125Ⅰ粒子對(duì)人結(jié)腸腺癌裸鼠皮下移植瘤的敏感性研究

楊 嶸 陳 億 羅開元

結(jié)腸癌發(fā)病率近年來有逐年上升的趨勢(shì)，已受到了醫(yī)學(xué)界同行的極大關(guān)注。盡管外科技術(shù)有了很大的改進(jìn)，但術(shù)后復(fù)發(fā)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移仍然是結(jié)腸癌患者的主要死亡原因之一。125Ⅰ粒子組織間植入內(nèi)放射治療結(jié)腸癌的應(yīng)用在我國(guó)有十年左右的歷史，臨床療效較好[1]。但是尚缺乏有說服力的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)成果為支撐。我們?yōu)樘接?25Ⅰ粒子對(duì)低分化結(jié)腸腺癌的治療療效及其作用機(jī)制，建立了荷瘤裸鼠皮下移植性低分化結(jié)腸腺癌模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性BALB/c-nu裸小鼠48只，SPF級(jí)，4～6周齡，體重17～18 g，購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所。HCT-116人低分化結(jié)腸腺癌細(xì)胞株引自美國(guó)ATCC，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤研究所提供。0.4mCi125Ⅰ 粒子及空白粒子購(gòu)于上海欣科醫(yī)藥有限公司。ABI prism 7300熒光定量PCR儀為美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司產(chǎn)品，總RNA抽提試劑盒及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為美國(guó)Invitrogen公司產(chǎn)品，熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系為Invitrogen公司和Sigma產(chǎn)品，HIF-1α及GAPDH引物采用文獻(xiàn)報(bào)道序列并由上海生工生物技術(shù)公司合成。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型的制備 待HCT-116癌細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用0.25%胰酶消化，離心后用生理鹽水吹打成細(xì)胞懸液，在無菌實(shí)驗(yàn)條件下，將癌細(xì)胞懸液按每只0.2 ml(1×107個(gè)細(xì)胞)接種于右前肢腋窩皮下，注射局部出現(xiàn)明顯皮丘，4 d后出現(xiàn)結(jié)節(jié)，每隔3天測(cè)量腫瘤體積大小，以腫瘤直徑5 mm為成瘤。當(dāng)瘤體長(zhǎng)徑為6～8 mm時(shí)，隨機(jī)分成對(duì)照組及125Ⅰ粒子治療組。125Ⅰ粒子治療組使用18 G穿刺針在距腫瘤邊緣1 cm處穿破皮膚，皮下潛行進(jìn)入腫瘤組織，進(jìn)針約12 mm，退出針芯。將一顆0.4 mCi125Ⅰ 粒子置入穿刺針，用圓頭針芯將125Ⅰ粒子輕輕推入腫瘤組織內(nèi)。對(duì)照組植入一?？瞻琢Ｗ?0 mCi)，與125Ⅰ粒子治療組做對(duì)比。

1.2.2 繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線圖 每3d使用游標(biāo)卡尺測(cè)量實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組腫瘤長(zhǎng)徑(a)及寬徑(b)，計(jì)算腫瘤體積。腫瘤體積=a×b2/2，并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線圖。

1.2.3 計(jì)算腫瘤抑瘤率 每7、14、21、28天各處死一批治療組及對(duì)照組裸鼠，電子天平秤取瘤重，取平均值，計(jì)算抑瘤率。腫瘤抑制率(100%)=(對(duì)照組平均瘤重-治療組平均瘤重)/對(duì)照組平均瘤重×100%。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(FQ-RT-PCR)測(cè)定腫瘤組織中HIF-1αmRNA的表達(dá) 總RNA抽提及采用RT-PCR 方法，按試劑盒說明書進(jìn)行操作。HIF- 1α上游引物：5'TCCAAGCCCTCCAAGTAT 3’，下游引物：5 'ATGCTAAATCGGAGGGTA3'，擴(kuò)增片段為568 bp，將管家基因GAPDH作為內(nèi)對(duì)照，上游引物：5’ACCACAGTCCATGCCATCAC3’，下游引物：5'TCCACCACCCTGTTGCTGTA 3’，擴(kuò)增產(chǎn)物為450 bp。熒光定量PCR反應(yīng)體系20 μL：cDNA模板1 μL。20 × SYBR GREEN I 熒光染料1μL，10 ×PCR buffer 2 μL，50 mmol/L Mg2+0.8μL，Hot-start Taq ase 0.2 μL，10 mmol/L dNTP 0.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，去離子水補(bǔ)足至20 μL，每個(gè)樣品均做3個(gè)復(fù)孔。美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司的7300型實(shí)時(shí)定量PCR儀器上進(jìn)行如下反應(yīng)：95℃ 10 min，95℃ 15 s，59℃ 20 s,68℃ l min 并收集熒光信號(hào)，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。PCR結(jié)束后采用溶解曲線確定產(chǎn)物特異性,軟件分析其Ct值；應(yīng)用△△Ct進(jìn)行相對(duì)定量，校正公式為Fold induction = 2-△△CT；數(shù)據(jù)經(jīng)處理后進(jìn)行分析比較。

1.2.5 流式細(xì)胞儀分析 采用剪碎機(jī)械法制備單細(xì)胞懸液樣品， PBS洗滌，加入70%冷乙醇固定后重新收集細(xì)胞，PBS洗去固定液，加入RNA酶反應(yīng)過夜，在暗室中碘化丙啶(PI)染色混勻15 min后，應(yīng)用流式細(xì)胞儀作流式細(xì)胞分析，汞激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，并應(yīng)用modfit LT 2.0軟件分析細(xì)胞周期分布及凋亡率。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

所有裸鼠均見腫瘤生長(zhǎng)，多成橢圓形，移植成功率為100%：粒子植入前，各組間均瘤體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各時(shí)間段處死裸鼠，取出移植瘤標(biāo)本。肉眼見腫瘤包膜完整，未向四周浸潤(rùn)。切面瘤體中心是壞死組織，色紅。外圍腫瘤組織呈白色魚肉狀，中間可見銀色金屬短棒即是植入的125Ⅰ粒子。移植瘤光鏡下HE染色證實(shí)為低分化結(jié)腸腺癌。

2.1 125Ⅰ粒子治療組及對(duì)照組腫瘤體積測(cè)量結(jié)果(表1)(圖1)

表1 荷瘤裸小鼠皮下移植瘤體積檢測(cè)結(jié)果

125Ⅰ粒子治療組較對(duì)照組腫瘤體積明顯縮小，瘤重減輕(P<0.05)。

圖1 植入125Ⅰ粒子后腫瘤生長(zhǎng)體積變化曲線圖

從各組的生長(zhǎng)曲線看，對(duì)照組的腫瘤生長(zhǎng)曲線高抬，粒子植入后第10天可見生長(zhǎng)曲線明顯上抬，表明腫瘤生長(zhǎng)速度顯著增快，而治療組生長(zhǎng)曲線一直低平，無明顯曲線斜率抬高現(xiàn)象。

2.2 125Ⅰ粒子對(duì)HCT-116細(xì)胞移植瘤抑瘤率的影響 (表2)

表2 125Ⅰ粒子治療組與對(duì)照組瘤重變化

治療組荷瘤裸鼠在125Ⅰ粒子植入第3周時(shí)，瘤重明顯輕于對(duì)照組，腫瘤生長(zhǎng)受明顯抑制，兩組瘤重差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。治療組第四組瘤重為(1.131±0.079)g，對(duì)照組第四組瘤重為(2.139±0.094)g，抑瘤率為47.12%。

2.3 125Ⅰ粒子對(duì)裸鼠人結(jié)腸癌移植瘤HIF-1αmRNA表達(dá)的影響

經(jīng)125Ⅰ粒子連續(xù)內(nèi)照射后，1、2、3、4周治療組HIF-1αmRNA表達(dá)水平均下調(diào)(圖2、圖3)，各治療組與其對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，治療組2、3、4周分別與第1周比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

圖2 125Ⅰ粒子作用1、2、3、4周對(duì)HCT-116細(xì)胞HIF-1αmRNA表達(dá)的影響

圖3 治療組和對(duì)照組HIF-1αmRNA表達(dá)變化趨勢(shì)圖

2.4 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期的再分布

125Ⅰ粒子治療組細(xì)胞周期發(fā)生了再分布，見表3。治療組G2/M期與對(duì)照組比較：隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)呈逐漸增加的趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；S期及G0/G1期未發(fā)生改變，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布結(jié)果

3 討論

125Ⅰ粒子組織間植入治療結(jié)腸癌的臨床應(yīng)用在我國(guó)已有10年歷史，并已證實(shí)該方法是一項(xiàng)有效的治療手段[2]。但該技術(shù)治療低分化結(jié)腸腺癌的基礎(chǔ)研究國(guó)內(nèi)外少有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：125Ⅰ粒子植入到人結(jié)腸癌HCT-116裸鼠皮下移植瘤中，可以明顯抑制瘤體的生長(zhǎng)，延長(zhǎng)瘤體倍增時(shí)間。經(jīng)測(cè)量瘤重計(jì)算得出第28天時(shí)腫瘤抑瘤率為47.12%。

腫瘤細(xì)胞增殖能力是決定其生長(zhǎng)速度的重要因素，低分化結(jié)腸腺癌由于其惡性程度較高，增殖能力較強(qiáng)而導(dǎo)致其預(yù)后不佳。缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)是缺氧條件下廣泛存在于哺乳動(dòng)物和人體內(nèi)的1種轉(zhuǎn)錄因子，由α、β 2個(gè)亞基組成。HIF-1β為基礎(chǔ)表達(dá)蛋白，HIF-1α為氧調(diào)節(jié)蛋白，決定著HIF-1的活性[3]。HIF-lα在常氧狀態(tài)下極不穩(wěn)定，而在細(xì)胞處于低氧條件時(shí)，HIF-α在多種組織細(xì)胞中表達(dá)水平增高，其穩(wěn)定性和活性也相應(yīng)增加。因此，低分化結(jié)腸腺癌由于其生長(zhǎng)速度較快，超過周圍血管的生長(zhǎng)速度而導(dǎo)致局部缺氧，進(jìn)而誘導(dǎo)HIF-1α的過度表達(dá)。而HIF-1α能增強(qiáng)其下游靶基因VEGF的表達(dá)，活化的HIF-1α與靶基因上的H1F-1α結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，從而啟動(dòng)靶基因轉(zhuǎn)錄和相應(yīng)的蛋白產(chǎn)物增加，VEGF表達(dá)增加，VEGF進(jìn)而作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體VEGFR1和VEGFR2，從而激活了一系列的缺氧轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)新血管的生成，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)[4]。本實(shí)驗(yàn)從基因水平上證實(shí)125Ⅰ粒子持續(xù)低劑量照射能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞HIF-1αmRNA表達(dá)下調(diào)，在一定的時(shí)間范圍內(nèi)存在時(shí)-效關(guān)系。

125Ⅰ粒子持續(xù)低劑量照射可以改變HCT-116大腸腺癌細(xì)胞周期分布。本實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著低劑量持續(xù)照射，治療組細(xì)胞周期阻滯于G2/M期，該期對(duì)放射線最敏感，限制腫瘤細(xì)胞增殖繼而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

綜上所述，125Ⅰ粒子近距離照射治療低分化結(jié)腸腺癌的療效在本實(shí)驗(yàn)中得以肯定。臨床術(shù)前可通過TPS計(jì)劃系統(tǒng)計(jì)算粒子植入具體位置及劑量大小，術(shù)中及術(shù)后結(jié)合其他方法綜合治療，相信該治療方法在未來會(huì)有更加廣闊的應(yīng)用前景。

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