真菌抗原檢測(cè)在侵襲性真菌感染中的診斷價(jià)值

張曉艷 綜述 趙順英 江載芳 審校

近年來(lái)由于造血干細(xì)胞、實(shí)體器官移植的廣泛開(kāi)展、高強(qiáng)度免疫抑制劑和大劑量化療藥物的應(yīng)用，以及各種導(dǎo)管的體內(nèi)介入、留置等，臨床上侵襲性真菌感染(IFI)的發(fā)生率和病死率呈明顯上升趨勢(shì)，其預(yù)后改善有賴(lài)于早期診斷和及時(shí)有效的抗真菌治療。然而由于IFI的臨床表現(xiàn)不典型且易被原發(fā)病掩蓋，致使早期診斷十分困難。真菌培養(yǎng)和組織活檢是IFI診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，然而由于所需時(shí)間長(zhǎng)、敏感度較低以及有時(shí)因患者的病情而難以獲得組織標(biāo)本，無(wú)法滿足臨床診斷的需要。近年來(lái)開(kāi)展的真菌抗原檢測(cè)，尤其是半乳甘露聚糖(galactomanna,GM)和1,3-β-D葡聚糖(BG)檢測(cè)作為一種非侵襲性診斷方法，有著早期、快速、高靈敏度和特異度的優(yōu)點(diǎn)，先后被歐洲國(guó)家、美國(guó)及中國(guó)制定的IFI診斷和治療指南列為臨床診斷IFI的微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)之一。本文就真菌抗原檢測(cè)在IFI中的診斷價(jià)值做一綜述。

1 GM

GM是曲霉菌細(xì)胞壁上的一種多糖抗原。Latgé等[1]從體外曲霉菌培養(yǎng)的上清液提取分析了GM的結(jié)構(gòu)，GM在體外是一種單純多糖，相對(duì)分子質(zhì)量約為20 000，其共有結(jié)構(gòu)是由α-1，2和α-1，6糖苷鍵聚合而成的甘露聚糖核心及由β-1，5呋喃半乳糖殘基組成的具有抗原活性的側(cè)鏈構(gòu)成。GM的抗原表位為其側(cè)鏈上的β-1，5半乳呋喃糖，GM的抗原表位數(shù)目在不同的曲霉菌株和菌種有所不同。

GM在曲霉菌絲向組織侵襲性生長(zhǎng)時(shí)釋放進(jìn)入血液循環(huán)，這種抗原血癥可持續(xù)存在1～8周[2]。已有的商品化試劑盒采用乳膠凝集法(LA)和ELISA法檢測(cè)GM，兩者均使用抗GM單克隆抗體,但由于實(shí)驗(yàn)方法不同,其敏感度和特異度存在較大差異。LA可檢測(cè)出血清中GM 15 μg·L-1，而此時(shí)患者已生命垂危，開(kāi)始治療意義不大[3～5]，因此限制了其臨床應(yīng)用。20世紀(jì)90年代初發(fā)展的ELISA法，利用鼠抗GM單克隆抗體檢測(cè)循環(huán)中的GM，其靈敏度達(dá)0.5～1 μg·L-1。Maertens等[6]關(guān)于ELISA檢測(cè)血清GM對(duì)血液病患者IFI診斷價(jià)值的研究結(jié)果顯示，若以2次吸光度指數(shù)≥1.0為陽(yáng)性判定界值點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)總敏感度為92.6%，特異度為95.4%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為93%和95%，50%以上患者在出現(xiàn)臨床癥狀前即可檢出血中抗原。對(duì)高?；颊哌M(jìn)行動(dòng)態(tài)檢測(cè)(每周2次)更具有早期診斷價(jià)值。2003年，美國(guó)FDA完成對(duì)該實(shí)驗(yàn)的臨床評(píng)價(jià), 其敏感度為80.7%,特異度為89.2%,早期診斷優(yōu)勢(shì)突出，并批準(zhǔn)GM實(shí)驗(yàn)用于非免疫缺陷患兒侵襲性曲霉菌病(IA)的輔助診斷。

近年將ELISA檢測(cè)血清GM與胸部CT結(jié)合作為搶先治療的起點(diǎn)，不僅降低了病死率，同時(shí)提高了診斷IA的準(zhǔn)確性，減少了過(guò)度經(jīng)驗(yàn)性用藥的毒性作用和費(fèi)用[7，8]。多項(xiàng)研究顯示，血清GM水平與組織的真菌負(fù)荷量成正比，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)血清GM水平的變化有助于判斷抗真菌治療的效果[2，6，9，10]。需要注意的是，有文獻(xiàn)報(bào)道在使用棘白菌素類(lèi)的抗真菌藥治療后，臨床癥狀改善并不一定伴有血清GM滴度的下降[11]。在兔IPA模型中，F(xiàn)rancesconi等[12]發(fā)現(xiàn)三唑類(lèi)抗真菌藥可顯著降低支氣管肺泡灌洗液(BALF)中的GM水平，而使用棘白菌素類(lèi)藥物治療組BALF中的GM水平則持續(xù)升高，考慮可能與棘白菌素類(lèi)藥破壞真菌的細(xì)胞壁而不能將其徹底清除，使其胞壁抗原不斷釋放入周?chē)M織中有關(guān)。

至今，關(guān)于ELISA檢測(cè)血清GM在IA中診斷價(jià)值的研究結(jié)果均顯示了較高的特異度(>85%)，然而敏感度差異較大(30%～100%)[13～20]。

被檢人群的不同，感染的曲霉菌種以及實(shí)驗(yàn)相關(guān)的因素等均可對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生不同程度的影響。晚近，Pfeiffer等[21]對(duì)ELISA檢測(cè)血清GM在IA中的診斷價(jià)值進(jìn)行Meta分析，發(fā)現(xiàn)該實(shí)驗(yàn)在惡性血液病患者中的敏感度和特異度分別為70%和92%，然而在實(shí)體器官移植患者中的敏感度僅為22%，提示GM實(shí)驗(yàn)在惡性血液病或骨髓移植患者中的診斷價(jià)值優(yōu)于實(shí)體器官移植患者。Balloy等[22]對(duì)由糖皮質(zhì)激素和化療藥所致的免疫抑制IA小鼠進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)由糖皮質(zhì)激素所致免疫抑制的小鼠，在其感染的肺組織伴有快速和大量的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，肺、腎和腦組織中GM水平較低；化療藥所致免疫抑制小鼠的BALF中出現(xiàn)了大量的菌絲浸潤(rùn)和GM水平的顯著升高(無(wú)多核細(xì)胞的浸潤(rùn))，提示被測(cè)鼠群的不同，可顯著影響實(shí)驗(yàn)的敏感度。

假陰性結(jié)果除與上述被測(cè)鼠群不同有關(guān)外，還與以下因素有關(guān)： ①判斷陽(yáng)性結(jié)果的界值點(diǎn)：起初歐洲國(guó)家多以1.5作為陽(yáng)性判定界值點(diǎn)，Bio-Rod公司推薦的判定界值點(diǎn)也為1.5。美國(guó)FDA推薦的判定界值點(diǎn)為0.5。Ulusakarya等[13]以1.5作為陽(yáng)性判定界值點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)的敏感度和特異度分別為69%和96%，若將陽(yáng)性界值點(diǎn)降至1.0則實(shí)驗(yàn)的敏感度可升至100%，而特異度降至92%。為確定一個(gè)最佳陽(yáng)性界值點(diǎn)，Verweij等[23]對(duì)203例患者進(jìn)行了檢測(cè)，受試工作者特征(ROC)曲線分析結(jié)果顯示，陽(yáng)性界值點(diǎn)為0.5時(shí)的敏感度為97.4%，特異度為90.5%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和陰性預(yù)測(cè)值分別為66.1%和99.4%。目前以0.5為判定界值點(diǎn)已被歐洲國(guó)家和美國(guó)普遍接受。②宿主抗真菌治療：Marr等[24]對(duì)67例患者的986份血清進(jìn)行GM實(shí)驗(yàn)，顯示在未接受抗真菌治療患者的敏感度為80%，而經(jīng)抗真菌治療患者的敏感度僅為20%。 ③還可能與曲霉菌感染的嚴(yán)重程度、高滴度抗體和一過(guò)性抗原血癥有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道在非侵襲性或侵襲程度較低的肺曲霉菌病(如曲霉球和氣管支氣管曲霉菌病)ELISA檢測(cè)血清GM的敏感度較低，在慢性空洞性肺曲霉病患者血清ELISA GM檢測(cè)的臨床意義不大[25]。因真菌抗原血癥是一過(guò)性的，樣本采集頻率較低，可能會(huì)降低實(shí)驗(yàn)的敏感度。目前推薦對(duì)高危患者每周檢測(cè)2次。在可疑IA患者的敏感度一般較低，可使實(shí)驗(yàn)總的敏感度降低[16，26]。

血清GM檢測(cè)對(duì)IA的診斷有較好的特異度，但有文獻(xiàn)報(bào)道在兒童，尤其是小嬰兒和新生兒的假陽(yáng)性率則較高。一項(xiàng)包含成人和兒童的前瞻性研究顯示，兒童的假陽(yáng)性率為10.1%(34/338例),成人僅為2.5%(10/406例)[27]。另外一項(xiàng)研究同樣顯示，兒童的假陽(yáng)性率顯著高于成人(44%vs0.9%)[26]。Siemann等[28]對(duì)6例新生兒進(jìn)行GM實(shí)驗(yàn)，其中5例呈假陽(yáng)性結(jié)果。關(guān)于兒童中假陽(yáng)性率較高的原因可能與嬰兒或新生兒腸道內(nèi)定植著大量的雙歧桿菌有關(guān)，雙歧桿菌的脂膜酸可與GM發(fā)生交叉反應(yīng)；另外配方奶中含有較高濃度的GM，可能與通過(guò)尚未發(fā)育完整的腸黏膜進(jìn)入循環(huán)而造成假陽(yáng)性結(jié)果[29]。谷物、谷類(lèi)食品和牛奶等食物中均含有GM，可通過(guò)受損的腸黏膜進(jìn)入循環(huán)引起抗原血癥，也可解釋骨髓移植患者血清 ELISA GM檢測(cè)的假陽(yáng)性率在移植術(shù)后的第1個(gè)月最高，因?yàn)檫@一時(shí)期化療藥所致的腸黏膜病變最為嚴(yán)重[26]。靜脈應(yīng)用β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素也可產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果[30～32]，最近一項(xiàng)研究對(duì)15種抗生素進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示氨芐西林的吸光度指數(shù)最高(0.54)，其次為哌拉西林-三唑巴坦(0.235)。除曲霉菌外，在其他真菌，尤其是青霉菌屬的生長(zhǎng)過(guò)程中也伴有GM的釋放。在細(xì)菌感染患者也可出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，但相關(guān)機(jī)制尚不清楚，可能與抗生素的使用有關(guān)，而且目前尚未發(fā)現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果與何種細(xì)菌感染之間存在必然的相關(guān)性[33,34]。

2 BG

BG占真菌胞壁成分的50%以上，由D-葡聚糖聚合而成，以β-1，3糖苷鍵連接的葡萄糖殘基骨架作為主鏈,分支狀β-1，6糖苷鍵連接的葡萄糖殘基作為側(cè)鏈。除結(jié)合菌(主要是根霉菌和毛霉菌)外,所有真菌胞壁成分中都含有BG，以酵母樣真菌含量最高,而其他微生物、動(dòng)物及人的細(xì)胞成分和細(xì)胞外液都不含BG。BG在真菌感染中的作用,可能與內(nèi)毒素在革蘭陰性桿菌感染中的作用類(lèi)似,可刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，并被迅速清除。當(dāng)真菌進(jìn)入血液或深部組織后,經(jīng)吞噬細(xì)胞的吞噬和消化等作用后,BG可從真菌細(xì)胞壁釋放，從而使血液及其他體液(如尿液、腦脊液、腹水和胸水等) 中的含量升高。當(dāng)真菌減少時(shí),機(jī)體免疫系統(tǒng)將其迅速清除，而在淺部真菌感染時(shí)則無(wú)類(lèi)似現(xiàn)象[35]。因此血漿BG水平升高已成為IFI的一個(gè)重要指標(biāo)。

20世紀(jì)90年代初發(fā)現(xiàn)，馬蹄鱟(主要是東方鱟和美洲鱟)凝血系統(tǒng)中的凝血酶原G因子能識(shí)別BG，是BG的天然檢測(cè)者。BG與G因子的α亞基特異性結(jié)合后可激活β亞基，從而旁路激活鱟實(shí)驗(yàn)(內(nèi)毒素主要激活的是鱟的凝血酶原C因子)此過(guò)程即為G實(shí)驗(yàn)。

目前市場(chǎng)上常用的試劑盒主要有兩種，日本的Fungitec-G glucan試劑和美國(guó)的Glucatell試劑。Fungitec-G glucan試劑主要成分是東方鱟的細(xì)胞裂解產(chǎn)物，其判斷標(biāo)準(zhǔn)為20 ng·L-1；而Glucatell試劑則使用了美洲鱟的細(xì)胞裂解產(chǎn)物作為主要原料，其判斷標(biāo)準(zhǔn)的爭(zhēng)議較多，目前推薦使用的判斷標(biāo)準(zhǔn)為60 ng·L-1。

Obayashi等[36]研究G實(shí)驗(yàn)在真菌感染和真菌性發(fā)熱中的診斷價(jià)值，檢測(cè)了202例標(biāo)本，100例有明確感染菌的患者中，37/41例(90%)確診真菌感染患者中G實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性,59例其他原因所致的發(fā)熱患者G實(shí)驗(yàn)均陰性；26/102例不明原因發(fā)熱患者G實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性；將陽(yáng)性結(jié)果判斷為真菌感染，則真菌感染判斷的陽(yáng)性率為59%,陰性率為97%，有效率為85%。Ostrosky-Zeichner 等[37]對(duì)170名健康志愿者和163例確診或可疑深部真菌感染患者進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示以≥60 ng·L-1為陽(yáng)性判定界值點(diǎn),其總敏感度為69.9%,特異度為87.1%,陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為83.5%，陰性預(yù)測(cè)值為75.1%；深部念珠菌感染患者中的陽(yáng)性率為81.3%，曲霉菌感染患者中的陽(yáng)性率為80%，隱球菌感染患者中的陽(yáng)性率為25%，毛霉菌和根霉菌感染患者檢測(cè)結(jié)果均為陰性。Odabasi等[38]檢測(cè)283例急性白血病或骨髓增生異常綜合征患者不同時(shí)間點(diǎn)的血標(biāo)本(在3周內(nèi)每例患者平均采集7次)，結(jié)果顯示以≥60 ng·L-1為陽(yáng)性判定界值點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)的敏感度和特異度分別為97%和90%～96%，陰性預(yù)測(cè)值為100%；所有真菌定植患者血漿BG水平均無(wú)顯著升高；所有確診或高度可疑IFI患者在出現(xiàn)明顯的臨床癥狀前，至少有1次G實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性，同時(shí)血清GM水平的變化有助于判斷抗真菌治療的效果。

G實(shí)驗(yàn)可作為IFI的一種有效篩查方法，具有早期診斷價(jià)值。目前主要用于侵襲性念珠菌、曲霉菌感染高危人群的監(jiān)測(cè)及療效和預(yù)后的評(píng)估。其不足之處在于：①陽(yáng)性結(jié)果只表示IFI，而不能確定是何種真菌；②不適用于結(jié)合菌和隱球菌感染的診斷，因根霉菌和毛霉菌胞壁中不含BG，隱球菌的胞壁中含量較少，且具有厚壁莢膜，不利于吞噬細(xì)胞的吞噬及抗原的釋放[37，39]；③白蛋白、丙種球蛋白、香菇多糖、磺胺類(lèi)藥物及血液透析等均可導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果。由于BG也存在于植物胞壁中，故纖維素類(lèi)物質(zhì)的使用可導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果(如手術(shù)中使用的紗布和血液透析時(shí)使用的某些纖維素制品)。輸注白蛋白和IVIG導(dǎo)致的G實(shí)驗(yàn)假陽(yáng)性可能與在血液制品的加工過(guò)程中使用的纖維素薄膜過(guò)濾器有關(guān)[39～42]。

G實(shí)驗(yàn)和ELISA檢測(cè)血清GM均可用于IA的診斷。Pazos 等[43]對(duì)40例中性細(xì)胞減少的IFI高?；颊咄瑫r(shí)進(jìn)行了G實(shí)驗(yàn)和ELISA檢測(cè)血清GM, 結(jié)果顯示兩者的敏感度和特異度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但發(fā)現(xiàn)G實(shí)驗(yàn)有先于ELISA檢測(cè)血清GM陽(yáng)性的傾向，同時(shí)檢測(cè)有助于識(shí)別假陽(yáng)性,可將特異度提高至100%。

3 隱球菌莢膜多糖抗原

隱球菌的莢膜由多糖構(gòu)成,利用LA檢測(cè)隱球菌莢膜多糖抗原是目前臨床上診斷隱球菌感染的最重要方法之一，已被廣泛應(yīng)用。

Bloomfild等[44]首先采用LA檢測(cè)血清和腦脊液中的隱球菌莢膜多糖抗原，其生化原理是抗隱球菌蛋白與隱球菌莢膜多糖抗原反應(yīng)可引起明顯的凝集現(xiàn)象，與正常蛋白則不引起凝集。目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道LA的敏感度為93%～100%,特異度為93%～98%,由于采用試劑盒不同,結(jié)果存在一定差異[45]。Antinori等[46]對(duì)多個(gè)國(guó)家以往隱球菌抗原檢測(cè)的報(bào)道進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，隱球菌抗原檢測(cè)腦脊液中的陽(yáng)性率為94.1%，在血清中的陽(yáng)性率為93.6%；在不同的免疫宿主人群中，隱球菌抗原檢測(cè)的敏感度稍有差異。在HIV陽(yáng)性的隱球菌腦膜炎患者中，血清和腦脊液中隱球菌抗原檢測(cè)的陽(yáng)性率分別為98.9%和92.2%；在HIV陰性的其他免疫功能缺陷的隱球菌腦膜炎患者中，血清和腦脊液中隱球菌抗原檢測(cè)的陽(yáng)性率分別為87.2%和97.7%；在免疫功能正常的隱球菌腦膜炎患者中，血清和腦脊液中隱球菌抗原檢測(cè)的陽(yáng)性率分別為92.3%和98.9%。

多項(xiàng)研究顯示，經(jīng)有效抗真菌治療后，臨床癥狀改善常伴有莢膜多糖抗原滴度的下降，而病情加重或復(fù)發(fā)患者則有滴度上升，因此利用LA檢測(cè)隱球菌的莢膜多糖抗原不僅有助于早期診斷，還可用于療效和預(yù)后的評(píng)估[47,48]。對(duì)于莢膜多糖抗原陽(yáng)性的患者，經(jīng)有效治療后,真菌培養(yǎng)和涂片轉(zhuǎn)陰，抗原滴度呈下降趨勢(shì)，但需要注意的是直至真菌培養(yǎng)、涂片全轉(zhuǎn)陰時(shí),多數(shù)患者的LA結(jié)果往往仍呈陽(yáng)性,考慮可能與死亡的隱球菌仍持續(xù)釋放莢膜多糖抗原,而機(jī)體清除此類(lèi)抗原相對(duì)緩慢有關(guān)[49]，提示在疾病后期抗原滴度的變化對(duì)治療的指導(dǎo)作用有限。同時(shí)有研究報(bào)道，莢膜多糖抗原陽(yáng)性在有隱球菌感染史AIDS患者的臨床意義難以確定，因?yàn)檫@種抗原血癥可持續(xù)存在數(shù)年之久，且抗原滴度的變化與有無(wú)復(fù)發(fā)之間無(wú)相關(guān)性[46,50]。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡、結(jié)節(jié)病、類(lèi)風(fēng)濕因子、巨球蛋白及毛孢子菌屬均與隱球菌莢膜多糖抗原存在交叉抗原,可引起假陽(yáng)性結(jié)果；操作過(guò)程中乳膠手套中的滑石粉也可引起假陽(yáng)性結(jié)果[51～53]。此外有報(bào)道在結(jié)核性腦膜炎患者也可出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，考慮可能與其血清中存在與隱球菌有交叉抗原的成分有關(guān)[52]。假陰性結(jié)果考慮與循環(huán)中的抗原水平尚低有關(guān)，在肺隱球菌病單獨(dú)存在而未發(fā)生肺外播散時(shí)，血清隱球菌抗原檢測(cè)可為陰性。高濃度隱球菌抗原所致的鉤帶現(xiàn)象和體內(nèi)未知非特異性蛋白，可對(duì)隱球菌抗原產(chǎn)生掩蓋效應(yīng),可引起假陰性結(jié)果[51～53]。此外還應(yīng)關(guān)注莢膜缺失的隱球菌所致慢性腦膜炎，此時(shí)也可呈假陰性結(jié)果[54]。

4 其他抗原成分

甘露糖廣泛存在于真菌胞壁中,是真菌胞壁的重要組成成分,在真菌致病過(guò)程中甘露糖參與了免疫調(diào)節(jié)和防御，同時(shí)抗甘露糖抗體具有保護(hù)性作用。Kume等[55]采用Pastorex 法檢測(cè)深部念珠菌血癥,其敏感度和特異度分別為91.7%和28.6%，但該法不與克柔念珠菌的甘露糖發(fā)生反應(yīng),故不能應(yīng)用于克柔念珠菌病的診斷。另外，由于甘露糖廣泛存在于各種真菌細(xì)胞中,導(dǎo)致該檢測(cè)方法特異度較低,限制了臨床應(yīng)用。

烯醇化酶(2-磷酸-D-甘油鹽水解酶)廣泛存在于真菌細(xì)胞中,目前研究較多的是念珠菌屬的烯醇化酶，其大量釋放與深部念珠菌感染有關(guān)。Walsh等[56]通過(guò)檢測(cè)血標(biāo)本白色念珠菌烯醇化酶抗原確定是否存在深部真菌感染，結(jié)果顯示敏感度為75.0%,特異度為95.9% 。但該酶抗原性強(qiáng)，在體內(nèi)清除較快，故檢測(cè)其抗體顯然更為有效。

Cand-Tec抗原是指可采用念珠菌屬檢測(cè)系統(tǒng)(一種顆粒凝集試驗(yàn)系統(tǒng)) 檢測(cè)的一類(lèi)念珠菌蛋白抗原,但文獻(xiàn)報(bào)道的敏感度和特異度不盡相同，加之類(lèi)風(fēng)濕因子可導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，目前其臨床應(yīng)用價(jià)值有限。

目前，侵襲性深部真菌感染的最終診斷仍需結(jié)合臨床及傳統(tǒng)的診斷方法。由于各種診斷方法均有其優(yōu)勢(shì)和局限性，將各種診斷方法結(jié)合可提高診斷的準(zhǔn)確性，尋找更具代表性的檢測(cè)物質(zhì)，廣泛利用新技術(shù)提高檢測(cè)速度、靈敏度和特異度，建立新的診斷方法，是IFI早期診斷研究的發(fā)展方向。因此，真菌抗原成分檢測(cè)對(duì)IFI的早期診斷具有重要價(jià)值，且可通過(guò)對(duì)抗原滴度變化的監(jiān)測(cè)來(lái)判斷疾病的嚴(yán)重程度、抗真菌治療的效果及預(yù)后。

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