大孔樹脂富集純化四妙勇安湯總黃酮和綠原酸的工藝研究

王光寧， 李偉東

(1.廣東藥學(xué)院，廣東廣州510006;2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210029)

四妙勇安湯始載于清代的鮑相敖《驗(yàn)方新編》中，為治療熱毒型脫疽的著名古方，由金銀花、玄參、當(dāng)歸、甘草組成，該方能滋陰降火、和營解毒，為治療血栓閉塞性脈管炎的有效驗(yàn)方。藥理實(shí)驗(yàn)表明四妙勇安湯對炎癥早期血管通透性增高、滲出和水腫有明顯的抑制作用，且其抗炎作用不依賴于垂體-腎上腺系統(tǒng)［1］。方中主要含有黃酮類、有機(jī)酸及揮發(fā)油等成分，本文以綠原酸和總黃酮為考察指標(biāo)，考察大孔吸附樹脂對四妙勇安湯中主要成分的富集純化工藝。

1 儀器和試藥

1.1 儀器

安捷倫HPD1100(四元泵)高效液相色譜儀，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)，TU-1800紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)，AG285電子分析天平(瑞士METTLER公司)。

1.2 試藥

藥材:均由江蘇南京中醫(yī)大藥業(yè)有限責(zé)任公司提供，并經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)鑒定教研室吳德康教授按照《中國藥典》鑒定，金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾，玄參為玄參科植物玄參Scrophularia ningpoensis Hemsl.的干燥根，當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根，甘草為豆科植物甘草 Glycyrrhiza uralensis Fischer.的干燥根及根莖，均符合藥典要求。

試劑:蘆丁(購自中國藥品生物制品檢定所，含量測定用，批號:1538-200201)，綠原酸(購自中國藥品生物制品檢定所，含量測定用，批號:110753-200212)，其他試劑均為分析純，HPLC所用流動相均為色譜純，大孔吸附樹脂均購自河北滄州寶恩化工有限公司。

2 方法和結(jié)果

2.1 指標(biāo)測定方法的建立

2.1.1 總黃酮

對照品溶液的制備:取蘆丁對照品適量，精密稱定，用60%乙醇超聲溶解定容至50 mL，濃度為0.24 mg/mL。

線性考察:分別精密量取蘆丁對照品液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于 10 mL 量瓶中，加入5%亞硝酸鈉0.3 mL，搖勻，放置6 min，加10%硝酸鋁0.3 mL，搖勻，放置6 min后加4%NaOH液4 mL，用60%乙醇定容至刻度，放置15 min后，以試劑空白為對照，于紫外分光光度計(jì)510 nm處測定吸收度，以吸收度對濃度做線性回歸，得回歸方程為Y=11.686X+0.012，R2=0.999 2，濃度線性范圍:0.012～0.120 mg/mL。

樣品溶液的制備:精密量取樣品液0.5 mL于蒸發(fā)皿中，水浴揮干，用60%乙醇溶解定容至10 mL，精密量取1 mL于10 mL量瓶中，以下操作按照線性關(guān)系考察中加顯色劑，用空白試劑做對照，于紫外510 nm處測定吸光度。

2.1.2 綠原酸

色譜條件:色譜柱:LichroSPher C18(5 μm，250 mm ×4.6 mm);流速:1.0 mL/min;柱溫:30℃;檢測波長:324 nm，進(jìn)樣量為10 μL。流動相:乙腈－2%冰醋酸梯度洗脫，具體梯度見表1。

表1 流動相梯度比例

對照品溶液的制備:取綠原酸對照品適量，精密稱定，置100 mL量瓶中，用甲醇超聲溶解稀釋定容至刻度，搖勻，備用，濃度0.058 4 mg/mL。

線性考察:取對照品液進(jìn)樣量分別為1、2、4、6、8、10、12 μL，以峰面積對含量做回歸分析，得回歸方程 Y=1 661.1X+9.508 8，r=0.999 9，在 0.058 4-0.700 8 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;綠原酸的出峰時間為22.723 min，結(jié)果見圖1。

樣品制備:精密量取樣品液一定量于蒸發(fā)皿中，水浴揮干，用甲醇-水(1∶1)溶解定容至10 mL，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，備用。

空白實(shí)驗(yàn):將甲醇-水(1∶1)混合溶液進(jìn)樣10 μL，結(jié)果在綠原酸相應(yīng)的出峰位置無干擾。

圖1 綠原酸的HPLC圖譜(324 nm)

2.2 富集純化工藝條件的優(yōu)選

2.2.1 上樣藥液的制備

按照處方比例稱取藥材用水煎煮，提取條件參考文獻(xiàn)［2］，共提取3次，第1次用12倍量水提取1.5 h，第2次用10倍量水提取1.5 h，第3次用8倍量水提取1 h，過濾，合并濾液，減壓濃縮至濃度為0.2 g生藥/mL，加乙醇使醇濃度達(dá)到70%，靜置24 h，抽濾，洗滌沉淀，合并濾液，減壓回收乙醇，濃縮至一定濃度，備用。

2.2.2 樹脂型號的優(yōu)選

樹脂的預(yù)處理:稱取各個型號樹脂 HPD100、HPD200、HPD400、HDP600、D101、AB8、SP-825 各 10 g，用100 mL乙醇浸泡24 h，上柱，用水洗至無醇味，用5%HCl 500 mL沖洗，然后用5%NaOH 400 mL沖洗，用水洗至中性，最后用乙醇和水反復(fù)沖洗，直至醇洗液加水不變渾濁為止，然后用水沖至無醇味，流速控制在1.0 mL/min，備用。

上樣:上樣量為10 mL(0.2 g/mL)，動態(tài)上樣3次，流速為1.0 mL/min，然后靜態(tài)吸附20 h，瀝干藥液，殘留液用水定容至25 mL。

水洗脫:用水洗脫，每50 mL用Molish反應(yīng)檢測，收集水洗液至反應(yīng)陰性，記錄水用量，水洗液減壓濃縮至50 mL。

醇洗脫:用60%乙醇洗脫，每50 mL檢測總黃酮，收集至反應(yīng)陰性，記錄醇用量，醇洗液減壓濃縮至25 mL。

計(jì)算公式:比上柱量(mg/g)=(M上－M殘)/W，比吸附量(mg/g)=(M上－M殘－M水洗)/W，比洗脫量(mg/g)=M醇洗/W，純度=(總黃酮量 +綠原酸量)/浸膏重×100%。

(M上=上樣藥液中成分的量，M殘=上柱殘留液中成分的量，M水洗=水洗脫液中成分的量，M醇洗=醇洗脫液中成分的量，W=干樹脂的量)。

按照不同指標(biāo)含量測定方法，分別測定原藥液和各個樹脂的殘留液、水洗液、醇洗液的總黃酮、綠原酸的含量，計(jì)算比上柱量，比吸附量和比洗脫量，結(jié)果見圖2和圖3，綜合比較優(yōu)選最佳的樹脂類型為SP825型樹脂。

圖2 不同型號樹脂對總黃酮吸附和洗脫性能的影響

圖3 不同型號樹脂對綠原酸吸附和洗脫性能的影響

2.2.3 最大吸附量的考察

稱取SP825樹脂6份，每份5 g，進(jìn)行預(yù)處理，藥液濃度為 0.5 g/mL，上樣量分別為 2、5、8、10、15、15.8 mL。上樣后靜態(tài)吸附4 h，瀝干殘留液，用水定容至25 mL，用水洗脫至Molish反應(yīng)陰性，記錄用水量，水洗脫液減壓濃縮至50 mL。分別測定殘留液、水洗液的指標(biāo)成分的含量，以比上柱量和比吸附量為考察指標(biāo)綜合比較綠原酸的最大吸附量為15 mL(藥液濃度為0.5 g/mL)，樹脂量為5 g，結(jié)果見圖4。

圖4 綠原酸靜態(tài)吸附容量考察

2.2.4 樹脂上樣工藝的正交優(yōu)選

以比上柱量、比吸附量為考察指標(biāo)，對上樣樹脂的徑高比、上樣體積、動態(tài)上樣次數(shù)進(jìn)行正交考察，確定最佳的上樣工藝。稱取SP825樹脂5 g共9份，用乙醇浸泡24 h，上柱，用水沖至無醇味，然后用醇和水反復(fù)沖洗，直至醇洗液加水不變渾濁，用水沖至無醇味，備用。

按照L9(34)正交表進(jìn)行上樣，然后用水洗脫至Molish反應(yīng)陰性，記錄水用量。分別測定殘留液和水洗液的各個指標(biāo)成分的含量，計(jì)算比上柱量和比吸附量，進(jìn)行方差分析。見表2～5。

表2 上樣工藝因素水平

表3 總黃酮比上柱量的方差分析

表4 綠原酸比上柱量的方差分析

表5 總黃酮比吸附量的方差分析

結(jié)果表明，上樣體積對總黃酮和綠原酸的比上柱量有顯著影響，上樣體積對總黃酮的比吸附量有顯著影響，對綠原酸的比吸附量無顯著性影響;所以優(yōu)選上樣工藝為SP825樹脂5 g，上樣量10 mL，藥液濃度為0.5 g生藥/mL，選用柱子徑高比為25∶30(mm∶cm)，動態(tài)上樣4次。

2.2.5 不同濃度乙醇洗脫曲線考察

稱取SP825樹脂5 g，平行2份，對樹脂進(jìn)行預(yù)處理，上樣量為10 mL，藥液濃度為0.5 g/mL，動態(tài)上樣4次，瀝干殘留液，用水洗脫至Molish反應(yīng)陰性，記錄用水量，然后分別用 10%、30%、50%、70%、90%乙醇洗脫，用總黃酮檢測反應(yīng)陰性為洗脫終點(diǎn)，洗脫流速為2.0 mL/min，將殘留液、水洗液和不同醇濃度洗脫液減壓濃縮至25 mL，分別測不同濃度醇洗液的各個指標(biāo)成分的含量，以平均洗脫轉(zhuǎn)移率和純度為考察指標(biāo)，結(jié)果表明30% ～70%乙醇適于洗脫。見表6。

純度檢查:精密量取每份醇洗液樣品5 mL于蒸發(fā)皿中，揮干，減壓干燥，恒重后稱重。

2.2.6 洗脫工藝正交優(yōu)選

稱取SP825樹脂5 g共9份，按照2.2.2項(xiàng)方法處理樹脂，上樣量為10 mL，動態(tài)上樣4次，藥液濃度為0.5 g/mL，上樣流速為2.0 mL/min。上樣后用水洗脫至Molish反應(yīng)陰性，用水量為180 mL。見表7～9。

表6 乙醇洗脫的轉(zhuǎn)移率和純度

表7 洗脫工藝因素水平

表8 總黃酮比洗脫量的方差分析

表9 純度的方差分析

按照正交實(shí)驗(yàn)L9(34)安排洗脫條件，分別測定樣品醇洗脫液的各個指標(biāo)成分的含量，計(jì)算比洗脫量和純度。以比洗脫量和純度(總黃酮+綠原酸)為考察指標(biāo)，進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，三個因素對綠原酸的比洗脫量無顯著性影響，醇濃度對總黃酮的比洗脫量有極顯著性影響，對純度也有極顯著性影響，醇用量對純度有顯著性影響，洗脫流速無顯著性影響。綜合考察，最佳洗脫工藝為A1B3C3，即洗脫溶劑為50%乙醇150 mL，洗脫流速為2.0 mL/min。

2.3 最佳工藝條件驗(yàn)證

取SP825樹脂5 g，進(jìn)行預(yù)處理后，濕法上柱，柱子的徑高比25∶30(mm∶cm)，藥液上樣量為10 mL，藥液濃度為0.5 g生藥/mL，動態(tài)上樣4次，用水洗脫至Molish反應(yīng)陰性，水用量為280 mL，流速為2.0 mL/min，用150 mL 50%乙醇洗脫，洗脫流速為2.0 mL/min，分別測定醇洗液中的總黃酮和綠原酸的含量，計(jì)算轉(zhuǎn)移率(%)。具體結(jié)果見表10～11。

表10 各指標(biāo)性成分的洗脫轉(zhuǎn)移率

表11 純度檢查

由表10可看出，醇洗脫液中總黃酮和綠原酸的轉(zhuǎn)移率均達(dá)到了70%以上，由表11可看出，平均純度達(dá)到了50%以上，說明四妙勇安湯經(jīng)大孔樹脂處理后，起到了純化富集的目的。

3 討論

大孔樹脂是一種不溶于酸、堿及各種有機(jī)溶劑的有機(jī)高分子聚合物，應(yīng)用大孔樹脂進(jìn)行分離的技術(shù)是20世紀(jì)60年代末發(fā)展起來的繼離子交換樹脂后的分離新技術(shù)之一。大孔樹脂的孔徑與比表面積都比較大，在樹脂內(nèi)部具有三維空間立體孔結(jié)構(gòu)，由于具有物理化學(xué)穩(wěn)定性高、比表面積大、吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、解吸條件溫和、再生處理方便、使用周期長、宜于構(gòu)成閉路循環(huán)、節(jié)省費(fèi)用等諸多優(yōu)點(diǎn)［3］，所以目前被廣泛應(yīng)用于中藥的提取精制。

另通過藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，四妙勇安湯中50%醇洗液部位是抗炎的主要有效部位。作為抗炎名方，其抗炎物質(zhì)基礎(chǔ)為復(fù)方有效部位群，包括揮發(fā)油、總苷、總黃酮、總酚酸等，采用大孔吸附樹脂能富集純化除揮發(fā)油以外的其他有效部位群，該法簡單可行，也能夠應(yīng)用于大生產(chǎn)，為四妙勇安湯這一經(jīng)典古方的二次開發(fā)打下基礎(chǔ)。

在樹脂型號優(yōu)選時，主要以綠原酸為考察指標(biāo)，因備選的樹脂型號對總黃酮的吸附和洗脫性能影響不大，而對綠原酸的比吸附量影響較大，因此選擇SP825型樹脂。

［1］馬世平，瞿 融，徐向偉，等.四妙勇安湯的抗炎作用［J］.南京中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1994，10(6):27.

［2］王光寧，李偉東，蔡寶昌.正交試驗(yàn)法優(yōu)選四妙勇安湯的提取工藝研究［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，21(3):168.

［3］何 偉，李 偉.大孔樹脂在中藥成分分離中的應(yīng)用［J］.南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，21(2):134.