中期因子在下咽癌組織中的表達(dá)及其臨床意義*

劉 勛

(青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院 266003)

下咽癌是耳鼻咽喉科惡性程度較高的惡性腫瘤，國內(nèi)統(tǒng)計占全身惡性腫瘤的0.15%～0.24%，占頭頸部惡性腫瘤的2%；國外統(tǒng)計數(shù)字顯示其年發(fā)病率為0.8/10萬，占頭頸部腫瘤的5%，占全身腫瘤的0.3%。絕大多數(shù)(95%)的下咽癌為鱗狀細(xì)胞癌，有較強(qiáng)的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率高，就診時約有50%～60%的患者頸部淋巴結(jié)腫大，在臨床上下咽癌預(yù)后依靠許多因素判斷，其中最為重要的是有無發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，下咽癌的浸潤和轉(zhuǎn)移是制約進(jìn)一步提高治愈率的重要原因。為了提高治愈率，幫助臨床醫(yī)生更加準(zhǔn)確地判斷預(yù)后，以便進(jìn)行合理的個體化的綜合治療，因此有必要尋找下咽癌的分子生物學(xué)指標(biāo)。中期因子(MK)是近年來發(fā)現(xiàn)的一個新的生長因子，在調(diào)控腫瘤血管生成過程中起重要作用，與血管生成密切相關(guān)[1]。本研究擬通過免疫組織化學(xué)二步法研究MK在下咽部腫瘤中的表達(dá)及其與腫瘤各臨床病理因素之間的關(guān)系，探討MK成為控制腫瘤生長及轉(zhuǎn)移的一個新的理想靶點(diǎn)的可能性。

1 材料與方法

1.1臨床資料 選擇泰安市中心醫(yī)院2004年10月～2009年7月手術(shù)切除后經(jīng)病理檢查診斷明確為下咽癌的存檔蠟塊。所有患者在術(shù)前均未行放療、化療、激素治療或免疫治療。其中男41例、女6例，年齡38～76歲，平均(56.75±9.90)歲。組織學(xué)類型：高分化17例、中分化12例、低分化18例，按UICC1997國際TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：T1+T2期22例、T3+T4期25例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移20例。所有患者均無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，對照組為下咽癌切緣組織15例。

1.2方法 采用免疫組化染色SP法,每例蠟塊連續(xù)切4 μm切片2張。1張作蘇木精-伊紅染色供對照觀察,另一張作MK抗體染色。鼠抗人MK多克隆抗體購自武漢博士德公司。染色方法按照SP-9000通用型試劑盒說明書進(jìn)行。SP法免疫組織染色流程均設(shè)對照作為質(zhì)量控制:以預(yù)實(shí)驗(yàn)陽性切片為陽性對照,用0. 01 mol/L pH值為7.4的PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3免疫組化結(jié)果判定 MK顯微鏡下觀察:以細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)清晰棕黃色顆粒作為陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)，否則為陰性。結(jié)果以陽性細(xì)胞數(shù)所占百分比表示，即光鏡(100×)下隨機(jī)選取10個視野，每個視野計數(shù)100個細(xì)胞，陽性細(xì)胞數(shù)≤5%為弱陽性，5%～15%為中等陽性，≥15%為強(qiáng)陽性，如無表達(dá)為陰性。

1.4統(tǒng)計分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料的比較分析采用χ2之檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1MK在下咽癌與正常癌旁組織粘膜中的表達(dá) 47例下咽鱗狀細(xì)胞癌中，MK表達(dá)陽性者為32例，陽性表達(dá)率為68.1%，正常癌旁組織中MK表達(dá)陽性為1例，陽性表達(dá)率為6.7%，兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，見表1。癌組織中MK主要表達(dá)于癌細(xì)胞中的胞漿和胞膜，呈棕黃色，細(xì)胞核無染色，染色在癌組織內(nèi)呈彌漫性分布，見圖1。

表1 MK在下咽癌組織與癌旁組織中的表達(dá)

圖1 MK在下咽癌細(xì)胞組織中的表達(dá)(SP×400)

2.2MK表達(dá)與下咽癌臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系 MK在不同病理分化程度的下咽癌患者中的表達(dá)無顯著性差異，臨床T1﹢T2期的MK蛋白的表達(dá)陽性率為45.5%，T3﹢T4期的MK蛋白的表達(dá)陽性率為88%，兩組差異存在顯著性差異，27例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的MK陽性表達(dá)率為(85.19%)，明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(45%)，差異有顯著性見表2。

表2 MK表達(dá)與下咽癌臨床病理學(xué)參數(shù)的關(guān)系

3 討 論

1988年，Muramatasu等運(yùn)用差異雜交的方法從視黃酸誘導(dǎo)的小鼠胚胎腫瘤細(xì)胞系HM1細(xì)胞cDNA文庫中篩選出一種新的基因，該基因在小鼠妊娠中期廣泛表達(dá)，出生后，只在腎臟有表達(dá)。因此，人們將這一新基因產(chǎn)物命名為Midkine，是妊娠中期(midgestation)和腎臟(kiney)的縮寫。MK最初被描述為胎兒與新生兒發(fā)育過程中的調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)譜在發(fā)育過程中高度上調(diào)，表達(dá)高峰出現(xiàn)在胚胎發(fā)生的中期，而成年后僅在腎臟中表達(dá)。其他正常組織幾乎測不出mRNA表達(dá)，目前MK的4種生物學(xué)功能己被證實(shí)：(1)促進(jìn)胚胎腦神經(jīng)元的軸突向外生長；(2)增加主動脈內(nèi)皮細(xì)胞的血漿酶原活性；(3)使NH3T3細(xì)胞癌性轉(zhuǎn)化；(4)在纖維母細(xì)胞系中促進(jìn)血管生長和有絲分裂作用。

有研究表明，MK在調(diào)控腫瘤血管生成過程中起重要作用，與血管生成密切相關(guān)。Muramaki等[2]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染MK基因的膀胱癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤能力強(qiáng)于對照組，組織病理學(xué)證實(shí)這種腫瘤生長速度加快與微血管密度增高有關(guān)。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MK除在卵巢癌細(xì)胞表達(dá)外，在卵巢上皮性癌細(xì)胞的間質(zhì)中血管內(nèi)皮細(xì)胞也呈弱陽性染色，在血管密集處尤其增強(qiáng)，提示MK可能具有刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤間質(zhì)血管形成的作用[3]。MK高度表達(dá)于Wilms瘤、腎細(xì)胞癌、肺癌、神經(jīng)纖維瘤和胃癌來源的細(xì)胞株。后來，一些實(shí)驗(yàn)室綜合研究了MK基因在人類腫瘤中的表達(dá)，采用Northern印跡或RT-PCR研究了MK基因在Wilms瘤、神經(jīng)纖維瘤、肝癌及來自肺、結(jié)腸、胰腺癌和腎的異種移植腫瘤中的表達(dá)譜。研究發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)標(biāo)本中，MK轉(zhuǎn)錄水平明顯高于正常對照組織。在大多數(shù)乳腺癌組織中也發(fā)現(xiàn)有MK表達(dá)，但在非腫瘤組織中未見表達(dá)。MK在神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤如腦膠質(zhì)瘤中也有表達(dá)，且高表達(dá)患者預(yù)后通常較差。雖然MK陽性表達(dá)率報道不一，但幾乎所有人類實(shí)體惡性腫瘤均有MK表達(dá)。而且免疫組化及原位雜交分析發(fā)現(xiàn)MK轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物主要位于細(xì)胞質(zhì)，而細(xì)胞核無陽性染色，且MK強(qiáng)陽性染色的癌細(xì)胞多位于浸潤的前緣地帶。羅祥基等[4]應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色、Western印跡等方法檢測，在正常肝組織及良性肝病變組織中，MK無表達(dá)；而在人肝細(xì)胞癌組織中，MK高表達(dá)；在癌旁肝硬化組織中，MK微量表達(dá)。Ying-Jia Ren等[5]的研究也發(fā)現(xiàn)，MK在食管鱗狀細(xì)胞癌中過度表達(dá)，且在腫瘤血管形成和侵襲中起重要作用。MK表達(dá)情況不一樣，微血管密度值也不一樣，且在腫瘤細(xì)胞浸潤前緣MK蛋白的表達(dá)較其他部位更明顯，微血管密度也高，血管生成活躍，表明MK蛋白與血管生成部位的一致性，這提示MK可能是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中血管生成重要的誘導(dǎo)因素。因此，通過阻斷MK的產(chǎn)生或拮抗其功能，可以達(dá)到抑制腫瘤血管生成，限制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的目的。Mashour等[6]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MK在腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)，而在正常血管內(nèi)皮細(xì)胞不表達(dá)。轉(zhuǎn)染MK基因的膀胱癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤能力強(qiáng)于對照組，組織病理學(xué)證實(shí)這種腫瘤生長速度加快與微血管密度增高有關(guān)[7]。MK在腫瘤演進(jìn)中的變化顯示其在癌變早期發(fā)揮著生物學(xué)功能，有可能用于腫瘤預(yù)后的判斷。

我們系統(tǒng)地觀察了從下咽癌切緣組織到不同分期的下咽癌組織中MK的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)是不斷增加的，提示其可能參加了下咽癌的惡性轉(zhuǎn)化過程。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的MK陽性率表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的，說明MK參與了下咽癌的浸潤和轉(zhuǎn)移。本組研究還發(fā)現(xiàn)MK的表達(dá)與腫瘤的分化程度無關(guān)，高分化和中低分化相比差異無顯著性。研究同時還發(fā)現(xiàn)MK表達(dá)與腫瘤浸潤深度有關(guān)，隨著浸潤深度的增加，表達(dá)逐漸增強(qiáng)，說明MK在下咽癌中可促進(jìn)腫瘤的侵襲。已知腫瘤血管生成是啟動腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的最早步驟之一，我們認(rèn)為MK促進(jìn)腫瘤的侵襲可能與MK能促進(jìn)腫瘤的血管生成有關(guān)，因?yàn)槲覀冊谙卵拾┘?xì)胞間質(zhì)中發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞和彈力膜有MK的表達(dá)，提示MK可能具有促進(jìn)癌間質(zhì)血管生成的作用，因而MK有可能是判斷下咽癌預(yù)后的一個參考指標(biāo)。在臨床上我們還可以把MK作為下咽癌治療的分子靶點(diǎn)，通過阻斷或拮抗其功能達(dá)到抑制腫瘤血管生成的目的，為下咽癌提供一個新的治療方向。

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[7] Muramaki M, Miyake H, Hara I, et al. Introduction of midkine gene into human bladder cancer cells enhances their malignant phenotype but increases theirsensitivity to antiangiogenic therapy[J].Clin Cancer Res, 2003, 9(14):5152-60.