大孔樹脂吸附法分離海金沙總黃酮的研究

歐陽玉祝,車少林,黃偉濤

(1.植物資源保護與利用湖南省高校重點實驗室,湖南吉首 416000;2.吉首大學化學化工學院,湖南吉首 416000)

海金沙 (Lygodium japonicum)是一種富含多酚和黃酮類化合物的多年野生草質(zhì)藤本植物,具有抗菌消炎、降低血管脆性、抗氧化和抗衰老、清除羥基自由基等功效[1],不僅是一種良好的抗菌藥物,而且是一種優(yōu)良的天然食品抗氧劑。研究表明:合成抗氧劑 BHA、BHT有致癌作用[2],天然抗氧劑對油脂和含脂食品具有比合成抗氧化劑更強的抗氧化活性和自由基清除能力,這就使天然抗氧劑成為當今人們關(guān)注和研究的熱點[3-4]。大孔吸附樹脂分離技術(shù)是近年來發(fā)展起來的分離精制技術(shù),具有化學穩(wěn)定性高、吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、解吸條件溫和、再生處理方便、分離費用低等優(yōu)點,廣泛用于化工、醫(yī)藥、食品和環(huán)保等領(lǐng)域[5-8]。本實驗用海金沙為原料,用大孔樹脂吸附法分離總黃酮,研究其分離工藝條件。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器和藥品

1.1.1 實驗儀器

UV-2450型紫外可見光分光光度計 (日本島津公司);KQ-250E型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);SHB-III循環(huán)水式多用真空泵 (鄭州長城科工貿(mào)有限公司);DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器 (鄭州長城科工貿(mào)有限公司);FA2104N分析天平 (上海精密科學儀器有限公司)。

1.1.2 實驗藥品

海金沙采自湖南永州,采回的樣本經(jīng)洗凈、晾干、切碎,于 60℃,0.08 MPa真空干燥后,用植物粉碎機粉碎到 60目,置于干燥器中備用;大孔吸附樹脂是天津光復精細化工研究所生產(chǎn);乙醇,氫氧化鈉,鹽酸,醋酸,亞硝酸鈉,硝酸鋁為國產(chǎn)分析純試劑;蘆丁對照品為中國藥品生物制品鑒定所生產(chǎn)。

1.2 實驗方法

1.2.1 大孔樹脂的預處理

D-101大孔吸附樹脂按參考文獻[8]進行預處理。

1.2.2 海金沙總黃酮的提取

取 50 g海金沙按參考文獻[9]用超聲波輔助提取法提取總黃酮,提取液定容到 500 mL備用。

1.2.3 總黃酮的分離

取 5.0 g D-101大孔樹脂于 250 mL錐形瓶中,按一定的固液比加入實驗量的提取液,在一定溫度下吸附,抽濾,樹脂再用一定濃度的乙醇溶液做解吸劑洗脫黃酮,收集洗脫液于 50 mL容量瓶中定容至刻度,分析總黃酮含量,并計算提取率。

1.3 分析方法

1.3.1 總黃酮標準曲線的繪制

用干燥蘆丁作標樣,按參考文獻 [9]測 510 nm處吸光度,以吸光度為橫坐標,濃度為縱坐標繪圖,實驗結(jié)果用計算機進行線性回歸得回歸方程和相關(guān)系數(shù)如下:

式中:C為總黃酮濃度(mg/mL),A為吸光度。

1.3.2 樣品總黃酮的分析

取分離產(chǎn)物的溶液,用紫外可見光分光光度計測 510 nm處吸光度,結(jié)合回歸方程計算總黃酮質(zhì)量,按下式計算總黃酮提取率。

2 結(jié)果與討論

2.1 吸附樹脂的選擇

準確稱取 5.0 g(濕重)經(jīng)預處理的大孔樹脂,置于 100 mL圓底燒瓶中,加 50 mL海金沙提取液,在振蕩器上振蕩吸附 180 min,達到吸附平衡后,測定溶液的吸光度,按下式計算吸附率,結(jié)果如圖1所示。

式中:C1為開始吸附時海金沙溶液總黃酮濃度,C2為吸附平衡時海金沙溶液總黃酮濃度 (mg/mL)。

圖1 吸附劑種類對總黃酮吸附率的影響

圖1結(jié)果表明:D-101大孔吸附樹脂對海金沙總黃酮的吸附率最大,其數(shù)值為 88.7%。因此,選擇 D-101大孔吸附樹脂為吸附劑。

2.2 海金沙總黃酮分離條件實驗

2.2.1 分離條件正交試驗

2.2.1.1 正交試驗因素水平設計

采用L9(34)正交試驗法,因素水平隨機編號,以海金沙總黃酮提取率為指標,研究固液比 (A),吸附溫度 (B),吸附時間 (C)和解吸劑濃度 (D)4因素對海金沙總黃酮提取率的影響,正交試驗水平表如表1所示。

表1 L9(34)正交試驗因素水平表

2.2.1.2 正交試驗結(jié)果與極差分析

根據(jù)正交試驗水平表對乙醇濃度、固液比、吸附溫度和時間作四因素三水平正交試驗,實驗結(jié)果和極差分析如表2所示。

表2 L9(34)正交試驗結(jié)果及極差分析

表中 Ki值 (i=1、2、3)表示第 j列 (j=1、2、3、4)中第 i水平所對應的數(shù)據(jù)之和,Ki值是對應的 Ki值的平均值,極差是 Ki的最大值與最小值之差。表2可知,各因素影響程度由大到小依次為:D>A>C>B。總黃酮提取的優(yōu)水平為:D2A1C1B2,即固液比 1∶8(g/mL),乙醇濃度為 70%,超聲提取溫度 50℃,提取時間 90 min。

2.2.2 分離條件單因素影響實驗

2.2.2.1 解吸劑濃度對總黃酮提取率的影響

為了考查解吸劑對總黃酮提取率的影響,在吸附固液比 1∶8(g/mL),50℃溫度下吸附 90 min,考查不同乙醇濃度對總黃酮提取率的影響,結(jié)果如圖2所示:

圖2 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響

圖2結(jié)果表明:用 70%乙醇作解吸劑,總黃酮提取率最大為 1.8%。因為大孔樹脂分離過程包括吸附和洗脫兩步,在相同吸附條件的洗脫過程中,70%乙醇水溶液作解吸劑有利于破壞樹脂對黃酮吸附的分子間作用力和氫鍵,使黃酮容易從吸附樹脂上洗脫擴散到溶液中。

2.2.2.2 吸附時間對總黃酮提取率的影響

為了考查吸附時間對總黃酮提取率的影響,在吸附固液比為 1∶8(g/mL),50℃溫度下吸附一定時間,抽濾,樹脂用 70%乙醇為解吸劑洗脫黃酮化合物,結(jié)果如圖3所示:

圖3 吸附時間對總黃酮提取率的影響

圖3結(jié)果表明:隨著吸附時間的不斷增加,總黃酮的提取率增大,吸附 90 min后,總黃酮提取率增加很小,說明吸附 90 min達到吸附平衡,平衡后,各組分含量基本不變,取吸附時間為 90 min。

2.2.2.3 固液比對總黃酮提取率的影響

吸附固液比不同,吸附劑用量不同,吸附質(zhì)的吸附量不同,總黃酮提取率將不同。為了考查吸附固液比對海金沙總黃酮提取率的影響,在 50℃溫度下吸附 90 min,抽濾,樹脂再用 70%乙醇解吸,結(jié)果如圖4所示:

圖4 吸附固液比對總黃酮提取率的影響

圖4結(jié)果表明:吸附固液比以 1∶6(g/mL)時最大,總黃酮提取率為 1.84%。因為固液比增加,提取液用量增大,吸附劑用量相對減少,導致提取液中總黃酮吸附不完全,使總黃酮提取率減小。

2.2.2.4 吸附溫度對總黃酮提取率的影響

就吸附過程而言,吸附溫度的高低會直接影響吸附與解吸平衡。在吸附固液比為 1∶8(g/mL)條件下吸附 90 min,再用 70%乙醇進行解吸,考查吸附溫度對海金沙總黃酮提取率的影響,結(jié)果如圖5所示:

圖5 吸附溫度對總黃酮提取率影響

圖5結(jié)果表明:吸附溫度在 50℃時海金沙總黃酮的提取率最高為 1.83%。50℃以下,隨溫度升高提取率增加,大于 50℃后,隨溫度升高總黃酮提取率減小。因為D101大孔樹脂對黃酮的吸附屬物理化學吸附,低溫以化學吸附為主,化學吸附是吸熱反應,溫度升高有利于吸附;到 50℃后轉(zhuǎn)為物理吸附為主,物理吸附是放熱反應,溫度升高不利于吸附,所以黃酮提取率減小;此外,溫度升高,黃酮化合物氧化速度加快。

2.3 最佳分離條件組合實驗

綜合正交試驗和單因素影響實驗結(jié)果確定最佳分離條件為:用 70%乙醇為解吸劑,吸附固液比為 1∶6(g/mL),吸附溫度為 50℃,吸附時間為 90 min。為了考查最佳分離條件下組合實驗效果,在此條件下做組合實驗,結(jié)果如表3所示。

表3 最佳分離工藝條件組合實驗結(jié)果

實驗結(jié)果表明,在最佳分離工藝條件下提取,總黃酮的提取率為 1.81%,5次實驗的精密度較高,相對標準偏差 (RSD)為 1.602%。

3 結(jié) 論

用大孔樹脂分離海金沙總黃酮,分離效果好、吸附速度快、解吸條件溫和,不影響提取物的活性,具有較高的應用價值。實驗結(jié)果表明:以 70%乙醇為解吸劑,在吸附固液比為 1∶6(g/mL),50℃溫度下吸附 90 min,總黃酮提取率為 1.81%。

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