黃芩的花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂及核型分析

程志號(hào),蔡明歷,郝大翠,鄧瑞寧,劉 焰

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 藥用植物研究所,湖北武漢 430070)

黃芩 (Scutellaria baicalensisGeorgi)為唇形科黃芩屬多年生草本植物,以其根入藥,是我國(guó)常用大宗中藥材之一,應(yīng)用歷史悠久,歷代本草均有記載.黃芩具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎等功效[1],可用于治療發(fā)熱煩渴、肺熱咳嗽、瀉痢熱淋、濕熱黃疸、胎動(dòng)不安、癰腫瘡毒等癥,最近研究發(fā)現(xiàn)黃芩還具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、抗癌、調(diào)節(jié)免疫力和抑制艾滋病毒 H IV-RT的作用[2]。從本草考證來(lái)看,歷代用的黃芩至少有 4種原植物,而 2005年版《中國(guó)藥典》中收載 Scutellaria baicalensis Georgi為正品藥用黃芩。除黃芩外在我國(guó)尚有同屬 6種植物在不同地區(qū)以黃芩入藥,即粘毛黃芩 (S.viscidula Uge),甘肅黃芩 (S.rehderianaDiels.),滇黃芩 (S.emoenaC.H.Wright),川黃芩 (S.hypericifoliaLevl),麗江黃芩 (S.likiungensis Diels),大黃芩 (S.tenaxW.W.Smith var.patentipilosa[3]。這些黃芩屬植物都與黃芩有類似的藥效而在地方上作為正品黃芩的代用品,但其藥效和黃芩苷的含量都不如正品黃芩,因此,它們沒(méi)得到廣泛的應(yīng)用[4]。中藥的傳統(tǒng)鑒定方法因其簡(jiǎn)便直觀等優(yōu)點(diǎn),在藥用植物和中藥材的鑒別上有著廣泛的應(yīng)用,但準(zhǔn)確性較低。染色體作為植物遺傳物質(zhì)的載體,其數(shù)目和形態(tài)是植物體內(nèi)比較穩(wěn)定的重要特征,把染色體分類學(xué)的方法和技術(shù)應(yīng)用于藥用植物研究,可為藥用植物的鑒定提供比較可靠的客觀指標(biāo)。本研究通過(guò)對(duì)黃芩花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中染色體的行為、成熟花粉粒的育性進(jìn)行觀察以及對(duì)其體細(xì)胞染色體進(jìn)行核型分析,旨在為黃芩的良種選育、真?zhèn)纹返蔫b別、種質(zhì)資源遺傳多樣性研究及種質(zhì)資源分類提供細(xì)胞學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料是 2000年從河南省禹州引種,現(xiàn)種植于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本園內(nèi)。

1.2 制片方法

1.2.1 減數(shù)分裂觀察方法

取黃芩的幼小花蕾,用卡諾氏固定液 4℃下固定 24 h后,從花蕾中剝?nèi)』ㄋ?用 1 mol/L鹽酸60℃恒溫解離 5～6 min,用改良卡寶品紅染色壓片,在顯微鏡下觀察攝影[5]。

1.2.2 花粉粒育性鑒定方法

取成熟的黃芩花粉粒于載玻片上,用 1%醋酸洋紅染色 3 min后,在光學(xué)顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù),并照相。染色深,外形圓的計(jì)為可育花粉粒,不染色或染色淺的,外形皺癟的計(jì)為敗育花粉粒。一朵花至少統(tǒng)計(jì) 300個(gè)花粉粒,計(jì)算可育花粉粒百分率。

1.2.3 體細(xì)胞觀察方法

取黃芩種子置于 25℃培養(yǎng)箱中發(fā)芽,待根長(zhǎng)到0.5～1.0 cm時(shí),切取根尖置 0.002 mol/L 8-羥基喹啉中,在室溫下預(yù)處理 2.5 h后,用卡諾氏固定液4℃下固定 24 h,再用 1 mol/L鹽酸 60℃恒溫解離10 min,蒸餾水洗凈后切取根尖分生組織,用卡寶品紅染色壓片,在顯微鏡下觀察攝影。

1.2.4 核型分析方法

取 50個(gè)分散良好,著絲點(diǎn)清晰的中期分裂相進(jìn)行染色體計(jì)數(shù),并從中選擇染色體數(shù)目完整、無(wú)重疊的 5個(gè)分散較好的分裂相進(jìn)行顯微攝影。染色體相對(duì)長(zhǎng)度、臂比及核型按 Levan(1964)[6]命名系統(tǒng),染色體相對(duì)長(zhǎng)度系數(shù)按 Kuo(1972)[7]方法劃分,核型分類用 Stebbins(1971)[8]的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程觀察結(jié)果

黃芩的絕大多數(shù)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中染色體的行為正常,在前期 I的粗線期,一部分染色體上出現(xiàn)明顯的染色深的染色粒 (圖1-a)。終變期同源染色體配對(duì)后,可形成 9個(gè)高度濃縮、形態(tài)清晰的二價(jià)體 (圖1-b),佐證了黃芩的染色體數(shù)目為2n=2X=18,該時(shí)期是染色體計(jì)數(shù)的最佳時(shí)期。在中期 I,可觀察到 9個(gè)二價(jià)體排列到赤道面上形成赤道板,該時(shí)期也是染色體計(jì)數(shù)的好時(shí)期 (圖1-c),少數(shù)細(xì)胞有染色體落后的現(xiàn)象。后期 I,配對(duì)的同源染色體彼此分離,分別走向細(xì)胞的一極,此時(shí),在細(xì)胞兩極可見(jiàn)各有 9條染色體,該時(shí)期也是染色體計(jì)數(shù)的好時(shí)期 (圖1-d～e),此期觀察到少數(shù)細(xì)胞中出現(xiàn)染色體橋現(xiàn)象 (圖1-f)。在末期 I,染色體沒(méi)有出現(xiàn)明顯的解聚現(xiàn)象,在細(xì)胞兩極分別形成兩個(gè)新的子核,但細(xì)胞質(zhì)不分裂 (圖1-g)。前期 II,可見(jiàn)細(xì)胞兩極各有 9個(gè)“x”狀的染色體分散在細(xì)胞質(zhì)中 (圖1-h)。中期 II,2個(gè)子細(xì)胞中的染色體都排列到細(xì)胞的赤道面上,分別形成兩個(gè)相互平行或垂直的赤道板 (圖1-i～j),此期還觀察到少數(shù)細(xì)胞中出現(xiàn)落后的染色體 (圖1-k～l)。后期 II,每條染色體上的兩個(gè)姐妹染色單體分開(kāi),分別走向細(xì)胞一極,2個(gè)子核的分裂方向相互平行或相互垂直,此時(shí)在細(xì)胞內(nèi)可看到四組染色體 (圖1-m～o),此期觀察到少數(shù)細(xì)胞中出現(xiàn)落后染色體 (圖1-p)。末期 II,在細(xì)胞內(nèi)形成了 4個(gè)子核 (圖1-q),最后細(xì)胞質(zhì)分裂,同時(shí)形成 4個(gè)子細(xì)胞,即四分體 (圖1-r);末期Ⅱ可見(jiàn)少數(shù)細(xì)胞分裂不同步,四分體時(shí)期有少數(shù)形成三分體。說(shuō)明黃芩的減數(shù)分裂方式屬于同時(shí)型。

在觀察統(tǒng)計(jì)的 225個(gè)中期Ⅰ細(xì)胞中,有 6個(gè)細(xì)胞出現(xiàn)染色體落后的現(xiàn)象,異常頻率為 2.67%;在254個(gè)后期 I細(xì)胞中,有 17個(gè)細(xì)胞出現(xiàn)染色體橋,異常頻率為 6.69%;在 120個(gè)末期Ⅰ細(xì)胞中,有 6個(gè)細(xì)胞出現(xiàn)染色體落后的現(xiàn)象,異?，F(xiàn)象的頻率為2.50%;在 144個(gè)中期 II細(xì)胞中,有 18個(gè)細(xì)胞出現(xiàn)染色體橋,異常頻率為 12.50%;在 142個(gè)后期 II細(xì)胞,有 20個(gè)細(xì)胞出現(xiàn)染色體落后的現(xiàn)象,異?，F(xiàn)象的頻率為 14.08%;另外在末期Ⅱ有 3.95%的細(xì)胞分裂不同步,四分體時(shí)期有 3%的三分孢子存在 (表1)。

圖1 黃芩花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂

表1 減數(shù)分裂各時(shí)期染色體行為異常的花粉母細(xì)胞百分率

2.2 花粉粒育性觀察結(jié)果

隨機(jī)取樣,共觀察統(tǒng)計(jì)了 1327個(gè)成熟花粉粒的醋酸洋紅染色反應(yīng)結(jié)果,其中不被染色或染色淺的、外形皺癟的的花粉粒有 312個(gè),可育花粉粒為76.49%,花粉敗育率為 23.51%(圖2)。

2.3 體細(xì)胞核型分析結(jié)果

圖2 黃芩花粉粒醋酸洋紅染色反應(yīng)

從黃芩的大量細(xì)胞學(xué)制片中觀察了根尖 50個(gè)細(xì)胞的中期染色體,確定黃芩的體細(xì)胞染色體數(shù)目為 2n=18。根據(jù)其花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂終變期,同源染色體配對(duì)形成 9個(gè)二價(jià)體,可以確定黃芩為二倍體。未發(fā)現(xiàn)非整倍性變異和 B染色體,共測(cè)量了5個(gè)分散良好,著絲點(diǎn)清晰的中期細(xì)胞染色體,獲得相應(yīng)的 5個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)結(jié)果,計(jì)算平均值供核型分析 (表1)及核型模式圖分析 (圖3),同源染色體配對(duì)后的核型圖見(jiàn)圖2。結(jié)果表明:黃芩最長(zhǎng)染色體和最短染色體的比值為 1.989,臂比大于 2:1的染色體的百分比為 0%,核型不對(duì)稱系數(shù)為 1.9704,核型公式為 K(2n)=2x=18=16m+2sm,6號(hào)染色體具有隨體,相對(duì)長(zhǎng)度組成為 2n=1s+4M1+3M2+1L。黃芩的核型為“1A”對(duì)稱型核型。

表2 黃芩染色體相對(duì)長(zhǎng)度、臂比及類型

3 討 論

圖3 黃芩的體細(xì)胞中期照片和核型圖

本研究還發(fā)現(xiàn)黃芩的少數(shù)花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中出現(xiàn)了染色體落后、染色體橋等異?，F(xiàn)象,其中染色體落后的頻率在減數(shù)分裂的中期Ⅱ和后期Ⅱ比較高,后期Ⅱ高達(dá) 14.08%,可能是由于某些染色體同源化程度不高造成的。潘澤惠等在觀察傘形科植物減數(shù)分裂時(shí)認(rèn)為,一些種類的染色體發(fā)生雜合性結(jié)構(gòu)差異,致使減數(shù)分裂時(shí)產(chǎn)生雙著絲點(diǎn)染色體,在后期 I形成染色體橋和斷片[9]。王新宇等認(rèn)為,額外的染色體斷片是染色體直接斷裂的產(chǎn)物,染色體橋是染色體斷裂的間接產(chǎn)物[10]。李雪等認(rèn)為蘭州百合小孢子母細(xì)胞減數(shù)分裂異常是導(dǎo)致敗育花粉產(chǎn)生的主要因素[11]。王恒昌等對(duì)秤錘樹(shù)的研究發(fā)現(xiàn),其減數(shù)分裂過(guò)程中斷片、落后染色體和染色體橋出現(xiàn)的比例與花粉粒敗育性比例比較一致,表明秤錘樹(shù)的小孢子在發(fā)生和發(fā)育過(guò)程中較高頻率的敗育現(xiàn)象可能存在一定的細(xì)胞學(xué)原因[12]。落后染色體和染色體橋造成了染色體的不均勻分配,導(dǎo)致了減數(shù)分裂的一些異常結(jié)果,形成有遺傳組成不平衡的配子,產(chǎn)生不同遺傳組成的花粉粒,這是導(dǎo)致黃芩花粉敗育 (花粉敗育率 23.51%)的重要原因之一。

馮學(xué)鋒等對(duì)黃芩 13個(gè)居群遺傳多樣性的研究表明,黃芩居群的遺傳多樣性與地理距離有一定關(guān)系,距離越遠(yuǎn)遺傳差異越大,且居群內(nèi)差異也較大[13]。同樣本研究結(jié)果顯示,河南禹州黃芩的核型公式為 K(2n)=2x=18=16m+2s m,為“1A”型,屬最對(duì)稱的核型,其中第 6號(hào)染色體具有隨體;而唐曉清等 (2006)對(duì)江蘇省贛榆縣黃芩 (Scutellaria baicalensisGeorgi)的核型分析結(jié)果顯示,其核型公式為 K(2n)=2x=18=10m+6sm+2st,為“2B”型,且沒(méi)有觀察到隨體染色體[14]。細(xì)胞遺傳學(xué)的研究表明,染色體是遺傳物質(zhì)的主要載體,染色體在結(jié)構(gòu)或數(shù)量上的任何變化都會(huì)引起相應(yīng)的遺傳效應(yīng),從而導(dǎo)致更加豐富的遺傳多樣性。在染色體的形態(tài)結(jié)構(gòu)變異中,染色體的長(zhǎng)度、著絲點(diǎn)的位置、隨體的有無(wú)、B染色體的數(shù)量及在不同居群中的分布等方面的變異,都可導(dǎo)致豐富的遺傳多樣性[15]。核型分析是在染色體水平上檢測(cè)植物遺傳多樣性的方法之一,通過(guò)核型分析根據(jù)其核型的對(duì)稱性、隨體的特征等特點(diǎn),對(duì)其遺傳多樣性加以評(píng)判。因此,本研究結(jié)果預(yù)示著生長(zhǎng)在不同地區(qū)的黃芩在染色體水平上存在著遺傳多樣性。

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