白質(zhì)消融性白質(zhì)腦病患兒12例臨床與遺傳學(xué)研究

冷雪榮 吳 曄 潘艷霞 杜 麗 金 洪 王靜敏 姜玉武

白質(zhì)消融性白質(zhì)腦病(leukoencephalopathy with vanish-ing white matter，VWM)是一種常染色體隱性遺傳的白質(zhì)腦病，是兒童期常見的遺傳性白質(zhì)腦病之一[1]。VWM是由編碼真核細(xì)胞翻譯啟動(dòng)因子2B(eukaryotic translation initiation factor 2B，eIF2B)的5個(gè)亞單位(eIF2Bα、β、γ、δ、ε)的相應(yīng)編碼基因EIF2B1～5的任一突變引起[2]。eIF2B為5個(gè)亞單位構(gòu)成的五聚體復(fù)合物，其中eIF2Bε是重要的亞單位，具有鳥苷酸轉(zhuǎn)移因子(guanine nucleotide-exchange factor, GEF)活性，直接作用對(duì)象為真核細(xì)胞翻譯啟動(dòng)因子2 (eukaryotic translation initiation factor 2，eIF2)，催化eIF2-GDP向eIF2-GTP轉(zhuǎn)化；其他4個(gè)eIF2B亞單位在調(diào)控GEF活性方面具有重要作用。

目前，VWM臨床診斷主要依據(jù)典型的臨床表現(xiàn)以及頭顱MRI特點(diǎn)，確診需經(jīng)基因突變分析。本研究對(duì)臨床診斷并經(jīng)基因突變分析確診的中國(guó)VWM患兒進(jìn)行臨床特征總結(jié)，對(duì)基因突變特點(diǎn)進(jìn)行分析，并做初步的突變功能研究。以期提高兒科醫(yī)生對(duì)該病的認(rèn)識(shí)，并為進(jìn)一步的遺傳咨詢及了解VWM發(fā)病機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 對(duì)象與方法

1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) VWM依據(jù)van der Knaap等推薦的標(biāo)準(zhǔn)[3]：①早期的精神、運(yùn)動(dòng)發(fā)育基本正?；蜉p度落后；②兒童早期出現(xiàn)進(jìn)行性加重的神經(jīng)系統(tǒng)功能倒退，發(fā)熱或輕微頭部外傷均引起病情加重；③神經(jīng)系統(tǒng)癥狀主要包括小腦共濟(jì)失調(diào)，肢體痙攣；④頭顱MRI表現(xiàn)為彌漫性、對(duì)稱性大腦白質(zhì)廣泛受累，累及中央?yún)^(qū)及皮質(zhì)下白質(zhì)，白質(zhì)異常在T1、T2及FLAIR像上逐漸演變?yōu)榕c腦脊液相同的信號(hào)。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 以臨床診斷為VWM的患兒為研究對(duì)象。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) ①常見有機(jī)酸、氨基酸、脂肪酸和線粒體代謝??；②已知常見的其他遺傳性白質(zhì)腦??；③后天獲得性白質(zhì)病變(腦室旁白質(zhì)軟化和急性播散性腦脊髓炎等)。

1.4 倫理審核 本研究方案經(jīng)北京大學(xué)第一醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)審批，所有患兒家屬均簽署知情同意書。

1.5 臨床資料收集 包括：病史及體格檢查；血生化(電解質(zhì)、血氨、乳酸、丙酮酸及肝、腎功能)檢查；尿有機(jī)酸、氨基酸及脂肪酸分析結(jié)果；白細(xì)胞芳香硫脂酶A和β半乳糖腦苷脂酶活性測(cè)定結(jié)果；頭顱MRI片。

1.6 基因突變分析

1.6.1 提取外周血白細(xì)胞DNA 采集患兒及其父母外周靜脈血各5 mL，抗凝，以常規(guī)鹽析法提取外周血白細(xì)胞基因組DNA。

1.6.2 突變篩查 國(guó)際上報(bào)道VWM的120多種突變中[4]，EIF2B5突變最為常見，占57%。EIF2B2突變占15%，EIF2B4突變占17%，EIF2B3突變占7%，EIF2B1突變僅占4%[5，6]。因此，對(duì)于每例患兒首先篩查EIF2B5突變，隨后依次篩查EIF2B4、EIF2B2、EIF2B3和EIF2B1突變。PCR擴(kuò)增包括EIF2B5的16 個(gè)外顯子,EIF2B4的13個(gè)外顯子，EIF2B2的8個(gè)外顯子，EIF2B3的12個(gè)外顯子，EIF2B1的9個(gè)外顯子，以及所有外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)PAGE檢測(cè)，在ABI 3100 測(cè)序儀上直接正反向測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用DNASTAR 軟件分析。對(duì)于本研究發(fā)現(xiàn)的國(guó)外未報(bào)道的新突變，通過(guò)分析氨基酸變化、保守性、家系傳遞分離分析、已知基因多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù)檢索及100例健康成人對(duì)照的測(cè)序，以確定所發(fā)現(xiàn)的突變?yōu)橹虏⊥蛔?，排除基因多態(tài)性。并對(duì)其父母進(jìn)行基因測(cè)序，分析突變來(lái)源。

1.7EIF2B5突變功能研究

1.7.1 突變的選擇 選擇在患兒中發(fā)現(xiàn)的EIF2B5基因的新突變進(jìn)行功能研究。

1.7.2 質(zhì)粒構(gòu)建 將帶有野生型人類eIF2Bε全長(zhǎng)cDNA的 PHM表達(dá)質(zhì)粒(加拿大Southampton大學(xué)Proud教授饋贈(zèng))，利用QuikChange Site-directed Mutagenesis 試劑盒(Stratagene公司)進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得突變體質(zhì)粒。N端具有 Hexahistidine (His6)和 Myc標(biāo)記，以便于檢測(cè)蛋白表達(dá)。所有的cDNA均經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證。

1.7.3 培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞 將HEK 293細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃和5%CO2條件下孵育。每2 天換液1次。利用lipofecta-mine2000試劑盒(Invitrogen公司)進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，分別轉(zhuǎn)染野生型及突變型質(zhì)粒，48 h后提取細(xì)胞總蛋白。

1.7.4 提取蛋白 用冰冷的PBS洗細(xì)胞2次，將細(xì)胞裂解液(50 mmol·L-1Tris HCl，50 mmol·L-1beta-glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate，1 mmol·L-1EDT，1 mmol·L-1EGTA，1% Triton X-100)直接加入細(xì)胞中，吹打細(xì)胞，使細(xì)胞完全裂解。分別將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移至EP管，4℃，13 000 r·min-1離心10 min。吸取上清蛋白，-80℃保存。

1.7.5 Western blot分析突變蛋白表達(dá) 將蛋白標(biāo)本加入等體積2× SDS sample buffer，95℃加熱5 min。在8% SDS-PAGE分離，每條泳道蛋白上樣量20 μg，每次電泳包括野生型和突變型的蛋白標(biāo)本。電泳結(jié)束后，用濕轉(zhuǎn)法電轉(zhuǎn)蛋白至硝酸纖維素(NC)膜上。轉(zhuǎn)移后的NC 膜用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入一抗(Anti-myc，Sigma公司)，4℃過(guò)夜。用TTBS 洗膜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗(山羊抗兔IgG，北京中山生物技術(shù)公司)，室溫孵育1 h，TTBS 充分洗膜，通過(guò)魯米諾化學(xué)發(fā)光法暴光Kodak 膠片，顯示目的條帶。以β-actin作為內(nèi)參，同一組的目的條帶灰度與β-actin相比，計(jì)算相應(yīng)比值，進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 2006至2008年于北京大學(xué)第一醫(yī)院兒科神經(jīng)科臨床診斷為VWM患兒12例，其中男8例，女4例。臨床及頭顱MRI表現(xiàn)符合VWM的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)。父母均非近親婚配，患兒間無(wú)親緣關(guān)系。臨床特征見表1。

2.3 輔助檢查特點(diǎn) 頭顱MRI均呈典型改變：彌漫性、對(duì)稱性大腦白質(zhì)受累，以中央?yún)^(qū)白質(zhì)為著，在T1加權(quán)像、T2加權(quán)像及FLAIR像，受累白質(zhì)表現(xiàn)為接近或等于腦脊液信號(hào)(圖1)。所有患兒其他輔助檢查均未見明顯異常。

圖1 VWM患兒(例1)的頭顱MRI片

Fig 1 Brain MRI from patient 1 with VWM

Notes A:T2-weighted;B:T1-weighted;C:FLAIR;Symmetric and diffuse signal abnormalities in periventricular and subcortical white matter were shown, with low signals in T1-weighted image and FLAIR image, and high signals in T2-weighted image, similar to that of cerebrospinal fluid

2.4 基因突變分析 12例患兒中發(fā)現(xiàn)16種基因突變。其中6例患兒為EIF2B5突變，5例為EIF2B3突變，1例為EIF2B2突變。16種基因突變中包括9種國(guó)際上未報(bào)道的新突變和7種已知突變。7種已報(bào)道的突變?yōu)镋IF2B5：c.943C>T (p.R315C)、c.1340C>T(p.S447L)、c.1016G>C(p.R339P)、c.1157G>T(p.G386V)、c.337C>T(p.R113C)、c.806G>A(p.R269Q)；EIF2B3：c.674G>A(p.R225Q)。9種新突變中7種錯(cuò)義突變?yōu)镋IF2B5：c.185A>T(p.D62V)、c.1004G>C(p.C335S)、c.1126A>G(p.N376D)；EIF2B3：c.140G>A(p.G47E)、c.1037T>C(p.I346T)；EIF2B2：c.254T>A(p.V85E)、c.922G>A(p.V308M)； 1種無(wú)義突變?yōu)镋IF2B5： c.805C>T(R269X)；1種缺失突變?yōu)镋IF2B5：c.1827-1838del(p.S610-D613del)(表1，圖2)。9種新突變均位于進(jìn)化上的高度保守區(qū)，未在100例健康成人對(duì)照中發(fā)現(xiàn)。1例患兒(例10)僅在一個(gè)等位基因上發(fā)現(xiàn)了突變，另一個(gè)等位基因的編碼區(qū)以及外顯子-內(nèi)含子交界區(qū)未發(fā)現(xiàn)突變。所有患兒的突變均來(lái)自表型正常的父母。

圖2 9種EIF2B新突變的測(cè)序圖譜

Fig 2 The chromatograms of sequencing results of 9 novelEIF2Bmutations

Notes A:EIF2B3，c.140G>A, p.G47E ;B:EIF2B3，c.1037T>C, p.I346T (reverse sequencing);C:EIF2B5，c.1126A>G, p.N376D；D:EIF2B5,c.1004G>C, p.C335S;E:EIF2B5,c.805C>T, p.R269X(reverse sequencing);F:EIF2B5,c.185A>T, p.D62V;G:EIF2B5,c.1827-1838del,p.S610-D613;H:EIF2B2,c.254T>A,p.V85G;I:EIF2B2,c.922G>A,p.V308M

2.5EIF2B5突變功能研究EIF2B5新突變p.D62V、p.R269X、p.C335S、p.N376D和p.S610-D613del 中，p.R296X和p.S610-D613del突變引起蛋白表達(dá)量顯著降低，Western blot幾乎檢測(cè)不到條帶(圖3)。其他3個(gè)錯(cuò)義突變p.D62V、p.C335S和p.N376D蛋白表達(dá)量與野生型差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 5種EIF2B5突變對(duì)eIF2Bε蛋白表達(dá)量的影響

Fig 3 Effects of fiveEIF2B5 mutations on the mutant eIF2Bε protein expression

Notes HEK 293 cells were transfected with wild-type or mutant eIF2Bε cDNA, lysates were analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylam gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoblotting. On immunoblots, eIF2Bε-p.D62V, eIF2Bε-p.C335S and eIF2Bε-p.N376D were present in amounts similar to the wild type, whereas eIF2Bε-R269X and eIF2Bε-S610-D613Sdel were present in a substantially reduced amount, which almost could not be detected

3 討論

VWM是兒童期起病的遺傳性白質(zhì)腦病中常見的類型之一。VWM臨床表型差異很大，起病年齡可早至胎兒期(先天型，1歲內(nèi)死亡)或晚至成年期(成年型)，其中以1～5歲起病最為多見(早期兒童型，又稱經(jīng)典型)。早期兒童型VWM患兒發(fā)病前智力和運(yùn)動(dòng)發(fā)育多正常，少數(shù)有輕度運(yùn)動(dòng)或語(yǔ)言發(fā)育落后。起病表現(xiàn)多為共濟(jì)失調(diào)，逐漸出現(xiàn)肢體痙攣、構(gòu)音障礙和驚厥，在病程后期可出現(xiàn)吞咽困難，智力受累相對(duì)較輕。臨床特征性表現(xiàn)為遇輕微感染(如上呼吸道感染)所致發(fā)熱或輕微頭部外傷后即可引起病情明顯加重，出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)功能喪失，可伴易激惹、嘔吐、意識(shí)障礙，甚至驚厥及昏迷，病程中可逐漸緩慢恢復(fù)，發(fā)作也可導(dǎo)致死亡。VWM患兒的病程變化個(gè)體差異較大，多于起病后數(shù)年內(nèi)死亡，也有存活數(shù)十年的報(bào)道[7]。本組12例患兒根據(jù)起病年齡均屬于早期兒童型。至末次隨訪，病程為9個(gè)月至7年，所有患兒均存活。本病典型體征主要為錐體束征陽(yáng)性，可伴有共濟(jì)失調(diào)體征，頭圍多正常。本病頭顱MRI具有較獨(dú)特的特征，大腦白質(zhì)病變顯著重于其他遺傳性白質(zhì)腦病，表現(xiàn)為彌漫性、對(duì)稱性大腦白質(zhì)的液化樣改變，即“白質(zhì)消融”，以中央?yún)^(qū)白質(zhì)受累為著，逐漸波及全部大腦白質(zhì)。小腦白質(zhì)也可出現(xiàn)異常信號(hào)，但通常不發(fā)生液化。本組12例VWM患兒均具有上述典型頭顱MRI特征。

VWM是第1個(gè)被確定的因mRNA翻譯啟動(dòng)異常所導(dǎo)致的人類遺傳疾病，其致病基因在2001至2002年被確定是由elF2B的5個(gè)亞單位(elF2Bα、β、γ、δ、ε)的相應(yīng)編碼基因EIF2B1～5的任一基因突變引起。臨床診斷為VWM的患者95%存在EIF2B1～5基因突變。目前關(guān)于VWM的研究對(duì)象多為白種人，65%的VWM患者為EIF2B5基因突變所致。EIF2B5基因的錯(cuò)義突變R113H被認(rèn)為是一熱點(diǎn)突變，可能發(fā)生于近40%的VWM患者中[5,7～9]。在所有已發(fā)現(xiàn)的EIF2B1～5突變中，以錯(cuò)義突變?yōu)橹?，無(wú)義突變很少[6]。目前確診的VWM患者中，攜無(wú)義突變患者多為無(wú)義加錯(cuò)義的復(fù)合雜合子，而非純合無(wú)義突變，提示該基因功能非常重要，攜無(wú)義突變純合子患者可能不能存活[2]。目前尚無(wú)確定的基因型-表型相關(guān)性。在本組VWM患兒中，EIF2B突變譜與既往報(bào)道存在差異，在16種突變中9種為既往未報(bào)道的新突變。突變僅發(fā)生在EIF2B5，EIF2B3和EIF2B2上，其中EIF2B5突變占68.8%(11/16)；EIF2B3突變占18.8%(3/16)，高于國(guó)外報(bào)道的7%[5，6]。5/12例患兒攜帶EIF2B3突變。提示中國(guó)VWM患兒EIF2B3突變率可能較高。本研究還發(fā)現(xiàn)了EIF2B3的一個(gè)熱點(diǎn)突變p.I346T，5例攜帶EIF2B3突變的患兒中，有4例攜帶此突變。既往報(bào)道的EIF2B5熱點(diǎn)突變p.R113H在本組VWM患兒中未被發(fā)現(xiàn)。因此初步推測(cè)中國(guó) VWM患兒可能具有其獨(dú)特的EIF2B基因突變譜，與VWM白種人患者的EIF2B突變譜有所不同。但基于本研究樣本量較小，尚需累積更多患兒的基因突變分析結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)。

elF2B突變導(dǎo)致VWM的發(fā)病機(jī)制目前尚不十分清楚[10～13]。在真核細(xì)胞蛋白翻譯啟動(dòng)時(shí)，elF2-GTP負(fù)責(zé)將Met-tRNA結(jié)合至40S核糖體亞單位上，識(shí)別并結(jié)合mRNA上相應(yīng)的起始密碼AUG從而啟動(dòng)翻譯過(guò)程，隨即 elF2-GTP脫磷酸為eIF2-GDP而失去活性。elF2B具有GEF活性，負(fù)責(zé)eIF2的GDP/GTP轉(zhuǎn)化，使elF2-GDP再次轉(zhuǎn)化為具有活性的elF2-GTP，投入下一輪蛋白質(zhì)翻譯啟動(dòng)過(guò)程[14]。eIF2Bε是最重要的eIF2B亞單位，由721個(gè)氨基酸組成，其C末端的第518～712位氨基酸殘基與底物eIF2結(jié)合，發(fā)揮其GEF活性。N末端500個(gè)氨基酸是與其他亞基結(jié)合的作用區(qū)域，可能影響亞單位之間的結(jié)合[14]。eIF2Bε突變可能通過(guò)不同途徑影響蛋白功能從而致病，包括影響蛋白表達(dá)量、五聚體形成、eIF2B與底物結(jié)合等多種途徑。本研究初步結(jié)果顯示，p.R296X和 p.S610-D613del突變導(dǎo)致eIF2Bε蛋白表達(dá)量顯著下降，因此不能生成足夠具有功能的eIF2B復(fù)合體，為嚴(yán)重影響功能的突變。p.R296X和 p.S610-D613del突變均發(fā)生在復(fù)合雜合子中，推測(cè)如為突變純合體，因嚴(yán)重缺乏有功能的eIF2Bε蛋白，患兒可能無(wú)法存活。

本研究首次對(duì)中國(guó)VWM患兒進(jìn)行了eIF2B各亞單位的基因突變篩查，并發(fā)現(xiàn)了國(guó)際上未報(bào)道的9種新突變，且初步揭示中國(guó) VWM患兒可能具有與白種人群不同的基因突變譜。目前初步的功能研究結(jié)果提示，eIF2Bε的兩種新突變p.R296X及 p.S610-D613del可導(dǎo)致蛋白表達(dá)量顯著下降，提示其嚴(yán)重影響eIF2Bε蛋白功能。為進(jìn)一步探討VWM基因型和表型的關(guān)系以及VWM的發(fā)病機(jī)制，本課題組正在繼續(xù)收集病例，并進(jìn)行下一步的突變功能研究。

[1]van der Knaap MS, Pronk JC, Scheper GC. Vanishing white matter disease. Lancet Neurol,2006, 5(5): 413-423

[2]van der Knaap MS, Leegwater PA, K?nst AA, et al. Mutations in each of the five subunits of translation initiation factor eIF2B can cause leukoencephalopathy with vanishing white matter. Ann Neurol, 2002, 51(2): 264-270

[3]van der Knaap MS, Barth PG, Gabre?ls FJ, et al. A new leukoencephalopathy with vanishing white matter. Neurology,1997, 48(4): 845-855

[4]Maletkovic J, Schiffmann R, Gorospe JR, et al. Genetic and clinical heterogeneity in eIF2B-related disorder. J Child Neurol, 2008,23(2):205-215

[5]Pronk JC, van Kollenburg B, Scheper GC. Vanishing white matter disease: a review with focus on its genetics. Ment Retard Dev Disabil Res Rev, 2006,12(2):123-128

[6]Fogli A, Boespflug-Tanguy O. The large spectrum of eIF2B-related disease. Biochem Soc Trans,2006, 34(Pt 1), 22-29

[7]Scali O, Di Perri C, Federico A. The spectrum of mutations for the diagnosis of vanishing white matter disease. Neurol Sci,2006, 27(4), 271-277

[8]Ohlenbusch A, Henneke M, Brockmann K, et al. Identification of ten novel mutations in patients with eIF2B-related disorder. Hum Mutat, 2005,25(4):411-416

[9]Matsui M, Mizutani K, Ohtake H, et al. Novel mutations in EIF2B gene in a case of adult-onset leukoencephalopathy with vanishing white matter. Eur Neurol, 2007, 57(1): 57-58

[10]Kantor L, Harding HP, Ron D, et al. Heightened stress response in primary fibroblasts expressing mutant eIF2B genes from CACH/VWM leukodystrophy patients. Hum Genet, 2005, 118(1): 99-106

[11]Kubica N, Jefferson LS, Kimball SR. Eukaryotic initiation factor 2B and its role in alterations in mRNA translation that occur under a number of pathophysiological and physiological conditions. Pro Nucleic Acids Res Mol Biol, 2006, 81: 271-296

[12]van Kollenburg B, van Dijk J, Garbern J,et al. Glia-specific activation of all pathways of the unfolded protein response in vanishing white matter disease. J Neuropathol Exp Neurol, 2006, 65(7): 707-715

[13]Kantor L, Pinchasi D, Mintz M,et al. A point mutation in translation initiation factor 2B leads to a continuous hyper stress state in oligodendroglial-derived cells. PLoS ONE, 2008, 3(11):3783

[14]Pavitt GD. eIF2B, a mediator of general and gene-specific translational control. Biochem Soc Trans,2005,33(Pt 6):1487-1492