裸鼠原位膀胱癌放射性核素內(nèi)照射治療的實(shí)驗(yàn)研究

吳 光 侯建全

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，約占泌尿系統(tǒng)原發(fā)腫瘤的45%～70%，其中70%～80%為淺表性膀胱癌。當(dāng)前對膀胱癌的治療主要是經(jīng)尿道腫瘤切除術(shù)輔以膀胱灌注化療，降低腫瘤復(fù)發(fā)率及惡化率，但仍有約60%～80%的患者復(fù)發(fā)，其中10%～20%將發(fā)展成浸潤性膀胱癌，此時(shí)患者需行膀胱全切術(shù)且預(yù)后極差，因此，尋求更新且有效的治療方法，改善腫瘤患者的生存質(zhì)量并盡可能保留膀胱，是當(dāng)前亟待探索和解決的1個(gè)課題。我們前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)[1]：125IUdR膀胱灌注可提高局部藥物濃度，延長其在靶器官的滯留時(shí)間，并較少對周圍組織的毒副作用。本實(shí)驗(yàn)著重探討在裸鼠原位膀胱癌動(dòng)物模型125IUdR治療的有效性及安全性，為臨床試驗(yàn)提供前期工作。

1 材料與方法

1.1 材料

人膀胱癌T24細(xì)胞株，為T3期膀胱癌，購于中科院上海生物細(xì)胞研究所；BALB/c雌性裸鼠48只，由中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，4～5周齡，體重為(15±3)g；Na125Ⅰ由中國原子能科學(xué)研究院提供，UdR為Sigma公司產(chǎn)品；絲裂霉素(MMC)由浙江海正藥業(yè)股份有限公司提供；氨甲喋呤(MTX)由浙江萬馬藥業(yè)有限公司提供；Caspase-3購于武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 動(dòng)物模型的制備

參照前期研究[2]，將對數(shù)生長期T24膀胱癌細(xì)胞株調(diào)整濃度為2×107/ml，1%的戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，取下腹正中切口，暴露膀胱，自尿道插入22 G靜脈留置針套管，針芯輕劃膀胱左側(cè)壁4～5次，PBS液沖洗膀胱3～4次后立即灌注T24細(xì)胞懸液0.1 ml(細(xì)胞數(shù)約2×106個(gè))，至少保留1 h，并逐層縫合手術(shù)切口，每天觀察行為習(xí)慣、營養(yǎng)狀況及膀胱區(qū)有無異常腫塊。

1.3 125IUdR的制備

參照前期研究[1]合成125IUdR，將合成的125IUdR溶液和生理鹽水配制成18.5 KBq/10 μl的125IUdR溶液以備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)治療分組

種植后1周將36只實(shí)驗(yàn)裸鼠隨機(jī)分成4組，即對照組、MMC組、125IUdR組和聯(lián)合組，每組9只，對照組不予任何處理，其余3組分別予1 mg/ml的絲裂霉素0.1 ml、18.5 KBq/10 μl的125IUdR 0.1 ml、18.5 KBq/10 μl的125IUdR 0.1 ml聯(lián)合氨甲喋呤(膀胱灌注前1 h腹腔注射，注射量為20 mg/kg)膀胱灌注，每5天1次，共4次；實(shí)驗(yàn)前3天至實(shí)驗(yàn)當(dāng)天，125IUdR組及聯(lián)合組裸鼠每日灌入碘化鉀溶液1次，以封閉甲狀腺，第28天每組處死裸鼠3只，解剖膀胱腫瘤并稱重，進(jìn)一步行病理學(xué)檢查。其余實(shí)驗(yàn)裸鼠進(jìn)行為期60天的生存分析。

1.5 細(xì)胞周期分析

第2次膀胱灌注后24 h，對照組、125IUdR組與聯(lián)合組各隨機(jī)取3只裸鼠，采用頸椎脫臼法處死，每只切取直徑約3 mm新鮮膀胱腫瘤組織剪碎，經(jīng)300目/mm2濾網(wǎng)過濾制成單細(xì)胞懸液，70%冰乙醇固定2 h后以PBS液漂洗3遍，加入碘化丙啶(PI)，于4℃黑暗處靜置30 min后流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測p21基因的mRNA表達(dá)

Trizol一步法提取RNA，并用6-隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

p21 正義鏈，5’-ATGTC AGAAC CGGCT GGGGA T-3’；反義鏈，5’-GGGCT TTCCT CTTGG AGAAG AT-3’。內(nèi)參基因GAPDH正義鏈，5’- GCAAGTTCAACGGCACAG-3’；反義鏈，5’- GCCAGTAGACTCCACGAC-3’。

real-time PCR反應(yīng)體系：5×Buffer 5 μl，Mg2+0.4 μl，10 mmol的dNTP 0.75 μl，10 mmol的正義引物0.75 μl，10 mmol的反義引物 0.75 μl，Tag酶 0.3 μl，EVA green 1 μl，模板cDNA 2 μl，加H2O至25 μl。

PCR反應(yīng) 條件：95℃ 變性5 min；95℃ 變性20 s；58℃ 退火20 s；72℃ 延伸20 s，共45個(gè)循環(huán)；80℃ 讀板；72℃ 再延伸5 min。反應(yīng)完成后，將產(chǎn)物于4℃保存。長期保存溫度應(yīng)是-20℃。

通過2-△△CT方法進(jìn)行計(jì)算目的基因和內(nèi)參基因的相對拷貝數(shù)。

1.7 Caspase-3蛋白表達(dá)的檢測

免疫組化染色采用SP法(Streptavidin-biotin immunoperoxidase method)，Caspase-3為兔抗人IgG。Caspase-3蛋白染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：按照每張切片的陽性細(xì)胞比例及著色深淺計(jì)分，行半定量分析。陽性細(xì)胞所占比例判斷：無著色為0分，1/3以下著色為1分，1/3～2/3著色為2分，2/3以上著色為3分。著色深淺：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩項(xiàng)相乘0分為-，1～3分為+，4～6分為++，7～9分為+++；(+)為低表達(dá)，(++)為中度表達(dá)，(+++)為高表達(dá)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析或χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床觀察

膀胱灌注后第2～3周時(shí)對照組恥骨上區(qū)可觸及膀胱質(zhì)地變硬，輕輕擠壓可見明顯肉眼血尿，3周內(nèi)各組裸鼠均未見采食飲水、行為習(xí)慣的改變；第3～4周時(shí)，對照組部分裸鼠出現(xiàn)消瘦、采食飲水及活動(dòng)量減少，部分裸鼠死于惡病質(zhì)；MMC組和125IUdR組部分裸鼠出現(xiàn)采食飲水及活動(dòng)減少；聯(lián)合組裸鼠未見明顯變化。

2.2 實(shí)驗(yàn)裸鼠膀胱腫瘤重量測定

3個(gè)治療組裸鼠膀胱腫瘤重量分別為(41.583±4.945)mg、(42.825±2.590)mg和(31.075±3.931)mg，均較對照組輕(P<0.05)，3個(gè)治療組抑瘤率分別為33.45%、31.46%和50.27%，其中聯(lián)合組低于MMC組和125IUdR組(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組實(shí)驗(yàn)裸鼠平均膀胱腫瘤重量比較

2.3 病理檢查

HE染色結(jié)果顯示：對照組膀胱腔內(nèi)充滿腫瘤細(xì)胞，排列紊亂，異型性明顯，并見腫瘤細(xì)胞浸潤肌層；MMC組、125IUdR組膀胱腔內(nèi)覆蓋腫瘤細(xì)胞數(shù)十層，并可見膀胱腔存在，部分腫瘤細(xì)胞浸潤肌層，膀胱腔內(nèi)部分區(qū)域可見腫瘤壞死灶；聯(lián)合組膀胱腔內(nèi)覆蓋數(shù)層腫瘤細(xì)胞，膀胱腔清晰可見，膀胱腔內(nèi)可見大量的腫瘤壞死灶。

2.4 流式細(xì)胞儀分析(FCM)

流式細(xì)胞儀分析測定各組腫瘤細(xì)胞的G1期、S期百分比和凋亡指數(shù)(AI)。結(jié)果顯示：聯(lián)合組腫瘤細(xì)胞S期百分比明顯降低，腫瘤細(xì)胞大量停滯在G0/G1期，凋亡指數(shù)明顯大于對照組和125IUdR組，并見明顯的凋亡峰。125IUdR組腫瘤細(xì)胞S期百分比低于對照組，且凋亡指數(shù)大于后者，見表1。

表1 各組細(xì)胞周期分布及凋亡指數(shù)比較

注：△△為聯(lián)合組與對照組比較，P<0.05；△為125IUdR組與對照組比較，P<0.05

2.5 p21基因mRNA的表達(dá)

Real-time PCR檢測p21基因mRNA表達(dá)結(jié)果顯示：3個(gè)治療組其表達(dá)水平均明顯高于對照組(P<0.05)，其中聯(lián)合組高于MMC組和125IUdR組(P<0.05)；后兩者之間差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

圖2 各組腫瘤細(xì)胞p21基因相對拷貝數(shù)比較

2.6 Caspase-3蛋白染色

對照組腫瘤細(xì)胞中caspase-3蛋白呈低表達(dá)(評分為1.33分)，MMC組、125IUdR組和聯(lián)合組caspase-3蛋白分別呈中度表達(dá)、中度表達(dá)和高表達(dá)(評分分別為4.67、4.67和9分)，均明顯高于對照組，其中聯(lián)合組高于MMC組和125IUdR組，而后兩者之間差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.7 生存分析

對照組裸鼠平均生存時(shí)間為29.33天，而MMC組、125IUdR組和聯(lián)合組分別為35.33、36.67和44.67天，均大于對照組(P<0.01)，其中MMC組和125IUdR組平均生存時(shí)間較聯(lián)合組短(P<0.01)，MMC組和125IUdR組平均生存時(shí)間差異無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

在輻射致死效應(yīng)中，基因組DNA(genomic DNA)是細(xì)胞內(nèi)最重要的靶點(diǎn)。125Ⅰ標(biāo)記的脫氧尿苷(125IUdR)是脫氧胸苷(TdR)類似物，能特異性摻入處于S期細(xì)胞的DNA，引起DNA雙鏈斷裂和細(xì)胞死亡，屬于細(xì)胞周期特異性放射性藥物。膀胱是一理想的藥物灌注囊腔，且膀胱癌多起源于尿路上皮表層，故尤其適合放射性核素標(biāo)記的藥物使用，且局部應(yīng)用125IUdR可以維持較高的藥物濃度，又可減輕全身毒副作用。

由于腫瘤細(xì)胞呈異質(zhì)性增殖，某一特定時(shí)刻所有腫瘤細(xì)胞處于不同的細(xì)胞周期，國外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，氨甲喋呤能明顯抑制胸苷酸合成酶(TS)，阻斷內(nèi)源性脫氧胸苷的合成，并耗盡體內(nèi)的脫氧胸苷酸儲備，而125IUdR通過補(bǔ)救途徑磷酸化后能替代DNA中的脫氧胸苷酸。Kassis等[3]聯(lián)合應(yīng)用氨甲喋呤和125IUdR進(jìn)行研究，氨甲喋呤能阻斷125IUdR在體內(nèi)的降解，延長125IUdR治療時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)體外暴露于氨甲喋呤與125IUdR的腫瘤細(xì)胞可以增加125IUdR的攝取及125IUdR在DNA中的插入，提高腫瘤組織與非腫瘤組織放射活性比值；單獨(dú)鞘內(nèi)應(yīng)用氨甲喋呤療效較差，單獨(dú)應(yīng)用125IUdR療效較好，兩者聯(lián)合應(yīng)用療效有明顯提高。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)期內(nèi)聯(lián)合組裸鼠采食飲水、行為習(xí)慣等方面無明顯改變，而實(shí)驗(yàn)后期125IUdR組部分裸鼠出現(xiàn)采食飲水減少，活動(dòng)量逐漸減少；聯(lián)合組裸鼠平均膀胱重量明顯小于125IUdR組，且平均生存時(shí)間大于后者。說明氨甲喋呤聯(lián)合125IUdR的療效明顯優(yōu)于125IUdR單獨(dú)治療的療效。

本實(shí)驗(yàn)中我們應(yīng)用流式細(xì)胞儀對實(shí)驗(yàn)裸鼠膀胱腫瘤細(xì)胞的周期進(jìn)行了測定，結(jié)果顯示聯(lián)合組、125IUdR組腫瘤細(xì)胞的S期百分比明顯低于對照組，聯(lián)合組出現(xiàn)明顯的凋亡峰，表明125IUdR俄歇電子內(nèi)照射治療后主要使腫瘤細(xì)胞周期G1、S期檢查點(diǎn)的功能受到干擾，出現(xiàn)G1期阻滯，S期細(xì)胞比例下降，氨甲喋呤可增強(qiáng)125IUdR對膀胱腫瘤細(xì)胞的凋亡效應(yīng)。

p21基因是最廣泛的酶抑制活性的細(xì)胞周期抑制蛋白，p21蛋白廣泛地結(jié)合并抑制Cyclin-cdk復(fù)合物(細(xì)胞周期素依賴周期素的激酶復(fù)合物)，抑制cdk激酶的活性，阻止細(xì)胞通過G1/S期關(guān)卡，使細(xì)胞停留在G1期。劉新等[4]研究發(fā)現(xiàn)p21基因表達(dá)缺失可使膀胱腫瘤細(xì)胞增殖活躍；Kasasaki等[5]研究顯示p21基因是1種腫瘤抑制基因，在DNA損傷劑引起的細(xì)胞凋亡中起重要作用；Chen等[6]研究發(fā)現(xiàn)p21基因與膀胱癌的分級相關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示3個(gè)治療組腫瘤細(xì)胞p21基因mRNA表達(dá)水平明顯高于對照組，125IUdR明顯增加了p21基因的表達(dá)水平，而其中聯(lián)合組表達(dá)水平高于MMC組和125IUdR組，表明氨甲喋呤與125IUdR對膀胱腫瘤細(xì)胞p21基因的表達(dá)有聯(lián)合促進(jìn)效應(yīng)。

Caspase-3是caspase家族中的一員，在參與凋亡的多種caspase中，caspase-3是凋亡執(zhí)行階段的主要效應(yīng)酶之一，在細(xì)胞凋亡過程中處于核心位置，它的激活發(fā)生在凋亡細(xì)胞出現(xiàn)特征性形態(tài)改變之前，是凋亡過程的早期事件，caspase-3活性增強(qiáng)，不僅可以表明細(xì)胞凋亡的存在，還可表明細(xì)胞凋亡的發(fā)生是caspase-3依賴性的。caspase-3的表達(dá)表明細(xì)胞必定死亡，因此caspase-3被稱為死亡蛋白[7]。本試驗(yàn)caspase-3蛋白染色結(jié)果顯示，對照組腫瘤細(xì)胞caspase-3蛋白呈低表達(dá)，明顯低于其余3個(gè)治療組的表達(dá)；聯(lián)合組呈高表達(dá)；而MMC組和125IUdR組呈中度表達(dá)，與聯(lián)合組之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明125IUdR可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡，而氨甲喋呤與125IUdR有協(xié)同效應(yīng)。

總之，膀胱內(nèi)灌注125IUdR對實(shí)驗(yàn)裸鼠膀胱癌的治療安全有效，125IUdR能選擇性的殺傷DNA合成期S期的腫瘤細(xì)胞，顯著抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，干擾膀胱癌細(xì)胞的DNA合成，為125IUdR的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

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