持10 min;載氣:高純氮?dú)?，流?1.0 mL/min;燃燒氣:高純氫氣，流量:30 mL/min;助燃?xì)?空氣，流量:300 mL/min。

1.3.2 氣相色譜-質(zhì)譜條件

進(jìn)樣量:0.5 μL，分流比為50∶1;進(jìn)樣口溫度:280℃;色譜柱:Rxi-5MS(30 m ×0.25 mm，0.25 μm);柱溫:同氣相色譜柱溫條件;載氣:氦氣，流速:1 mL/min。電子轟擊源:離子源溫度200℃，電子能量70 eV;掃描范圍:50～450 amu;接口溫度:250℃;倍增電壓:1.2 kV;閾值:1 000 V;溶劑切除時(shí)間:3 min;結(jié)束時(shí)間:54 min。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 精密度試驗(yàn)

將批號(hào)為080913311的樣品制成供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果表明:譜圖中各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，表明儀器精密度良好，符合指紋圖譜研究的技術(shù)要求。

2.1.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將批號(hào)為080302311的樣品制成供試品溶液，分別于10 min、3、9、12、18、24 和 48 h 進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明:譜圖中各主要色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD均小于3%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定，符合指紋圖譜研究的技術(shù)要求。

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn)

將6份批號(hào)為090213311的樣品分別制備成供試品溶液并進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明:譜圖中各主要色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD小于3%，表明供試品溶液的制備方法及儀器性能可靠，符合指紋圖譜研究的技術(shù)要求。

2.2 雙黃連注射液標(biāo)準(zhǔn)氣相色譜指紋圖譜和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照譜圖的建立

圖1 雙黃連注射液的氣相色譜指紋圖譜A;雙黃連注射液的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照譜圖BFig.1 A-GC fingerprint and B-Standard referenced GC fingerprint of Shuanghuanglian Injection

取10批次雙黃連注射液，分別按1.2.2項(xiàng)供試品溶液的制備方法和1.3.1項(xiàng)的色譜條件對(duì)供試品溶液進(jìn)行制備和檢測(cè)，建立了雙黃連注射液的氣相色譜指紋圖譜。采用浙江大學(xué)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)首次生成了雙黃連注射液的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照譜圖，標(biāo)示出15個(gè)共有峰(見(jiàn)圖1，其中圖 1A中 1～10分別為批號(hào) 080705322、090213311、090206311、080731312、080913311、090424311、080302311、080116312、080901322、080730322 的色譜圖，S 為參照物十二烷的峰，R為生成的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照譜圖;圖1B為放大的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照譜圖，其中1～15為15個(gè)共有峰，S為參照物十二烷的峰)。10批次樣品中各共有峰的峰面積、相對(duì)保留時(shí)間RSD、相對(duì)峰面積RSD以及生成的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照譜圖的保留時(shí)間和峰面積的數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。10批次樣品相似度的評(píng)價(jià)結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 雙黃連注射液氣相色譜指紋圖譜和標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照譜圖的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)Table.1 Experiment result of basic and standard referenced GC fingerprint of Shuanghuanglian Injection

從10批次指紋圖譜的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD可以看出:相對(duì)保留時(shí)間的RSD在0.04～0.72之間，均小于3%;相對(duì)峰面積的RSD在0.20～2.80之間(7號(hào)色譜峰除外，為3.25%)，均小于3%，各色譜峰相對(duì)峰面積存在一些差異，可能為所用的原料產(chǎn)地和季節(jié)性不同或儲(chǔ)藏方面存在差異造成的。

表2 相似度評(píng)價(jià)的結(jié)果Table.2 Result of similarity evaluation

利用中藥指紋圖譜相似度計(jì)算軟件，以10批次雙黃連注射液的指紋圖譜綜合平均作為對(duì)照模板，計(jì)算10批次樣品的相似度。從相似度評(píng)價(jià)的結(jié)果可以看出:相似度均大于0.87，說(shuō)明該廠家不同批次的雙黃連注射液在整體上具有一定的相似性。

2.3 雙黃連注射液中揮發(fā)性成分的定性及其相關(guān)性分析

分別按1.2.2項(xiàng)供試品溶液的制備方法和1.3.2項(xiàng)的氣相色譜-質(zhì)譜條件對(duì)供試品溶液進(jìn)行制備和檢測(cè)。對(duì)比雙黃連注射液及其各單味藥材中各揮發(fā)性成分GC-MS分析的結(jié)果，對(duì)各主要色譜峰進(jìn)行了定性和相關(guān)性分析。雙黃連注射液的總離子流圖見(jiàn)圖2，定性和歸屬分析的結(jié)果見(jiàn)表3。共檢測(cè)出雙黃連注射液中96個(gè)揮發(fā)性成分，按照各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和保留值規(guī)律［12］、計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索以及結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道［13-15］鑒定了其中的54個(gè)成分，占總峰面積的92.12%。其中芳香族化合物為揮發(fā)油的主要成分(占78.11%)，另外還有萜類(lèi)(8.39%)和脂肪族化合物(5.62%)。對(duì)其相關(guān)性分析的研究結(jié)果表明:對(duì)于相對(duì)含量較高的化學(xué)成分都能從各單味藥材的譜圖中找到歸屬，細(xì)化了中藥制劑的質(zhì)量控制指標(biāo)。歸屬的43個(gè)化合物占已鑒定成分峰面積百分含量的84.27%;未歸屬的11個(gè)化合物中含量最大的是8號(hào)色譜峰(水楊酸甲酯)，疑是加工過(guò)程中的輔料。

圖2 雙黃連注射液的總離子流色譜圖Fig.2 TIC chromatogram of Shuanghuanglian Injection

表3 雙黃連注射液的化學(xué)成分及其相關(guān)性分析Table.3 Chemical components and their correlation analysis of Shuanghuanglian Injection

續(xù)表3

3 結(jié)論

利用中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件，以10批次雙黃連注射液的指紋圖譜綜合平均生成的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照譜圖作為模板，計(jì)算了10批次樣品的相似度。研究結(jié)果表明:相似度在0.87～0.99，均大于0.85，說(shuō)明該廠家不同批次雙黃連注射液的質(zhì)量基本穩(wěn)定。但是不同的批號(hào)在含量上存在著一定差異，提示生產(chǎn)工藝或所用原料存在來(lái)源不穩(wěn)定問(wèn)題，中藥必須在固定原藥材產(chǎn)地及提取工藝的前提下，才能保證中藥注射液的質(zhì)量穩(wěn)定可控。標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照指紋圖譜的生成以及相似度評(píng)價(jià)使結(jié)果具有客觀性，避免了人為的誤差，從總體上較全面反映該制劑中揮發(fā)性成分的信息;結(jié)合各色譜峰的定性和相關(guān)性分析的結(jié)果可為雙黃連注射液的嚴(yán)格質(zhì)量控制和進(jìn)一步研發(fā)提供依據(jù)。

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