補腎活血通竅中藥復(fù)方對慶大霉素耳中毒小鼠耳蝸NT-3表達(dá)的影響*

李群真 宋永玲 徐琳 朱光潔 高下

近年來對神經(jīng)營養(yǎng)因子-3(neurotrophic factor 3,NT-3)的研究已經(jīng)廣泛開展,其在某些方面的作用如對螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、毛細(xì)胞損傷后的修復(fù)優(yōu)于其它的神經(jīng)生長因子[1～4]，對強噪聲或氨基糖苷類抗生素所致的毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞損傷有明顯的保護(hù)作用[5～7]。中醫(yī)臨床上多采用補腎益氣活血通竅法治療感音神經(jīng)性聾,近年來其療效有一定提高[8]，動物實驗亦證實中藥復(fù)方對耳蝸毛細(xì)胞、聽覺神經(jīng)元和聽神經(jīng)纖維有很好的保護(hù)作用[9]，徐紹勤等[10]研究發(fā)現(xiàn)復(fù)聰片具有減緩老年大鼠耳蝸疆孔內(nèi)神經(jīng)纖維退變的作用。從目前研究來看，神經(jīng)營養(yǎng)因子中NT-3維持螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活的作用最顯著，從而推斷復(fù)聰片對耳蝸的作用可能與其提高受損耳蝸NT-3的水平有關(guān)。本研究旨通過觀察補腎活血通竅中藥復(fù)方對小鼠GM耳中毒后耳蝸中NT-3表達(dá)的影響，探討補腎活血通竅中藥復(fù)方治療感音神經(jīng)聾的可能作用途徑。

1 材料與方法

1.1實驗藥物及主要試劑 自擬補腎活血通竅方(處方組成:熟地15 g，骨碎補10 g，淫羊藿10 g，黃芪15 g，當(dāng)歸10 g，丹參15 g，川芎10 g，石菖蒲10 g，水蛭1 g,磁石20 g等)，由南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院中藥制劑室煎制成高、中、低三種濃度的湯劑，中濃度湯劑(含生藥量0.475 g/ml)相當(dāng)于70 kg成人臨床1日常規(guī)量的等效量(根據(jù)《實驗動物和動物實驗技術(shù)》人與動物用藥量體表面積換算法[11])，高濃度湯劑(含生藥量2.375g/ml)相當(dāng)于中濃度湯劑給藥量的5倍劑量，低濃度湯劑(含生藥量0.095g/ml)相當(dāng)于中濃度湯劑給藥量的0.2倍劑量；硫酸慶大霉素(天津藥業(yè)集團(tuán)新鄭股份有限公司，批號:0712303，規(guī)格2 ml:80 mg)；鹽酸氯胺酮注射液(上海第一生化藥業(yè)有限公司，批號:KH080403，規(guī)格2 ml:0.1 g)；NT-3兔抗鼠一級抗體(購自Santa Cruz試劑公司)；細(xì)胞及組織總蛋白抽提試劑盒、辣根過氧化物酶結(jié)合的二級抗體、 BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒、KCTM化學(xué)發(fā)光試劑盒(購自上?？党缮锕こ坦?。

1.2實驗動物及分組 選用南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院動物實驗中心提供的健康昆明小鼠40只,雄性,體重18±2克,耳廓反射靈敏,耳鏡檢查正常。將小鼠隨機(jī)分為5組，每組8只16耳。A、B、C、D 4組在GM腹腔注射同時分別用高、中、低濃度中藥及生理鹽水干預(yù)，E組為空白對照組。

1.3給藥方法 E組不作任何處理,每日正常進(jìn)水、進(jìn)食,不灌胃；其余4組每天腹腔注射GM，100 mg/kg，連續(xù)15天， A、B、C組從腹腔注射GM的第1天開始,同時分別給予高、中、低濃度的補腎活血通竅復(fù)方湯劑灌胃，0.8毫升/只 ，每天一次，D組則給等量生理鹽水，共20天。

1.4聽性腦干反應(yīng)(ABR)檢測 于灌胃結(jié)束后各組動物進(jìn)行ABR測試(美國GSI公司VIASYS腦干誘發(fā)電位儀)。測試于隔聲屏蔽室內(nèi)進(jìn)行，小鼠以氯胺酮腹腔注射麻醉,記錄電極放置于頭顱兩耳廓連線的中點處顱骨中,參考電極扎入同側(cè)耳垂下方皮內(nèi),地線放置在眉心部。刺激聲為疏密相交替的13次/秒的短聲(click),疊加512次,掃描時程10 ms,帶通濾波50～3 000 Hz,從80 dB SPL開始,5 dB為一檔逐級下降進(jìn)行測試，記錄ABR波Ⅲ反應(yīng)閾。

1.5NT-3蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測 測試ABR后,小鼠行氯胺酮腹腔注射(3 ml/kg)麻醉后固定，開胸，4℃生理鹽水心臟灌注，至流出液體澄清停止灌注(約3～5 min)；解剖聽泡，將耳蝸及前庭取出切除前庭組織后放入液氮中保存。細(xì)胞及組織總蛋白抽提試劑盒提取耳蝸組織蛋白，耳蝸組織稱重，放入管中，用勻漿器每30 s低速勻漿，每次勻漿間隔冰浴1 min，至組織完全裂解；裂解液于預(yù)冷的離心機(jī)中14 000 rpm離心15 min,取上清液, 2:1加3×上樣緩沖液(即取2單位上清液，加1單位3×上樣緩沖液，至上樣緩沖液終濃度為1×)，100℃沸水浴變性3 min；BCA試劑盒測蛋白濃度；上樣，使用美國伯樂公司BioRad電泳裝置，樣品首先在80 V恒定電壓下電泳至染料接近分離膠頂端，然后120 V恒定電壓電泳至溴酚藍(lán)剛出膠底部， 4℃下200 mA恒流2 h轉(zhuǎn)膜；膜在5% BSA溶液中室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過夜(稀釋比例1:3 000)，TBST洗膜3×5 min，二抗室溫孵育1 h(稀釋比例1:10 000)，TBST洗膜3×5 min；暗室中將膜置于反應(yīng)液中室溫孵育3 min，以X光膠片曝光。圖片掃描保存為電腦文件，并用Image J分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值數(shù)字化。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件,采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計。

2 結(jié)果

2.1ABR反應(yīng)閾及耳蝸內(nèi)NT-3蛋白含量 與E組比較,C、D組ABR波Ⅲ反應(yīng)閾顯著升高(P<0.01)，NT-3蛋白含量下降(P<0.01)，A、B組ABR波Ⅲ反應(yīng)閾及NT-3蛋白含量與E組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；與C、D組比較, A、B組ABR波Ⅲ閾值顯著降低(P<0.01)，B組NT-3蛋白含量增加(P<0.01)；與D組比較，A組蛋白含量增加(P<0.05)(表1)。

表1 各組ABR反應(yīng)閾及耳蝸內(nèi)NT-3蛋白含量(n=16耳)

注: *與E組比較,P<0.01；#與C、D組比較,P<0.01；##與D組比較,P<0.05；△與B組比較，P<0.05

2.2各組NT-3 Western Blot蛋白條帶圖(圖1)

圖1各組小鼠耳蝸內(nèi)NT-3及其GAPDH蛋白條帶(A，高濃度中藥組；B，中濃度中藥組；C，低濃度中藥組；D，生理鹽水組；E，空白對照組)

3 討論

Mitsuru等[12]用組織化學(xué)顯影技術(shù)觀察到NT-3在剛出生小鼠耳蝸、前庭的支持細(xì)胞及毛細(xì)胞內(nèi)均有廣泛的強表達(dá)，且從蝸頂至基底部逐漸減少，這種表達(dá)梯度一直持續(xù)到成年鼠，隨著年齡增長，NT-3僅在內(nèi)毛細(xì)胞呈現(xiàn)高表達(dá)，其次是支持細(xì)胞，在其他細(xì)胞則消失。因此推斷成年后毛細(xì)胞和支持細(xì)胞可能是耳蝸內(nèi)NT-3主要來源細(xì)胞，聽覺毛細(xì)胞的損傷可以引起繼發(fā)性聽覺神經(jīng)元的退化[13，14]，其中毛細(xì)胞分泌NT-3減少是一個重要原因，因此,聽覺毛細(xì)胞丟失后及時補充神經(jīng)營養(yǎng)因子,對維持螺旋神經(jīng)節(jié)存活具有潛在的應(yīng)用價值。已有將NT-3直接通過圓窗膜注射和微滲透泵技術(shù)導(dǎo)入耳蝸以治療內(nèi)耳損傷的報道[15]，但由于NT-3注入內(nèi)耳屬于有創(chuàng)性操作，維持時間不長，局部作用迅速減弱，加之NT-3分子與其他蛋白因子是否有拮抗作用尚不明，故臨床實用性并不高。亦有學(xué)者將病毒載體攜帶的NT-3基因?qū)雰?nèi)耳組織[6,7],但是由于病毒表達(dá)的不確定性和實驗難度很大,所以還不能廣泛用于臨床和研究。有作者報道，經(jīng)腦脊液途徑基因轉(zhuǎn)染構(gòu)建基因工程細(xì)胞，將目的基因經(jīng)腦脊液途徑轉(zhuǎn)運到耳蝸內(nèi)發(fā)揮作用[16]，但仍然是初步探討，無法形成定論。如果中藥復(fù)方或單味制劑能夠拮抗受損耳蝸內(nèi)NT-3含量的降低，不失為中藥治療感音神經(jīng)性聾一個好的證據(jù)或方法。

至今國內(nèi)外研究對藥物中毒性聾的機(jī)制尚未徹底闡明, GM耳毒性的致病機(jī)制主要有自由基學(xué)說、代謝抑制學(xué)說、膜結(jié)合學(xué)說、內(nèi)淋巴藥物積蓄學(xué)說、鈣離子紊亂學(xué)說等[17]。以上機(jī)制綜合作用可導(dǎo)致耳蝸毛細(xì)胞數(shù)量減少，其最終結(jié)果就是耳蝸內(nèi)NT-3含量減少，螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞受損而影響聽力。從中醫(yī)角度分析，藥物中毒性聾屬中醫(yī)耳聾范疇，中醫(yī)辨證屬腎虛血瘀之證，腎虛為本，血瘀為標(biāo)。耳為腎竅,賴腎精氣血之濡潤，若藥毒致腎元虧虛,耳竅失養(yǎng),兼以濁邪內(nèi)犯,上干耳竅,竅絡(luò)閉阻,久而成瘀。故本病多虛瘀交織,纏綿難愈。治當(dāng)以補腎益精為本,兼以活血化瘀通竅治標(biāo)。據(jù)此組方的復(fù)聰片經(jīng)實驗證實可有效拮抗GM的耳毒性反應(yīng)[18]。方中以熟地、骨碎補、淫羊藿滋腎益精, 黃芪、當(dāng)歸益氣養(yǎng)血，兼用丹參、川芎活血化瘀通絡(luò), 配以菖蒲、水蛭行氣通竅，以磁石鎮(zhèn)納浮陽安神, 聰耳通竅。諸藥合用可使精氣調(diào)合, 腎氣充足, 髓海得濡,耳竅之氣行血活, 通竅開閉。

本實驗所應(yīng)用的復(fù)方中黃芪、淫羊藿、熟地、丹參、當(dāng)歸等均有清除自由基、阻止脂質(zhì)過氧化反應(yīng)作用,故可有效減輕和防止耳蝸組織由于自由基產(chǎn)生而導(dǎo)致的耳蝸組織過氧化損傷,保持細(xì)胞膜的完整性[19～22]；補腎藥物骨碎補、淫羊藿等可促進(jìn)ATP酶及琥珀酸脫氫酶合成,黃芪等補氣藥可提高ATP酶活性,丹參可提高琥珀酸脫氫酶活性[23],從而促進(jìn)毛細(xì)胞能量代謝；活血祛瘀藥如川芎可抑制磷酸二酯酶,使耳中cAMP分解減少,丹參可提高體內(nèi)cAMP水平[24,25]；黃芪、骨碎補、淫羊藿等可促進(jìn)細(xì)胞DNA以及蛋白質(zhì)的合成,從而保護(hù)耳蝸的結(jié)構(gòu)及功能；GM對血管紋的損害主要表現(xiàn)為缺血，水蛭可擴(kuò)張毛細(xì)血管,抑制血液凝固[26]；川芎、丹參可解除血管痙攣,降低血液粘滯度,增加微循環(huán)血流速度以及耳蝸血流量,保證了毛細(xì)胞的能量供應(yīng)[27]。以上雖是對單味中藥制劑或單一成分研究所得結(jié)論，但從本文結(jié)果看，高濃度及中濃度中藥干預(yù)組小鼠耳蝸內(nèi)NT-3蛋白含量明顯高于生理鹽水及低濃度中藥干預(yù)組，ABR反應(yīng)閾明顯低于生理鹽水組和低濃度中藥組，與正常對照組小鼠比較均無明顯差異。推測補腎活血通竅中藥復(fù)方能拮抗慶大霉素的耳毒性作用，可能通過以下幾個途徑： 通過清除自由基、促進(jìn)能量代謝、改善內(nèi)耳血液循環(huán)直接拮抗GM對毛細(xì)胞的損害，保存其正常分泌NT-3的功能； 復(fù)方中藥中一些成分可能能靶向性透過耳蝸血迷路屏障(blood labyrinth barrier,BLB)進(jìn)入耳蝸內(nèi)，調(diào)節(jié)神經(jīng)與內(nèi)分泌, 增強NT-3的自分泌和旁分泌功能，并促進(jìn)其與螺旋神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(spiral ganglion neurons,SGNs)表面受體結(jié)合，維持神經(jīng)細(xì)胞的正常傳遞功能。研究表明，在耳蝸生理或受損狀態(tài)時上下級聽神經(jīng)元均可以互為靶器官[28]，NT-3亦可能通過上級神經(jīng)元逆向傳輸至SGNs。中藥復(fù)方是從整體論治出發(fā)，重在整體調(diào)節(jié)，耳蝸內(nèi)NT-3含量增多可能只是對全身調(diào)節(jié)的一個局部表現(xiàn)，而NT-3是一種小分子蛋白(分子量:14 kd),可以透過耳蝸BLB及血腦屏障，其亦可能通過提高機(jī)體內(nèi)NT-3的整體水平，使之易經(jīng)血液循環(huán)或腦脊液途徑到達(dá)耳蝸內(nèi)。

由于目前的中藥藥理研究技術(shù)對中藥復(fù)方作用的成份尚未研究透徹，只能從宏觀上通過其對耳蝸內(nèi)神經(jīng)營養(yǎng)因子水平的影響推測中藥復(fù)方的作用途徑，因此，本研究為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制明確方向。

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