99Tcm-DTPA-Gd的制備及其生物學(xué)分布

丁志凌，陳 躍，黃占文，張 偉，孫媛媛，張 莉

瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 核醫(yī)學(xué)科，四川 瀘州 646000

磁共振影像(magnetic resonance imaging，MRI)是目前重要的影像學(xué)檢查手段，與CT相比具有顯著優(yōu)勢，首先是對軟組織的空間高分辨率可以清晰顯示臟器及周圍組織的對比關(guān)系，可以提供精確的臟器解剖信息，其次MRI應(yīng)用不同的掃描序列和借助增強(qiáng)對比劑可以完成臟器的部分功能檢查。Gd-DTPA是MRI中應(yīng)用最早、最廣泛的釓類順磁增強(qiáng)對比劑。稀土元素釓(Gd)主要通過質(zhì)子弛豫增強(qiáng)作用縮短周圍組織及液體的T1、T2馳豫時間，主要是T1加權(quán)成像，廣泛應(yīng)用于腫瘤、神經(jīng)、心血管等疾患的診斷。早期應(yīng)用放射性同位素153Gd研究153Gd-DTPA的生物分布，認(rèn)為Gd-DTPA屬于細(xì)胞外顯像劑，由于分子量小、非脂溶性等因素不能滲透入細(xì)胞，靜脈注射后迅速從血管內(nèi)彌散到血管外，分布于細(xì)胞外結(jié)締組織間隙中，幾乎完全從腎小球?yàn)V過而排出體外。本工作擬通過放射性核素99Tcm標(biāo)記Gd-DTPA，觀察標(biāo)記的可能性，并進(jìn)一步研究99Tcm-DTPA-Gd的生物學(xué)分布。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要試劑和儀器

二乙三胺五乙酸(DTPA)和Gd-DTPA·2H2O均為美國Sigma Aldrich公司產(chǎn)品；氯化亞錫(SnCl2·2H2O)，成都科龍化工試劑廠；三氯乙酸(TCA)，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心。所有試劑均為分析純。成年健康昆明小鼠60只，體重20～30 g；成年家兔3只，體重1.5～2.0 kg，所有實(shí)驗(yàn)動物雌雄不限，均由瀘州醫(yī)學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供。

Millennium VG5 SPECT儀，美國GE公司；SN-695型自動γ免疫計(jì)數(shù)儀，中國科學(xué)院上海物理研究所日環(huán)光電儀器有限公司；MS-1000 自動薄層掃描儀，美國Bioscan公司；99Mo-99Tcm發(fā)生器，北京原子高科股份有限公司。

1.2 99Tcm-DTPA-Gd的制備

1.2.1標(biāo)記方法 參考文獻(xiàn)[1]中99Tcm-DTPA的標(biāo)記條件：設(shè)定Gd-DTPA與SnCl2摩爾比為10∶1，稱取Gd-DTPA 0.05 mmol(約27 mg)置于淋洗瓶中，用0.4 mL蒸餾水溶解，加入SnCl20.005 mmol(約1.0 mg，用0.1 mol/L HCl溶解)。加入1.0 mL新鮮淋洗的Na99TcmO4溶液(約74～185 MBq)，充分混勻后置45 ℃水浴中反應(yīng)30 min。本實(shí)驗(yàn)以99Tcm-DTPA作為實(shí)驗(yàn)對照。

1.3 血漿蛋白結(jié)合率測定

家兔心臟采血15 mL，肝素500 IU抗凝，3 000 r/min離心5 min，收集血漿約6 mL。取6支一次性塑料試管，每管加入0.8 mL血漿，分設(shè)2組，即99Tcm-DTPA-Gd和99Tcm-DTPA組。分別加入0.1 mL(約37 kBq)標(biāo)記物(99Tcm-DTPA-Gd和99Tcm-DTPA分別用生理鹽水稀釋至370 kBq/mL)。含標(biāo)記物的血漿試管置37 ℃水浴箱孵育2 h后，加入25%三氯乙酸4 mL，2 000 r/min離心5 min，棄上清液；再次加入10%三氯乙酸4 mL，2 000 r/min離心5 min，棄上清液，重復(fù)2次；每管加入生理鹽水0.4 mL再次離心清洗2次。本實(shí)驗(yàn)設(shè)總管(0.1 mL稀釋的標(biāo)記藥物)、非特異性管(不加血漿，加入0.1 mL稀釋的標(biāo)記藥物，相同步驟操作)和本底管(未加標(biāo)記物的試管)。最后用γ計(jì)數(shù)器測定試管的放射性計(jì)數(shù)，按以下公式計(jì)算血漿蛋白結(jié)合率：

血漿蛋白結(jié)合率=(沉淀中的放射性計(jì)數(shù)-非特異性管放射性計(jì)數(shù))/(0.1 mL標(biāo)記藥物放射性總計(jì)數(shù)-非特異性管放射性計(jì)數(shù))×100%。

1.4 小鼠體內(nèi)分布試驗(yàn)

60只昆明成年小鼠，雌雄不限，隨機(jī)分為2組，即99Tcm-DTPA-Gd組和99Tcm-DTPA組。按注射后不同時間點(diǎn)分為6組，每組5只。99Tcm-DTPA-Gd和99Tcm-DTPA分別用生理鹽水稀釋至約185 kBq/mL。取0.1 mL(18.5 kBq)標(biāo)記藥物小鼠尾靜脈注射，分別于注射藥物后1、5、10、15、30、60 min，先摘取眼球眶靜脈取血約1 mL，然后斷頸處死，解剖取出腦、心、肝、脾、肺、腎、小腸、肌肉等臟器，其中腎臟和腦組織為完整臟器，其余均剪取部分臟器，置預(yù)先稱重及標(biāo)記的一次性試管中稱重，獲得絕對質(zhì)量(g)。γ計(jì)數(shù)器分別測量0.1 mL注射總計(jì)數(shù)(Total,T,n=5)、本底管計(jì)數(shù)(Background,B,n=5)和每管放射性計(jì)數(shù)，計(jì)算每克組織百分注射劑量率(%ID/g)，結(jié)果以(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示。

1.5 家兔顯像

兩只成年家兔用于顯像。SPECT儀配通用平行孔準(zhǔn)直器，選擇腎動態(tài)顯像模式，雙時相采集(灌注相，幀/2 s，60 s；功能相，幀/30 s，60 min)。用0.1 mol/L NaOH溶液分別調(diào)節(jié)99Tcm-DTPA-Gd和99Tcm-DTPA的pH值為4.0～6.0。0.1 mL (約18.5～37 MBq)標(biāo)記藥物經(jīng)家兔耳緣靜脈注射，即刻采集，沿雙腎邊緣勾畫感興趣區(qū)(ROI)，計(jì)算機(jī)處理獲得部分功能參數(shù)，包括分腎攝取百分比(%)、達(dá)高峰時間(Tmax)、半排時間(T1/2)。每只家兔均進(jìn)行99Tcm-DTPA-Gd和99Tcm-DTPA顯像對比分析。為了避免前一種藥物的干擾，間隔48 h后進(jìn)行第二種藥物顯像。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果和討論

2.1 標(biāo)記物的標(biāo)記率、放化純度和穩(wěn)定性分析

99Tcm-DTPA-Gd標(biāo)記溶液外觀澄清透明。以生理鹽水和丙酮為展開劑時，99Tcm-DTPA-Gd與99Tcm-DTPA具有相同的Rf值，即在生理鹽水中Rf=0.9～1.0，在丙酮中Rf=0～0.1。計(jì)算99Tcm-DTPA-Gd的標(biāo)記率為98.7%。室溫放置6 h內(nèi)，標(biāo)記物放化純均大于95%，可滿足實(shí)驗(yàn)要求。

測得最終標(biāo)記溶液的pH≈2.0；2種標(biāo)記物用生理鹽水稀釋至370 kBq/mL時，測pH值均為6.0～6.2；0.8 mL血漿中加入0.1 mL稀釋后的標(biāo)記物(370 kBq/mL)，測pH值均為7.2左右。兩種標(biāo)記物分別用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 為4.0～6.0，測定放化純無明顯變化，均大于95%。

2.2 血漿蛋白結(jié)合率

99Tcm-DTPA是核醫(yī)學(xué)檢查中常用的腎動態(tài)顯像劑，靜脈注射后幾乎全部經(jīng)腎小球?yàn)V過，是目前公認(rèn)的評價腎小球?yàn)V過率的最佳方法[2]。一般認(rèn)為99Tcm-DTPA體內(nèi)的血漿蛋白結(jié)合率在3%～10%，這種差異與藥盒組成有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)用三氯乙酸沉淀法測定99Tcm-DTPA-Gd在家兔血漿中的蛋白結(jié)合率。實(shí)驗(yàn)中測得總管放射性計(jì)數(shù)約為40 000；沉淀放射性計(jì)數(shù)約為1 600；非特異性管約為180；本底管約為160(均為均數(shù))。測得99Tcm-DTPA-Gd和99Tcm-DTPA的血漿蛋白結(jié)合率分別為(3.80±0.25)%和(3.48±0.26)%。配對t檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.104)。

Gd-DTPA類順磁增強(qiáng)對比劑廣泛應(yīng)用于腫瘤、神經(jīng)、心血管以及腎臟的形態(tài)和功能檢查[3]。Gd-DTPA靜脈注入機(jī)體后，主要分布在細(xì)胞外液經(jīng)腎臟排泄，1～3 h約80%排除體外，體內(nèi)血漿蛋白結(jié)合率很低。DTPA是重要的8齒配體，其分子結(jié)構(gòu)中含有3個氮原子和5個羧基，螯合能力強(qiáng)，進(jìn)入體內(nèi)幾乎全部經(jīng)腎小球?yàn)V過而排除體外。Gd與DTPA絡(luò)合穩(wěn)定，在體內(nèi)外穩(wěn)定性好而不易解離，DTPA的部分配位原子與Gd(Ⅲ)絡(luò)合，分子中存在過剩的配位原子，99Tcm在適當(dāng)?shù)臈l件下可以與Gd-DTPA形成螯合物。

2.3 標(biāo)記物在小鼠體內(nèi)生物分布

表1列出了99Tcm-DTPA-Gd和99Tcm-DTPA在健康昆明小鼠血液及主要臟器的每克組織百分注射劑量率(%ID/g)。 由表1可知，2種標(biāo)記物具有相似的生物分布，注射后1 min血液攝取均達(dá)到最高，分別為(14.79±9.77)%ID/g和(10.65±4.28)%ID/g；99Tcm-DTPA-Gd 在注射后1 min腎臟攝取達(dá)最高((26.02±8.50)%ID/g)，注射后5 min腎臟排泄大于50%。99Tcm-DTPA在注射后5 min腎臟攝取最高((16.86±5.55)%ID/g)，注射后5～10 min腎臟排泄約至50%。各時間點(diǎn)，腦組織分布最少(小于1%ID/g)；心臟、肝臟、脾臟和肺臟有部分?jǐn)z取。注射后60 min兩種標(biāo)記物在各主要臟器內(nèi)分布很少，其中99Tcm-DTPA-Gd組各臟器攝取率均小于1%ID/g，99Tcm-DTPA在血液、肺臟和腎臟攝取率大于1%ID/g。

表1 99Tcm-DTPA-Gd和99Tcm-DTPA在小鼠體內(nèi)的生物分布Table 1 Biodistribution of 99Tcm-DTPA-Gd and 99Tcm-DTPA in mice

注(Note)：n=5

Gd-DTPA與99Tcm-DTPA具有相同的腎臟濾過和排泄機(jī)制，Gd-DTPA通過靜脈進(jìn)入機(jī)體后，存在于細(xì)胞外的組織液，不進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，幾乎全部經(jīng)腎臟由腎小球?yàn)V過排泄，24 h排泄率大于90%。Weinmann等[4]用153Gd標(biāo)記DTPA，以大鼠為實(shí)驗(yàn)對象，結(jié)果表明，靜脈注射153Gd-DTPA 后5 min約10%分布于全身血液；血液濃度清除半衰期約20 min；至3 h約80%通過腎臟排泄出體外，腎臟排泄半衰期約20 min；7 d后，有90%回收于尿液，7%來自糞便。Prato等[5]研究表明，盡管153Gd-DTPA與99Tcm-DTPA分布特性比較接近，排泄相似，但99Tcm-DTPA在血液和肺臟的滯留超過153Gd-DTPA，而腎臟的滯留低于153Gd-DTPA，原因是99Tcm-DTPA的部分血漿蛋白結(jié)合。李明等[6]的研究顯示153Gd-DTPA與99Tcm-DTPA排泄基本相同，153Gd-DTPA血液清除符合2室模型，T1/2(α)為1.5 min，T1/2(β)為29.9 min。本實(shí)驗(yàn)中99Tcm-DTPA-Gd和99Tcm-DTPA的血漿蛋白結(jié)合率沒有顯著性差異，兩種標(biāo)記藥物在小鼠體內(nèi)具有相似的生物分布，99Tcm-DTPA-Gd主要經(jīng)腎臟排泄，由于血腦屏障的完整性，99Tcm-DTPA-Gd不能進(jìn)入正常腦組織，注射后60 min，大部分排出體外而沒有臟器的特異性滯留。

2.4 家兔腎動態(tài)顯像

正常成年家兔腎動態(tài)顯像顯示注射99Tcm-DTPA-Gd 后1 min雙腎影逐漸出現(xiàn)，至5 min時清晰顯影。正常家兔注射兩種標(biāo)記藥物后6.5～8.0 min的腎動態(tài)顯像圖像分別示于圖1、2。由圖1、2可知，標(biāo)記藥物主要濃聚于雙腎和膀胱，至顯像結(jié)束，大部分標(biāo)記藥物聚集在膀胱，雙腎有少量滯留，血周圍本底較低，無其它臟器的特異性攝取和滯留。正常家兔注射兩種標(biāo)記藥物后腎動態(tài)顯像的功能參數(shù)列入表2。由表2可知，99Tcm-DTPA-Gd和99Tcm-DTPA的排泄基本相同，腎臟達(dá)高峰時間約為5～10 min，半排時間約為10～20 min。

綜上，99Tcm-DTPA-Gd和99Tcm-DTPA在生物體內(nèi)的排泄和分布基本相同，可能與二者具有相同的血漿蛋白有關(guān)。藥物的血漿蛋白結(jié)合是影響藥物排泄和分布的一個重要因素。Russell等[7]研究了3種來自不同廠家的腎動態(tài)顯像劑藥盒(99Tcm-DTPA)，結(jié)果顯示各藥盒標(biāo)記物的血漿蛋白結(jié)合存在顯著性差異，這種差異影響到了腎小球?yàn)V過率(GFR)的正確計(jì)算。同時，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種標(biāo)記藥物在動物體內(nèi)的分布和排泄又不完全相同，其中影響因素較多，包括標(biāo)記藥物的標(biāo)記率、放化純度、注射方法、注射劑量、藥物的分子量、電荷性以及組織器官的病理生理特性等等。其中Assadi等[8]研究認(rèn)為不同劑量的99Tcm-DTPA測定GFR會有不同的結(jié)果。普遍認(rèn)為99Tcm-DTPA進(jìn)入體內(nèi)后僅存在于細(xì)胞外組織間隙而不彌散進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，除腎臟攝取排泄外不會被其它臟器特異性攝取。但Arheden等[9]在一項(xiàng)大鼠的試驗(yàn)研究中卻發(fā)現(xiàn)99Tcm-DTPA在缺血后再灌注的受損心肌中有較高的滯留，源于受損的心肌不能有效清除99Tcm-DTPA所致。

圖1 正常家兔注射99Tcm-DTPA-Gd后腎動態(tài)顯像Fig.1 Renal scintigram with 99Tcm-DTPA-Gd in rabbit after injection(a)——6.5 min，(b)——7.0 min，(c)——7.5 min，(d)——8.0 min

圖2 正常家兔注射99Tcm-DTPA后腎動態(tài)顯像Fig.2 Renal scintigram with 99Tcm-DTPA in rabbit after injection (a)——6.5 min，(b)——7.0 min，(c)——7.5 min，(d)——8.0 min

標(biāo)記物(Labelingcompounds)家兔(Rabbits)放射性攝取(Uptakeratio)/%Tmax/minT1/2/min左腎(Leftkidney)右腎(Rightkidney)左腎(Leftkidney)右腎(Rightkidney)左腎(Leftkidney)右腎(Rightkidney)99Tcm?DTPA142957178681020125054953131607599Tcm?DTPA?Gd13826186888141165250549553438295

醫(yī)學(xué)影像技術(shù)的發(fā)展逐漸向多模式的圖像融合發(fā)展，其中多模式顯像劑的研究是目前的一個熱點(diǎn)[10]。筆者認(rèn)為，在本實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上可以進(jìn)一步研究設(shè)計(jì)一種新型的顯像劑，適用于SPECT和MRI顯像，通過影像融合技術(shù)以提高腫瘤診斷的準(zhǔn)確性。

3 結(jié) 論

應(yīng)用放射性核素99Tcm標(biāo)記磁共振增強(qiáng)對比劑Gd-DTPA方法簡單、標(biāo)記率高、穩(wěn)定性好。Gd-DTPA與99Tcm連接后，動物體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)顯示標(biāo)記后Gd-DTPA生物分布特性基本沒有改變。99Tcm-DTPA-Gd與99Tcm-DTPA具有相似的生物分布，應(yīng)用99Tcm標(biāo)記順磁對比劑Gd-DTPA既可進(jìn)行動物體內(nèi)藥代動力學(xué)的研究，也可通過活體動物核素顯像直接觀察Gd-DTPA的代謝和排泄。本實(shí)驗(yàn)顯示DTPA作為一個雙功能螯合劑可以同時鏈接99Tcm和Gd，對于一些新型具有臟器特異性的Gd-DTPA類順磁顯像劑，或許可以通過這種標(biāo)記方法進(jìn)行藥代動力學(xué)的研究。

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