HPLC法測定徐長卿中丹皮酚的含量*

李 珂 齊永秀 李玉琴 劉彩紅 賈寶秀

(泰山醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東 泰安 271016)

徐長卿(PycnostelmaPaniculatum(Bunge)K.Schum)為蘿摩科多年生草本植物，以干燥根及根莖或全草入藥，性溫，味辛，有行氣止痛、祛風(fēng)濕、止痹痛的功效，可治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、蕁麻疹、濕疹、牛皮癬、跌打損傷、寒氣腹痛、中暑等疾病[1]。本品含有丹皮酚、黃酮、氨基酸、多糖類、揮發(fā)油及少量生物堿等化學(xué)成分。丹皮酚為其主要有效成分，具有鎮(zhèn)痛、解熱、抗過敏、抗炎、抑菌、增強(qiáng)免疫功能等藥理活性[2-3]。為檢測和評價(jià)徐長卿藥材質(zhì)量，本研究建立了測定丹皮酚含量的高效液相色譜法，具有簡便、快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司)，Agilent G1314A VWD 檢測器，安捷倫化學(xué)工作站 B.01.01C SR1；KQ-500E型醫(yī)用超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，AP-01P型真空泵(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)，GR-202型電子分析天平(AND Company)。

1.2藥品與試劑

徐長卿為山東產(chǎn)中藥材，經(jīng)鑒定為蘿摩科植物徐長卿的干燥根和根莖；丹皮酚對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號110708-200505)；甲醇為色譜純；水為重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1對照品與供試品溶液制備

2.1.1丹皮酚對照品溶液制備 精密稱取丹皮酚對照品10.0 mg，置100 ml容量瓶中，加適量甲醇溶解并定容，搖勻，得質(zhì)量濃度為100 μg·ml-1丹皮酚對照品儲備液。精密量取丹皮酚對照品儲備液0.25、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 ml，分別置25 ml容量瓶中，用流動相稀釋并定容，搖勻，得質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0μg·ml-1丹皮酚對照品溶液。

2.1.2徐長卿供試品溶液制備

2.1.2.1提取時(shí)間考察 通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，分別考察了徐長卿超聲提取10 min、20 min、30 min、40 min、50 min的丹皮酚含量。結(jié)果超聲提取20 min后，提取液中丹皮酚含量不再明顯增加，故供試品溶液制備的提取時(shí)間確定為20 min。

2.1.2.2供試品溶液制備 精密稱取徐長卿粗粉約0.5 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 ml，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率33 kHz)20 min，放至室溫，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足損失的重量，搖勻，濾過。精密量取續(xù)濾液1.0 ml，置50 ml容量瓶中，用流動相稀釋并定容，搖勻，即得。

2.2色譜條件選擇

2.2.1測定波長的選擇 取4.0 μg·ml-1丹皮酚對照品溶液，以甲醇為空白對照，在200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描。結(jié)果在274 nm和313 nm處有最大吸收，其中274 nm處靈敏度高，空白無干擾，故選擇274 nm為檢測波長。

2.2.2流動相的選擇 文獻(xiàn)方法[4]以甲醇-水(70︰30)為流動相，結(jié)果丹皮酚色譜峰對稱性欠佳。本實(shí)驗(yàn)對流動相中甲醇與水的比例進(jìn)行了考察比較，分別考察了甲醇比例為45%、50%、55%、60%、65%和70%時(shí)丹皮酚色譜峰的分離度、峰形及保留時(shí)間。結(jié)果顯示甲醇-水的比例為50︰50時(shí)，丹皮酚色譜峰分離完全、保留時(shí)間短、峰形對稱。

2.2.3色譜條件 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定：色譜柱為ZORBAX SB-C18柱(4.6150 mm，5 μm)，美國安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；流動相為甲醇-水(50︰50)，流速為1 ml·min-1；檢測波長為274 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量20 μl。

2.2.4系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 取上述丹皮酚對照品溶液和徐長卿供試品溶液，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖(見圖1)。結(jié)果對照品和供試品中的丹皮酚色譜峰分離完全，峰型對稱，無拖尾現(xiàn)象，保留時(shí)間為8.99 min。由對照品和供試品的丹皮酚色譜峰計(jì)算，理論板數(shù)分別為11103和9463。

圖1 丹皮酚對照品(A)、徐長卿供試品(B)與溶媒(C)的HPLC色譜圖

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及線性關(guān)系考察

取上述質(zhì)量濃度分別為1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0 μg·ml-1丹皮酚對照品溶液各20 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以丹皮酚濃度(C)為橫坐標(biāo)，丹皮酚色譜峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果丹皮酚濃度在1.0～16.0 μg·ml-1范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，經(jīng)直線回歸得回歸方程為A=65.1808C + 5.1816(γ=0.9997，n=6)。

2.4精密度實(shí)驗(yàn)

取濃度4.0 μg·ml-1丹皮酚對照品溶液20 μl，在上述色譜條件下進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣6次，測定其峰面積。結(jié)果色譜峰面積平均值為545.90，RSD=2.06%(n=6)。

2.5供試品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取常溫下放置的徐長卿供試品溶液20 μl，按上述色譜條件分別在0、1、2、3、4、5 h進(jìn)樣，測定丹皮酚峰面積。結(jié)果峰面積平均值為1138.54，RSD=0.89%(n=6)，表明供試品溶液在常溫下放置5 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱取同一批號徐長卿供試品6份，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果丹皮酚含量平均值為1.89%，RSD=2.33%(n=6)。

2.7加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取已知丹皮酚含量的徐長卿樣品9份，分為3組，每組3份。3組樣品分別準(zhǔn)確加入高、中、低三種不同已知含量的丹皮酚對照品溶液，按照“2.1.2”項(xiàng)下方法制成供試品溶液。取供試品溶液20μl進(jìn)樣，每一樣品重復(fù)3次，測定丹皮酚含量，并計(jì)算回收率。結(jié)果平均回收率為98.15%，RSD<1.56%，見表1。

2.8樣品含量測定

取徐長卿粉末3份,按“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備溶液,分別取20 μl進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣3次，測定丹皮酚色譜峰面積。由標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算供試品中丹皮酚的含量。結(jié)果見表2。

表1 丹皮酚的加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 徐長卿中丹皮酚的含量測定結(jié)果

3 討 論

丹皮酚為常用中藥徐長卿的主要有效成分，其含量高低對藥材質(zhì)量和藥品療效具有重要影響[4]。丹皮酚具有熔點(diǎn)低(49.5～50 ℃)、易揮發(fā)的理化特性，可使藥材在儲存過程中致有效成分丟失。建立簡便準(zhǔn)確的丹皮酚含量測定方法，對評價(jià)徐長卿藥材及其制劑的質(zhì)量，保障藥物臨床療效具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)建立了測定徐長卿中丹皮酚含量的高效液相色譜法，具有簡便快速、靈敏專一、結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，適用于徐長卿藥材質(zhì)量控制，也可用于徐長卿制劑及其復(fù)方制劑中丹皮酚含量測定或藥品質(zhì)量控制。

[1] 武毅,劉剛,溫海濱.徐長卿臨床應(yīng)用進(jìn)展[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006,18(5)：79-80.

[2] 鞏麗萍，王少云. 徐長卿及丹皮酚的研究進(jìn)展[J]. 食品與藥品，2005，7(6A)：14-17.

[3] 郭婕，孫秀梅，張兆旺. 徐長卿的現(xiàn)代化學(xué)藥理研究與臨床應(yīng)用近況[J]. 黑龍江中醫(yī)藥，2004，(1)：44-46.

[4] 付秀娟，朱大勝，潘書洋. 高效液相色譜法測定復(fù)腎寧膠囊中丹皮酚的含量[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2007，27(10)：1461-1462.