人類(lèi)wnt9a的免疫組化研究

向 陽(yáng), 劉高榮, 戴 應(yīng), 王 潔

(湖南理工學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院, 湖南 岳陽(yáng) 414006)

乳腺癌是發(fā)生在乳腺上皮組織的惡性腫瘤, 其發(fā)病率占女性惡性腫瘤首位[1], 是一種嚴(yán)重影響婦女身心健康甚至危及生命的最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一. 近年來(lái), 無(wú)論在基礎(chǔ)研究、發(fā)病機(jī)理, 還是臨床早期診斷和防治上都取得很大的進(jìn)展. wnt基因是一類(lèi)癌基因, wnt蛋白是一類(lèi)從水螅到人類(lèi)都廣泛存在、分泌性、經(jīng)過(guò)脂質(zhì)性修飾的信號(hào)蛋白[2], 在動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中具有廣泛的作用. 哺乳動(dòng)物基因組中存在19個(gè)wnt基因,其功能具多樣性, 突變導(dǎo)致發(fā)育的畸變: 從干細(xì)胞的丟失到腎和生殖域的缺失[3]. wnt蛋白通過(guò)自分泌或旁分泌作用與位于細(xì)胞膜上的受體相結(jié)合, 激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路, 調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá); 在胚胎發(fā)育過(guò)程中對(duì)細(xì)胞的增殖、分化、遷移、極性化和凋亡均起到重要的作用. wnt信號(hào)通路的異常激活往往與腫瘤的發(fā)生相關(guān)聯(lián)[4]. 通過(guò)wnt基因及信號(hào)通路來(lái)研究乳腺癌的發(fā)病機(jī)制及原理對(duì)乳腺癌的防治具有重要意義.RT-PCR和免疫組化研究結(jié)果表明人類(lèi)wnt9a基因和wnt9a蛋白在人類(lèi)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中均表達(dá), 本研究為進(jìn)一步研究wnt9a在乳腺癌發(fā)生和防治中的作用奠定了一定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 工具酶、抗體、試劑盒及寡核昔酸引物合成

DNA聚合酶購(gòu)于Clontech 公司(San Jose, USA); RNA分離試劑盒是Gentra公司的產(chǎn)品(Minneaplis,USA); Revertaid TM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于Fermentas公司 (MBI, Lithuanian); 鼠抗wnt9a多克隆抗體, 針對(duì)人羧基端302-315位氨基酸殘基和鼠298-313位氨基酸殘基, 人鼠通用, 訂購(gòu)于武漢博士德公司; 熒光素標(biāo)記羊抗鼠多克隆抗體(02-18-06)購(gòu)自歐洲KPL公司. wnt9a基因檢測(cè)引物(696bp)5′-tcaaggagactgccttcctctat-3′和5′-actccacatagcagcaccaac-3′由上海英俊公司合成.

1.2 MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)、RNA分離及RT-PCR分析

人類(lèi)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的培養(yǎng)基為RPMI-1640培養(yǎng)基, 添加10%的胎牛血清(FCS)和1%的抗生素. 在細(xì)胞培養(yǎng)箱中 37℃, 5%的CO2條件下培養(yǎng). 每天換液一次, 2天傳代一次. 將培養(yǎng)好的MCF-7細(xì)胞置于DEPC處理過(guò)的 1.5mL EP管中, 并將EP管置于冰上, 根據(jù)Gentra RNA抽提試劑盒(Gentra, 美國(guó))提供的操作說(shuō)明抽提人類(lèi)乳腺癌MCF-7細(xì)胞總RNA, 置于－80℃低溫冰箱保存. 根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說(shuō)明分別以MCF-7細(xì)胞RNA為模板合成cDNA第一條鏈, 然后以cDNA第一條鏈為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng). 擴(kuò)增反應(yīng)是在PE 9600PCR儀上進(jìn)行, 條件是: 在95℃變性60秒; 然后在94℃下變性30秒, 55℃下退火30秒,72℃下延伸30秒, 共35個(gè)循環(huán); 最后在72℃下反應(yīng)10分鐘, 待溫度降為4℃時(shí)從PCR儀上取出產(chǎn)物, 然后在1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳.

1.3 免疫組化過(guò)程

MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)好后去掉培養(yǎng)液, 用PBS洗3次然后固定. 固定液為含1/1000 DEPC的1%多聚甲醛/0.1M PBS(pH7.0～7.6), 室溫 10 min, 0.5MPBS洗 3次, 每次 5 min. 蒸餾水新鮮配置 3%H2O2, 室溫5～10min以滅活內(nèi)源性酶. 蒸餾水洗 3次. 微波修復(fù)抗原: 將切片浸入 0.01M 枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0),電爐或微波爐加熱至沸騰后斷電, 間隔 5～10min, 反復(fù) 2～3次. 冷卻后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn). 對(duì)于難以顯示的抗原, 可用抗原修復(fù)液Ⅰ進(jìn)一步暴露抗原, 滴加在切片上室溫20min后, 0.1M PBS洗滌2～3次. 滴加正常血清封閉液, 室溫20min. 甩去多余液體, 不洗. 滴加適當(dāng)稀釋的一抗(鼠lgG), 3730℃～60min, 0.01M PBS洗2min×3次. 滴加熒光素標(biāo)記的羊抗鼠二抗, 20～37℃, 20min. 0.01M PBS洗2min×3次. 熒光顯微鏡觀察, 照相[5].

2 結(jié)果

2.1 wnt9a基因在MCF-7中表達(dá)的檢測(cè)

采用RT-PCR的方法檢測(cè)人類(lèi)wnt9a基因在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的表達(dá), PCR產(chǎn)物大小與引物設(shè)計(jì)的相符(圖1)產(chǎn)物長(zhǎng)度為696bp. PCR產(chǎn)物直接送上海英俊公司測(cè)序, 測(cè)序結(jié)果正確.

2.2 人類(lèi)wnt9a在人乳腺癌MCF-7細(xì)胞的免疫組化研究

進(jìn)一步檢測(cè)人類(lèi)wnt9a蛋白在MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)情況, 我們進(jìn)行了免疫組化研究, 結(jié)果顯示: 人類(lèi)wnt9a蛋白在在MCF-7細(xì)胞中表達(dá)(紅色熒光)(圖2), 為wnt9a的進(jìn)一步研究打下了基礎(chǔ).

圖1 從MCF-7細(xì)胞cDNA擴(kuò)增人類(lèi)wnt9a基因

圖2 人類(lèi)wnt9a在MCF-7細(xì)胞中表達(dá)的免疫組化檢測(cè)(X400)

3 討論

乳腺癌是一種嚴(yán)重影響婦女身心健康甚至危及生命的最常見(jiàn)的惡性腫瘤, 近年來(lái), 采用基因治療研究乳腺癌的防治是一個(gè)熱門(mén)領(lǐng)域. 很顯然, 乳腺癌的發(fā)生與基因及表達(dá)調(diào)控息息相關(guān), wnt基因是一類(lèi)癌基因, wnt信號(hào)通路的異常激活往往與腫瘤的發(fā)生相關(guān). 本文設(shè)計(jì)了wnt9a的檢測(cè)引物, RT-PCR結(jié)果表明wnt9a在人類(lèi)乳腺癌 MCF-7細(xì)胞中表達(dá). 同時(shí), 免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明人類(lèi) wnt9a蛋白在人類(lèi)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中表達(dá). 本研究為進(jìn)一步研究wnt9a在乳腺癌發(fā)生和防治中的作用奠定了一定基礎(chǔ).

[1]張麗軍, 譚丁桃. 乳腺癌蛋白質(zhì)組研究進(jìn)展[J]. 生命科學(xué), 2007, 19(5): 512～517

[2]Willert K, Brown J D, Danenberg E, et al. Wnt Proteins Arelipid-modified and Can Act as Stem Cell Growth Factors[J]. Nature, 2003, 423 (6938):448～452

[3]K. Cadigan, R. Nusse, Genes Dev. 1997,11

[4]Miller JR. The Wnts [J]. Genome Biol, 2002, 3(3001):123001～15

[5]Y . XIANG, D . S . NIE , G . X . L U . Cloning of a Novel Gene, Cymg1, Related to Family 2 Cystatins and Expressed at Specific Stages of Mouse Testis Development [J]. Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 2005, 37(1): 11～18