P33ING1、p53基因在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)及其意義

楊承綱 胡早秀 陳 蕓

膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，其中90% 以上是膀胱移行細(xì)胞癌(bladder transitional cell carcinoma，BTCC)。Garkavtsev等[1]采用在消減cDNA雜交(substractive hybridization)的基礎(chǔ)上，結(jié)合GSE(genetic suppressor element)方法，克隆出1個(gè)新基因命名為inhibitor of growth 1(ING1)，ING1基因的主要蛋白翻譯產(chǎn)物為P33ING1 蛋白。近年研究資料表明ING1是1個(gè)腫瘤抑制基因，參與細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、衰老、凋亡； P33ING1蛋白常被人們稱為p53基因的“分子伴侶”，其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用是通過提高p53依賴的P21/waf1的功能，使細(xì)胞周期阻滯在G1期來(lái)發(fā)揮作用。本實(shí)驗(yàn)采用鏈霉素抗生物蛋白-過氧化酶免疫組化染色(SP)法，檢測(cè)P33ING1與p53基因在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)，并探討P33ING1、p53基因的相關(guān)關(guān)系及其表達(dá)在膀胱移行細(xì)胞癌中的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

收集云南省腫瘤醫(yī)院病理科2000年～2007年收治的83例膀胱移行細(xì)胞癌及11例正常膀胱黏膜組織，83例BTCC中，男性63例，女性20例，年齡35～84歲，平均年齡59.5歲。行病理檢查前均未接受過放療和化療，術(shù)后均行化療藥物膀胱灌注治療。按WHO病理組織學(xué)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，G129例，G231例，G323例；Tis～T1期(淺表性腫瘤)51例，T2～T4期(浸潤(rùn)性腫瘤)32例。所有標(biāo)本均經(jīng)10%福爾馬林液固定、石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。術(shù)后隨訪16個(gè)月～5年，平均38個(gè)月，失訪5例，腫瘤復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移56例，死亡2例，無(wú)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移20例。

1.2 方法

羊抗人P33ING1 單克隆抗體為Santa Cruz Biotechnology公司產(chǎn)品，抗體稀釋度為1∶50，p53單抗、SP染色試劑盒、DAB顯色劑、抗體稀釋液購(gòu)自福州邁新公司。采用S-P法進(jìn)性免疫組化染色，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。用已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

結(jié)果判定： p53以細(xì)胞核染色呈棕黃色顆粒為陽(yáng)性；P33ING1大部分陽(yáng)性定位于細(xì)胞核，少部分陽(yáng)性定位于細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性染色呈棕黃色顆粒。結(jié)果判定參照文獻(xiàn)報(bào)道[2]，每例在光鏡下(400 ×)計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞中陽(yáng)性細(xì)胞百分比。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥10%為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

83例膀胱移行細(xì)胞癌中，42例(50.6%)p53表達(dá)陽(yáng)性，49例(59.03%) P33ING1表達(dá)陽(yáng)性。

P33ING1蛋白表達(dá)水平膀胱移行細(xì)胞癌 G1、G2與G3比較有顯著性差異(P<0.05)，G1與G2比較其表達(dá)無(wú)顯著性差異(P>0.05)；p53蛋白表達(dá)膀胱移行細(xì)胞癌G1與G2、G3比較有顯著性差異(P<0.05)，G2與G3比較其表達(dá)無(wú)顯著性差異(P>0.05)。P33ING1及p53蛋白表達(dá)Tis～T1與T2～T4比較有顯著性差異(P<0.05)。隨訪5年發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)死亡組p53蛋白表達(dá)率顯著高于無(wú)復(fù)發(fā)組；復(fù)發(fā)死亡組P33ING1蛋白表達(dá)率顯著低于無(wú)復(fù)發(fā)組。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，P33ING1蛋白表達(dá)與膀胱移行細(xì)胞癌病理分級(jí)及臨床分期呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(γ=-0.263，P=0.016；γ=-0.388，P=0.001)；p53蛋白表達(dá)與其病理分級(jí)及臨床分期呈正相關(guān)關(guān)系(γ=0.492，P=0.001；γ=0.341，P=0.002)； P33ING1 蛋白表達(dá)與p53表達(dá)呈顯著正相關(guān)關(guān)系(γ=0.352，P=0.008 )，見表1。

3 討論

ING1 基因是1種重要的抑癌基因，定位于人類染色體13q33-34，由外顯子1a和外顯子2轉(zhuǎn)錄翻譯出的P33ING1蛋白是ING1基因的主要蛋白翻譯產(chǎn)物 。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，P33ING1表達(dá)降低可使細(xì)胞生長(zhǎng)加快，而過表達(dá)可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，對(duì)細(xì)胞周期起負(fù)調(diào)控作用[3]。其與p53有相互依賴作用，參與p53介導(dǎo)的多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控活動(dòng)，能抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及促進(jìn)損傷修復(fù)。其低表達(dá)則可刺激克隆形成，促使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[4]。Helbing等[5]通過無(wú)血清培養(yǎng)的細(xì)胞死亡敏感試驗(yàn)，證實(shí)P33ING1 有促細(xì)胞凋亡的作用。Oki等[6]證實(shí)P33ING1 與p53基因是相互協(xié)同、相互依賴的方式，通過激活p21/WAF1的轉(zhuǎn)錄來(lái)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，兩者一起表達(dá)才能起抑制細(xì)胞增殖，認(rèn)為P33ING1 的異常表達(dá)阻止了p53促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而形成了腫瘤。同樣，p53不是單獨(dú)發(fā)揮抑癌作用，它需要P33ING1蛋白的協(xié)同作用，共同抑制腫瘤的發(fā)生。有研究報(bào)道P33ING1蛋白在人的頭頸部鱗癌、胃癌、結(jié)腸癌及乳腺癌中均有ING1基因表達(dá)下降[7]。本研究中發(fā)現(xiàn)，P33ING1表達(dá)在正常對(duì)照組中陽(yáng)性表達(dá)率為90.90% ，而在膀胱移行細(xì)胞癌中陽(yáng)性率為50.3%，表達(dá)強(qiáng)度明顯降低，差別顯著，與以上文獻(xiàn)報(bào)道的一致，表明P33ING1失表達(dá)在膀胱癌的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用。

表1 P33ING1、p53蛋白表達(dá)與膀胱移行細(xì)胞癌臨床病理及預(yù)后的關(guān)系(例，%)

Garkavtsev等[1]發(fā)現(xiàn)人成纖維細(xì)胞株中，減弱P33ING1 的表達(dá)能抑制p53調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)的功能，P33ING1 是p53蛋白發(fā)揮正常功能所必需的。單獨(dú)p53基因或P33ING1 基因?qū)е碌募?xì)胞凋亡及G0/G1期阻滯要弱于兩基因同時(shí)發(fā)揮功能時(shí)的狀態(tài)。祝峙等[8]采用脂質(zhì)體方法，將P33ING1與wtp53基因分別轉(zhuǎn)染人HepG2、PLC/PRF/5和HeP3B三株內(nèi)源性p53基因表達(dá)狀態(tài)各不相同的肝癌細(xì)胞株，以探討P33ING1與p53基因間的協(xié)同功能對(duì)肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)、阻滯細(xì)胞周期、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在表達(dá)內(nèi)源性wtp53的HepG2細(xì)胞中導(dǎo)入外源性P33ING1基因，使P33ING1 蛋白在HepG2細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)，Western印跡結(jié)果顯示在HepG2細(xì)胞內(nèi)，隨著P33ING1 蛋白表達(dá)量升高，p53蛋白表達(dá)也增強(qiáng)。過表達(dá)P33ING1 使HepG2細(xì)胞凋亡率上升，G0/G1期細(xì)胞阻滯增多。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為P33ING1 蛋白表達(dá)與p53表達(dá)呈現(xiàn)較明顯的正相關(guān)關(guān)系，與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[9]。這提示，P33ING1與wtp53蛋白在核內(nèi)的表達(dá)緊密相關(guān)，兩者要同時(shí)存在才能發(fā)揮正常功能，當(dāng)它們其中的1個(gè)失活，另1個(gè)就不能單獨(dú)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，這也進(jìn)一步證實(shí)P33ING1與 p53基因的“分子伴侶”關(guān)系。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明P33ING1蛋白表達(dá)膀胱移行細(xì)胞癌 G1、G2與G3比較差異有顯著性，G1與G2比較差異無(wú)顯著性；p53蛋白表達(dá)在膀胱移行細(xì)胞癌G1與G2、G3比較有顯著性差異，G2與G3比較無(wú)顯著性差異。P33ING1及 p53蛋白表達(dá)Tis～T1與T2～T4比較有顯著性差異。隨訪5年p53蛋白表達(dá)率復(fù)發(fā)死亡組顯著高于無(wú)復(fù)發(fā)組；P33ING1蛋白表達(dá)率復(fù)發(fā)死亡組顯著低于無(wú)復(fù)發(fā)組。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，P33ING蛋白表達(dá)與膀胱移行細(xì)胞癌病理分級(jí)及臨床分期呈負(fù)相關(guān)；p53蛋白表達(dá)與其病理分級(jí)及臨床分期呈正相關(guān)。提示在膀胱癌中p53高表達(dá)P33ING低表達(dá)者的預(yù)后較差。鑒于野生型p53與P33ING1有相互協(xié)同及依賴關(guān)系，所以在腫瘤的形成、發(fā)展、早期診斷及基因介導(dǎo)治療方面，檢測(cè)p53的狀態(tài)和P33ING1水平的變化情況可能有重要的意義。同時(shí)檢測(cè)p53的狀態(tài)和P33ING1表達(dá)水平，對(duì)膀胱癌的診斷、治療和預(yù)后判斷可能具有積極意義。

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