嗜肺軍團(tuán)菌血清1型基因檢測(cè)及分子分型研究

楊 夢(mèng),程慧鍵,熊長(zhǎng)輝,徐曉倩,陳福輝,劉曉青,周海建,袁 輝

嗜肺軍團(tuán)菌血清1型基因檢測(cè)及分子分型研究

楊 夢(mèng)1,程慧鍵1,熊長(zhǎng)輝1,徐曉倩1,陳福輝1,劉曉青1,周海建2,袁 輝1

目的 了解南昌市賓館業(yè)中央空調(diào)冷卻塔水中分離的嗜肺軍團(tuán)菌菌株的基因特征。方法6株分離嗜肺軍團(tuán)菌菌株分別經(jīng)血清學(xué)凝集試驗(yàn)、膠乳凝集試驗(yàn)確定為L(zhǎng)p1型嗜肺軍團(tuán)菌后,利用 PCR技術(shù)對(duì)軍團(tuán)菌屬5SrRNA基因和嗜肺軍團(tuán)菌mip毒力基因的特異序列進(jìn)行擴(kuò)增,應(yīng)用多位點(diǎn)測(cè)序(SBT)分析,獲得相應(yīng)的SBT型別。使用脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)分型技術(shù),對(duì)菌株進(jìn)行全染色體DNA酶切電泳分型,并用BioNumerics數(shù)據(jù)庫(kù)軟件進(jìn)行分型分析。結(jié)果所有的菌株均帶有屬特異性5S rRNA基因及mip毒力基因,SBT分型6株菌均為ST1型,PFGE聚類(lèi)分析結(jié)果顯示菌株帶型之間有差異,6株菌可分為4種帶型。結(jié)論南昌市公共場(chǎng)所冷卻塔水中分離的Lp1型嗜肺軍團(tuán)菌菌株基因呈多樣性。

嗜肺軍團(tuán)菌;血清1型;分子分型

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 6株Lp1型嗜肺軍團(tuán)菌均為2006年南昌市6個(gè)不同賓館的中央空調(diào)冷卻塔水污染狀況監(jiān)測(cè)中檢得,作為PFGE實(shí)驗(yàn)分子量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照的沙門(mén)菌 H 9812菌株,由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所提供。

1.2 主要試劑 軍團(tuán)菌診斷血清購(gòu)自上海市疾病預(yù)防控制中心,GVPC瓊脂、BCYEα瓊脂、無(wú)半胱氨酸BCYE瓊脂、膠乳凝集試劑盒購(gòu)自英國(guó)OXO ID生物公司,PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑盒購(gòu)自上海寶生物工程有限公司,均在有效期內(nèi)使用。7對(duì)管家基因引物由上海生工合成,限制性?xún)?nèi)切酶 SfiⅠ、XbaⅠ、蛋白酶 K購(gòu)自大連TA KARA公司。

1.3 主要儀器 PCR擴(kuò)增儀、脈沖場(chǎng)凝膠電泳儀、凝膠成像儀為美國(guó)B IO-RAD公司產(chǎn)品,水浴搖床、二氧化碳培養(yǎng)箱為美國(guó)NUA IRE公司產(chǎn)品。

1.4 細(xì)菌DNA模板制備 挑取單個(gè)菌落于100μL裂解液中混勻,于100 ℃煮沸10 min,冰浴5 min,10 000 r/min離心5 min,取上清液做為 PCR擴(kuò)增的模板。

1.5 PCR擴(kuò)增 PCR方法參考文獻(xiàn)〔2〕,用5SrRNA和M ip兩套引物分別擴(kuò)增,循環(huán)參數(shù)為:94℃5min預(yù)變性;94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃60 s,擴(kuò)增35個(gè)循環(huán);最后72℃再延伸5 min。5SrRNA預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段為130 bp,M ip預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段為450 bp。產(chǎn)物檢測(cè)用1%含 GoldView TMDNA染料的瓊脂糖凝膠電泳,利用DL 2000 DNA Marker確定產(chǎn)物分子量大小。

1.6 多位點(diǎn)測(cè)序(SBT) 使用國(guó)際 SBT數(shù)據(jù)庫(kù)http://www.ew gli.o rg中公布的引物,對(duì)7個(gè)基因位點(diǎn)(f la A、pil E、asd、m ip、mom p s、pro A 和 neu A)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測(cè)序,將得到的序列信息與數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì),獲得相應(yīng)的SBT型別編號(hào),見(jiàn)表1。

表1 擴(kuò)增引物序列Table 1 The sequence of primers used in PCR

1.7 脈沖場(chǎng)凝膠電泳 使用 SfiⅠ作為內(nèi)切酶。分子量標(biāo)準(zhǔn)株 H 9812用 Xba I酶切,其余參數(shù)與受試菌株相同。具體步驟如下:用棉簽刮取經(jīng)培養(yǎng)過(guò)夜的適量細(xì)菌,均勻懸濁于細(xì)菌懸浮液CSB中,使其濃度為5.0個(gè)麥?zhǔn)蠁挝?。?00μL細(xì)菌懸濁液置于高壓滅菌的1.5 m L離心管中,37℃孵育5 m in后,加入20μL蛋白酶 K(20 mg/mL),用400μL溶解完全且已于 56℃水浴 30 m in以上的 1%Seakem Gold膠(內(nèi)含1%SDS)混勻后,將混合液加入模具,室溫下靜置15 min,制成膠塊。將膠塊移入5m L細(xì)胞裂解液中,54℃水浴搖床(170 r/min)孵育2 h,50℃水浴搖床中使用同溫度純水清洗2次,每次10 min,同溫度 TE buffer清洗4次,每次15 min,清洗后膠塊置 TE中備用。用刀片切下2 mm寬的膠塊放入1.5 m L離心管中,用50 U的SfiⅠ于50℃酶切4 h。將膠塊貼于梳齒包埋于1%Seskem Gold瓊脂糖,待膠凝固后,將膠小心放入含2 500 m L 0.5ⅹTBE緩沖液電泳槽中,電泳21.5 h,電泳起始轉(zhuǎn)換時(shí)間5.3 s,最后轉(zhuǎn)換時(shí)間49.9 s,電壓 6 V/cm,電場(chǎng)夾角 120°,電流控制在155 mA左右,溫度14℃。電泳結(jié)束后,將膠塊放入1μg/m L的EB液中染色30 m in,清水脫色1 h后,凝膠成像系統(tǒng) Gel Doc XR下觀察結(jié)果。

1.8 聚類(lèi)分析 采用BioNumerics軟件對(duì)全染色體DNA酶切圖譜進(jìn)行聚類(lèi)分析。

2 結(jié) 果

2.1 5SrRNA、mip基因PCR檢測(cè)結(jié)果 6株實(shí)驗(yàn)菌株軍團(tuán)菌屬特異性5SrRNA基因及嗜肺軍團(tuán)菌主要毒力基因mip檢測(cè)均為陽(yáng)性(7號(hào)菌株為嗜肺軍團(tuán)菌其它血清型),見(jiàn)圖1。

圖1 5SrRNA,m ip基因PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The PCR results of 5SrRNA and m ip

2.2 SBT分型結(jié)果 6株Lp1型嗜肺軍團(tuán)菌SBT分型均為ST1型,各基因位點(diǎn)等位基因號(hào)見(jiàn)表2。

表2 LP1嗜肺軍團(tuán)菌SBT分型情況Table 2 The sequencing based type result of six Legionella pneumophila serotype 1 strains

2.3 PFGE分型及聚類(lèi)結(jié)果 6株Lp1型嗜肺軍團(tuán)菌經(jīng)SfiⅠ酶切后進(jìn)行 PFGE電泳,得到的圖譜使用BioNumerics軟件處理。按100%的相似性系數(shù)進(jìn)行分型,菌株之間的相似性系數(shù)為 72%～100%,6株Lp1型嗜肺軍團(tuán)菌分為4種不同帶型,見(jiàn)圖2。

圖2 6株LP1型嗜肺軍團(tuán)菌PFGE結(jié)果聚類(lèi)圖Fig.2 The cluster tree of six Legionella pneumophila serotype 1 strains based on PFGE patterns

3 討 論

自1976年軍團(tuán)菌被發(fā)現(xiàn)以來(lái),已有多起軍團(tuán)菌暴發(fā)及散發(fā)病例報(bào)道。作為新發(fā)傳染病之一,軍團(tuán)菌病已成為世界各國(guó)普遍關(guān)注的公共衛(wèi)生問(wèn)題。2006年我們對(duì)南昌市賓館業(yè)中央空調(diào)冷卻塔軍團(tuán)菌污染狀況進(jìn)行調(diào)查,結(jié)果顯示,南昌市中央空調(diào)冷卻塔存在軍團(tuán)菌的污染〔3〕,且其污染率高達(dá)53.8%,檢出菌型中以L(fǎng)p1型為主。

PCR方法檢測(cè)細(xì)菌比已往所有傳統(tǒng)的外顯蛋白質(zhì)表型檢測(cè)更為可靠。5SrRNA是軍團(tuán)菌屬共有基因,高度保守,其rDNA序列拷貝作為屬檢測(cè)依據(jù)是非?？煽康?。巨噬細(xì)胞感染增強(qiáng)蛋白(mip)是軍團(tuán)菌的主要毒力因子之一,在嗜肺軍團(tuán)菌抵抗宿主細(xì)胞內(nèi)殺滅機(jī)制中發(fā)揮重要作用〔4〕,m ip基因序列可用作嗜肺軍團(tuán)菌種特異性靶序列來(lái)擴(kuò)增。我們應(yīng)用PCR技術(shù),對(duì) 6株Lp1型嗜肺軍團(tuán)菌進(jìn)行5SrRNA屬基因和m ip型特異性基因檢測(cè),均攜帶嗜肺軍團(tuán)菌屬、種基因,從分子角度得以驗(yàn)證。

Lp1型嗜肺軍團(tuán)菌是引起人類(lèi)肺炎最多見(jiàn)的血清型之一。有報(bào)道指出,Lp1型菌株包括至少3個(gè)血清亞型〔5-6〕,采用常規(guī)的血清學(xué)分型方法,對(duì)于暴發(fā)疫情溯源存在困難,因此采用何種分型方法對(duì)于結(jié)果分析起著關(guān)鍵作用。目前應(yīng)用比較廣泛的核酸指紋分型技術(shù)主要是基于電泳圖譜分析的一種分子分型方法,脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)已在國(guó)際上廣為應(yīng)用〔7〕。本次研究中的6株Lp1型嗜肺軍團(tuán)菌株分別采自南昌市6所賓館的中央空調(diào)冷卻塔水,按100%的相似性系數(shù)進(jìn)行分型,從圖2 PFGE聚類(lèi)圖可以看出,菌株間相似性系數(shù)存在差異,說(shuō)明南昌市賓館業(yè)中央空調(diào)冷卻塔水分離到的Lp1型嗜肺軍團(tuán)菌基因存在多樣性。

多位點(diǎn)測(cè)序分型(MLST)技術(shù)是一種以核苷酸序列分析為基礎(chǔ)的分型方法,它是高通量測(cè)序技術(shù)和成熟的群體遺傳學(xué)相結(jié)合的產(chǎn)物。該方法簡(jiǎn)單易行,重復(fù)性強(qiáng),能夠反映病原菌的群體進(jìn)化生物學(xué),在流行病學(xué)調(diào)查和病原菌的分型鑒定中發(fā)揮了巨大作用?？衫肕LST方法的高分辨率,進(jìn)行流行菌株間親緣關(guān)系的判定〔8-9〕。但本研究中發(fā)現(xiàn),在Lp1血清型嗜肺軍團(tuán)菌內(nèi),菌株7個(gè)管家基因的PCR產(chǎn)物序列均無(wú)差異,均為ST1型,即未觀察到位于同一血清型內(nèi)部的基因突變,揭示了本地區(qū)同一血清型內(nèi)各菌株管家基因堿基序列的高度保守。

中央空調(diào)冷卻塔是空調(diào)系統(tǒng)中唯一與外界相通的部分,一旦冷卻塔水被軍團(tuán)菌污染,極易形成氣溶膠,使帶有軍團(tuán)菌的氣溶膠擴(kuò)散至空氣中造成空氣污染,同時(shí)對(duì)周?chē)h(huán)境也存在潛在危害。本研究結(jié)果表明,軍團(tuán)菌分子分型方法可以用于不同賓館軍團(tuán)菌分子流行病學(xué)監(jiān)測(cè)及軍團(tuán)菌分子遺傳學(xué)特征的研究。還可用于研究軍團(tuán)菌優(yōu)勢(shì)基因型和優(yōu)勢(shì)菌群的分布特征。

(本項(xiàng)研究得到中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所呼吸道室邵祝軍、任紅宇、朱兵清等老師的大力支持和幫助,表示感謝!)

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Genetic characteristics of Legionella pneumophila serotype 1 strains

YANG M eng1,CHENG Hui-jian1,XIONG Chang-hui1,XU Xiao-qian1,CHEN Fu-hui1,L IU Xiao-qing1,ZHOU Hai-jian2,YUAN Hui1

(1.Jiang Xi Provincial Center for Disease Control and Prevention,Nanchang 330029;2.National Institute for Communicable Disease Control and Prevention,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Beijing 102206,China)

In order to determine the genetic characteristics of Legionella pneumophila serotype 1(Lp1)strains isolated from cooling water within towers of central air conditioning in hotels in Nanchang city,six Lpisolates were identified as Lp1 by serological agglutination test and latex agglutination test.Then PCR was used to detect the special Legionella spp.5SrRNA gene and Lp virulence mip gene.Sequencing based type(SBT)and pulsed-field gel electrophoresis(PFGE)were used in molecular typing.A ll strains were positive with 5SrRNA gene and m ip gene.The SBT typeof all six strainswas ST1.However,the PFGE result showed difference between patterns of six strains,which could be divided into four PFGE patterns.Six Legionella pneumophila isolates from cooling water in towers in public p laces of central air conditioning system s in Nanchang City were genetic diversity.

Legionella pneumophila;serotype 1;molecular typing軍團(tuán)病是由軍團(tuán)菌引起的一種機(jī)會(huì)獲得性呼吸道傳染病。軍團(tuán)菌目前大約有50個(gè)種,72個(gè)血清型。90%以上的軍團(tuán)菌肺炎都是由嗜肺軍團(tuán)菌引起的,嗜肺軍團(tuán)菌血清1型菌株(Lp1)為主要的致病血清型。軍團(tuán)菌的生長(zhǎng)和繁殖與環(huán)境因素密切相關(guān),尤其在供水系統(tǒng)、空調(diào)系統(tǒng)中較為常見(jiàn)〔1〕,主要是通過(guò)氣溶膠的方式進(jìn)行傳播。本研究采用基因檢測(cè)、多位點(diǎn)測(cè)序、脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型技術(shù),對(duì)南昌市賓館業(yè)中央空調(diào)冷卻塔水中分離到的嗜肺軍團(tuán)菌血清1型(Lp1)菌株進(jìn)行分子特征研究。

R126.4

A

1002-2694(2010)12-1151-03

袁輝,Email:jxcdcyuanhui@126.com

1.江西省疾病預(yù)防控制中心,南昌 330029;2.中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所,北京

102206

2010-07-11;

2010-09-23