農(nóng)藥對(duì)土壤微生物群落的副作用的研究方法

李少南

浙江大學(xué)農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所，杭州310029

1 引言

微生物群落對(duì)于土壤肥力的保持起著十分重要的作用.這種肥力多是通過(guò)對(duì)植物材料的分解和從空氣中固氮并與植物共生等微生物活動(dòng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的.近來(lái)人們還認(rèn)識(shí)到微生物群落在土壤適應(yīng)性進(jìn)化中的貢獻(xiàn).這種貢獻(xiàn)體現(xiàn)在對(duì)土壤微生物基因庫(kù)的維持，使土壤中能夠很快產(chǎn)生新的基因組，以應(yīng)對(duì)土壤使用方式的多樣性變化（Soulas and Lors,1999）.考慮到農(nóng)藥中的許多品種直接在土壤中使用，即使用于葉面處理的藥劑，使用后亦有70%~80%落在了土壤表面，人們關(guān)注它們對(duì)土壤微生物群落的影響就不難理解了.農(nóng)藥管理部門(mén)規(guī)定，用于農(nóng)藝、園藝、林業(yè)等的植物保護(hù)劑（即農(nóng)藥），生產(chǎn)商必須提供有關(guān)產(chǎn)品對(duì)土壤微生物群落影響的資料.這些資料必須足以闡明其產(chǎn)品在推薦劑量和方法下使用后對(duì)土壤微生物群落是否有不利影響；如果有，影響所持續(xù)的時(shí)間究竟有多長(zhǎng).

2 資料要求

化學(xué)品對(duì)土壤微生物群落的影響是多方面的，人們可以從不同角度進(jìn)行研究.Locke和Zablotowicz（2004）將研究終點(diǎn)歸納為3類(lèi)，即生物量（Biomass）、土壤酶活性（Soil enzyme activity）和氮素可礦化性（Mineralizable N）.美國(guó)California州環(huán)保署在最近起草的一份文獻(xiàn)中將研究終點(diǎn)歸納為4類(lèi)，即生物量（Biomass）、種群（Population）、活性（Activity）和多樣性（Diversity）.每一類(lèi)當(dāng)中又包含若干種不同的終點(diǎn)（OEHHA,2008）.對(duì)于這些終點(diǎn)的研究，有助于人們從不同側(cè)面了解農(nóng)藥對(duì)土壤微生物負(fù)面影響.從實(shí)踐角度，只有那些與風(fēng)險(xiǎn)管理目標(biāo)相對(duì)吻合的研究終點(diǎn)，才可能被納入風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的“資料要求”.

評(píng)估農(nóng)藥對(duì)土壤微生物的風(fēng)險(xiǎn)，其“資料要求”主要涉及微生物群落的“碳轉(zhuǎn)化（Carbon turnover）”和“氮轉(zhuǎn)化（Nitrogen turnover）”功能在暴露期間所受的影響（FAO,1981；1989；EPPO,2003）.所謂“碳轉(zhuǎn)化”是指土壤微生物轉(zhuǎn)化有機(jī)碳成為二氧化碳的能力.而所謂“氮轉(zhuǎn)化”是指土壤微生物通過(guò)氨化和硝化反應(yīng)轉(zhuǎn)化含氮有機(jī)物成為硝酸根的過(guò)程.“氮轉(zhuǎn)化”與“碳轉(zhuǎn)化”是關(guān)系密切的生命過(guò)程.對(duì)“氮轉(zhuǎn)化”的檢測(cè)，往往可以折射出待測(cè)物對(duì)土壤“碳轉(zhuǎn)化”能力的影響.因?yàn)榘被拖趸^(guò)程是緊隨有機(jī)物“碳—氮”鍵的斷裂而發(fā)生的.如果硝酸根的形成速率在處理和對(duì)照土之間沒(méi)有差異，則可以有把握地推斷，土壤的“碳轉(zhuǎn)化”功能沒(méi)有受到顯著影響（OECD,2000a）.

研究農(nóng)藥對(duì)土壤微生物的影響，既可以在室內(nèi)，也可以在溫室或田間進(jìn)行.所謂室內(nèi)試驗(yàn)，就是農(nóng)藥的添加、土壤微生物的暴露、功能檢測(cè)等環(huán)節(jié)均在室內(nèi)條件下進(jìn)行.溫室或田間試驗(yàn)與室內(nèi)試驗(yàn)的主要區(qū)別在于前兩者是將供試藥劑施用于田間，并在施藥后的不同時(shí)間選點(diǎn)取樣，然后在室內(nèi)完成功能檢測(cè).農(nóng)藥風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估試驗(yàn)一般從室內(nèi)開(kāi)始.對(duì)許多農(nóng)藥來(lái)說(shuō)，室內(nèi)試驗(yàn)已經(jīng)能夠滿足風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的需要.當(dāng)室內(nèi)試驗(yàn)證明農(nóng)藥對(duì)土壤微生物群落存在風(fēng)險(xiǎn)，或者風(fēng)險(xiǎn)性難以通過(guò)室內(nèi)試驗(yàn)加以判斷時(shí)，需要進(jìn)一步開(kāi)展溫室或田間試驗(yàn).

目前國(guó)內(nèi)外尚未制訂出與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估模型相配套的土壤微生物田間試驗(yàn)方法.農(nóng)藥管理機(jī)構(gòu)正在討論和醞釀制訂相關(guān)的試驗(yàn)準(zhǔn)則（EPPO,2003）.本文以室內(nèi)試驗(yàn)為例，對(duì)土壤微生物試驗(yàn)的方法學(xué)要素加以剖析.

3 試驗(yàn)要素

3.1 土樣

土壤中包含多種微生物.它們?cè)谕寥乐械年P(guān)系復(fù)雜，具有一定的抗外界干擾能力.外來(lái)化學(xué)品對(duì)土壤微生物群落某一部分造成損害，因此而喪失的功能，有可能被群落的另一部分所補(bǔ)償.現(xiàn)今人們普遍認(rèn)同，研究農(nóng)藥對(duì)土壤微生物的影響，其著眼點(diǎn)應(yīng)該放在群落的整體功能上.以土壤中分離的菌株作為研究對(duì)象時(shí)，雖然也能提供不少有關(guān)農(nóng)藥和土壤微生物相互作用的信息，但此類(lèi)信息并不能反映群落整體在土壤中的實(shí)際情況.因此人們?cè)谘芯哭r(nóng)藥對(duì)土壤微生物影響時(shí)，大多以具有微生物活性的土壤，而不是純培養(yǎng)的微生物菌株作為研究單位.

3.1.1 物理性能

土壤的一些物化特征，如粘粒含量、陽(yáng)離子代換量、pH值、有機(jī)質(zhì)含量等，會(huì)不同程度地影響農(nóng)藥在土壤中的吸附與揮發(fā)，進(jìn)而影響農(nóng)藥對(duì)土壤微生物的生物有效性（Bioavailability）.因此在大多數(shù)情況下，土壤微生物試驗(yàn)需要以一種以上的不同性質(zhì)的土樣（如砂土和壤土）作為試驗(yàn)材料.

美國(guó)EPA（1996）要求供試土樣達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)：pH 4~8、有機(jī)質(zhì)含量1%~8%、陽(yáng)離子代換量大于70meq·kg-1、砂粒（作者注——粒徑介于2~0.02mm之間）含量不超過(guò)70%.

OECD（2000a;2000b）給出了其對(duì)供試土樣的要求：砂粒含量介于50%~75%之間；pH值介于5.5~7.5之間；有機(jī)碳含量介于0.5%~1.5%之間；土樣的微生物碳含量不低于該土樣有機(jī)碳總含量的1%.

上述指標(biāo)范圍被OECD稱作是對(duì)土樣的“最差狀況（Worst cast situation）”.所謂“最差狀況”，意味著此類(lèi)土樣為農(nóng)藥提供了相對(duì)高的生物有效性.如果以該土樣作為測(cè)試單元，測(cè)得的農(nóng)藥影響不明顯，就無(wú)需用其他土樣再進(jìn)行測(cè)試（OECD, 2000a;2000b）.

3.1.2 土樣采集

OECD認(rèn)為取土深度應(yīng)該控制在土表以下0~ 20cm.如果在溫室或非耕地取土，深度可延伸到土表以下25cm.土樣最好取自谷類(lèi)作物（玉米除外）或密植的綠肥田.選中的田塊應(yīng)該停用農(nóng)藥至少1年，并且應(yīng)該至少6個(gè)月未使用化肥或至少3個(gè)月未使用有機(jī)肥（OECD,2000a;2000b）.

3.1.3 篩分和貯存

手工剔除土樣中的蚯蚓、節(jié)肢動(dòng)物、石子、植物根系等大塊雜質(zhì)（如果有的話）.然后將土樣晾置到可以過(guò)篩為止（對(duì)一般農(nóng)田土樣而言，此時(shí)的含水量大約為12%）.使土樣過(guò)2mm篩.調(diào)節(jié)土樣含水量至其飽和持水量的40%~60%.按上述步驟處理過(guò)的土樣，可在溫度（4±2）℃、通風(fēng)、避光的條件下貯存.但OECD認(rèn)為即使在上述條件下，土樣的貯存期最長(zhǎng)也不宜超過(guò)3個(gè)月，過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的貯存會(huì)使土壤微生物活性明顯下降，或使微生物區(qū)系的原始狀況發(fā)生改變（OECD,2000a;2000b）.

3.1.4 恢復(fù)培養(yǎng)

經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)時(shí)期貯存的土樣一般不能直接用于試驗(yàn)，而是應(yīng)該經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)幕謴?fù)性培養(yǎng)，以恢復(fù)貯存過(guò)程中喪失的土壤微生物活性.恢復(fù)培養(yǎng)是否達(dá)到預(yù)期的效果，應(yīng)該經(jīng)過(guò)適當(dāng)程序加以驗(yàn)證. OECD對(duì)恢復(fù)培養(yǎng)合格土樣的生物量指標(biāo)提出了以下要求，即土樣中微生物碳含量不低于該土壤有機(jī)碳總含量的1%（OECD,2000a；2000b）.

3.2 底物

底物的作用首先在于提高土樣中微生物的生物量，使之達(dá)到試驗(yàn)準(zhǔn)則所要求的水平.根據(jù)實(shí)際需要，底物既可在加藥前的恢復(fù)培養(yǎng)期，也可在加藥后的培育過(guò)程中添加.至于底物的種類(lèi)，OECD主張使用鮮苜蓿粉，由紫花苜蓿Medicago sativa制成，其C/N介于12/1~16/1之間，一般按照每kg干土5g的比率添加（OECD,2000a）.美國(guó)EPA推薦的底物是經(jīng)過(guò)0.6mm篩分選的苜蓿干粉.該底物添加率多為6%（w/w）（EPA,1996）.

除了用于提高微生物的生物量，底物還具有啟動(dòng)和刺激微生物功能發(fā)揮的作用.如OECD的“碳轉(zhuǎn)化”試驗(yàn)要求在每次測(cè)試中向每kg干重的土樣中添加高劑量（2000~4000mg）葡萄糖以刺激微生物的碳轉(zhuǎn)化活性（OECD,2000b）.

3.3 培育系統(tǒng)

3.3.1 培育容器

按照美國(guó)EPA（1996）的測(cè)試準(zhǔn)則，培育容器應(yīng)該能夠容納50g土樣，并且具有足夠的換氣空間（100mL左右的玻璃廣口瓶能滿足這方面要求）.如果土樣的用量增加，容器的體積應(yīng)該相應(yīng)擴(kuò)大.為了減少容器內(nèi)的水分散失，瓶口可用聚乙烯薄膜等覆蓋，但是這種覆蓋不應(yīng)該過(guò)分阻隔空氣流通；也可以將瓶口完全敞開(kāi)，每隔一定時(shí)間（如7d）補(bǔ)充一次水份，以恢復(fù)土壤含水量到起始水平.

3.3.2 加藥方式

水溶性原藥和可以在水中分散的農(nóng)藥制劑，如乳油、可濕性粉劑、水乳劑、懸浮劑等，可以直接用水稀釋，然后使稀釋液與土樣混勻.

如果藥劑難溶于水，又難以直接與土樣混合，可先用少量有揮發(fā)性機(jī)溶劑（如丙酮、氯仿）將其溶解，再將藥液涂布在少量細(xì)土或石英細(xì)砂（粒徑0.1~0.5mm）表面，待溶劑揮發(fā)后，將吸附有藥劑的細(xì)土或石英細(xì)砂進(jìn)一步分散到土樣中去.注意不可將溶解于有機(jī)溶劑的藥液直接與土樣混合.因?yàn)檫@樣做有可能會(huì)破壞土樣中微生物區(qū)系的完整性.

有些內(nèi)含石礫核心的顆粒劑，由于體積較大而難以與土樣均勻混合.遇到這種情形，可先用水或有機(jī)溶劑將外包物洗脫，再做下一步處理.

3.3.3 劑量設(shè)置

如果農(nóng)藥在環(huán)境中的起始濃度可以推測(cè)，應(yīng)優(yōu)先以起始環(huán)境濃度為依據(jù)進(jìn)行測(cè)試；反之，當(dāng)環(huán)境濃度無(wú)法推測(cè)時(shí)，人們可以主觀地選擇一系列濃度進(jìn)行測(cè)試，直至獲得 EC50數(shù)值（EPA,1996; OECD,2000a;2000b）.

起始環(huán)境濃度的推測(cè)，一般以施藥劑量為依據(jù).如此推測(cè)時(shí)，OECD認(rèn)為可以設(shè)定施用的藥劑100%進(jìn)入土壤，并且均勻分布于地表0~5cm的土層，土壤密度為1.5g·cm-3（OECD,2000a;2000b）.

OECD認(rèn)為農(nóng)藥的測(cè)試劑量至少應(yīng)該包括“推測(cè)環(huán)境濃度（Predicted Environmental Concentration, PEC）”以及PEC的5倍濃度.對(duì)于那些多次使用的藥劑，可以考慮以PEC乘以使用次數(shù)的模式確定最高測(cè)試濃度.然而最高測(cè)試劑量不必超過(guò)單次用藥PEC的10倍（OECD,2000a;2000b）；

美國(guó)EPA的測(cè)試準(zhǔn)則規(guī)定，農(nóng)藥試驗(yàn)可選擇PEC的0.1倍、1.0倍和10倍作為測(cè)試劑量.若采用主觀設(shè)定的系列濃度法進(jìn)行測(cè)定，最高測(cè)試濃度一般不超過(guò)1000mg·kg-1（干土）.EPA認(rèn)為在1000mg·kg-1（干土）的測(cè)試濃度下，如果供試藥劑對(duì)土壤微生物活性的抑制率低于50%，試驗(yàn)即可終止（EPA,1996）；

蔡道基等（1986）根據(jù)我國(guó)當(dāng)時(shí)的農(nóng)藥平均使用量，提出采用1、10、100mg·kg-13個(gè)濃度進(jìn)行測(cè)試.考慮到不同農(nóng)藥田間用量的差別，國(guó)家環(huán)保局在稍后制定的《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》中對(duì)此項(xiàng)內(nèi)容做了修改，主張以農(nóng)藥常用量（即推薦的最大用量）、常用量的10倍量、常用量的100倍量時(shí)表層土壤中農(nóng)藥的推測(cè)含量作為測(cè)試劑量（蔡道基，1989）.

微生物試驗(yàn)的每一濃度組（包括對(duì)照）應(yīng)該設(shè)置重復(fù).美國(guó)EPA要求每一濃度組設(shè)5個(gè)重復(fù)（EPA,1996）.OECD認(rèn)為每一濃度組至少需設(shè)3個(gè)重復(fù)（OECD,2000a；2000b）.

3.3.4 培育條件

溫度方面，OECD準(zhǔn)則規(guī)定藥劑處理過(guò)的土樣應(yīng)該在20℃下培育，培育期間的溫度變幅不應(yīng)超過(guò)±2℃（OECD,2000a；2000b）.美國(guó)EPA推薦的培育溫度為22℃（EPA,1996）.也可以將試驗(yàn)當(dāng)?shù)赝寥牢⑸镒顬檫m應(yīng)的生長(zhǎng)溫度作為活性土壤的培育溫度（EPA,1996；OECD,2000a；2000b）.我國(guó)的化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則將25℃作為活性土壤的培育溫度（蔡道基，1989）.

濕度方面，以旱地微生物區(qū)系作為研究對(duì)象時(shí)，土壤的培育濕度一般控制在飽和持水量的40%~60%（OECD,2000a;2000b）或者10kPa（EPA, 1996）.如果試驗(yàn)對(duì)象涉及藻類(lèi)，培育濕度可以提高到土壤的飽和持水量.“氮轉(zhuǎn)化”試驗(yàn)中可采用的土樣培育方法有兩種：即“散裝培育”或“分裝培育”.一個(gè)處理的“散裝培育”土樣包含多個(gè)分樣，在整個(gè)培育過(guò)程中，各分樣可以被分批采集；而一個(gè)處理的“分裝培育”土樣中只包含一個(gè)分樣，該分樣只能在培育終結(jié)時(shí)采集.在加藥操作上，“散裝培育”具有省工的優(yōu)點(diǎn)，也有助于減少試驗(yàn)誤差.但是如果供試藥劑揮發(fā)性較強(qiáng)，“分裝”則被認(rèn)為是唯一可供選擇的培育方式（OECD,2000a; 2000b）.

培育過(guò)程中一般要避免光照.這樣做一方面為了避免農(nóng)藥見(jiàn)光分解，另一方面可以抑制土壤中藻類(lèi)的生長(zhǎng).

3.3.5 取樣規(guī)劃

對(duì)于農(nóng)藥類(lèi)化學(xué)品，OECD規(guī)定土壤微生物試驗(yàn)的持續(xù)時(shí)段至少應(yīng)達(dá)到28d.土樣（包括分樣）的采集應(yīng)該在藥劑處理后的第0d、第7d、第14d和第28d進(jìn)行.在對(duì)第28d的樣品進(jìn)行檢測(cè)后，如果發(fā)現(xiàn)處理組和對(duì)照組土壤微生物活性的差異超過(guò)25%，OECD認(rèn)為應(yīng)適當(dāng)延長(zhǎng)試驗(yàn)周期，直至處理組和對(duì)照組土壤微生物活性的差異低于25%，但延長(zhǎng)的最大時(shí)限不應(yīng)超過(guò) 100d（OECD,2000a; 2000b）.

對(duì)于非農(nóng)藥類(lèi)化學(xué)品，OECD將試驗(yàn)持續(xù)的時(shí)段設(shè)定為28d，在第7d和第28d取土樣或采集分樣，利用第28d的數(shù)據(jù)計(jì)算ECx值（OECD,2000a; 2000b）.

將美國(guó)EPA試驗(yàn)持續(xù)的時(shí)段設(shè)定為28d，土樣或分樣的采集在第5d和第28d進(jìn)行，利用第28d的數(shù)據(jù)計(jì)算ECx值（EPA,1996）.

我國(guó)的《化學(xué)農(nóng)藥環(huán)境安全評(píng)價(jià)試驗(yàn)準(zhǔn)則》規(guī)定15d作為農(nóng)藥對(duì)土壤微生物影響的一個(gè)試驗(yàn)周期，取樣在藥劑處理后的第0d、第5d、第10d和第15d進(jìn)行（蔡道基，1989）.

3.3.6 系統(tǒng)質(zhì)量要求

土壤微生物試驗(yàn)結(jié)果多是以處理組相對(duì)于對(duì)照組功能的下降率（±25%）作為評(píng)判依據(jù)，若試驗(yàn)組內(nèi)各重復(fù)之間的測(cè)定值差異過(guò)大，將會(huì)影響對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的評(píng)判.OECD規(guī)定對(duì)照組內(nèi)各重復(fù)間的測(cè)定值差異不應(yīng)超過(guò)±15%（OECD,2000a; 2000b）.

3.4 檢測(cè)方法

3.4.1 “氮轉(zhuǎn)化”

微生物的“氮轉(zhuǎn)化”活性，通常以有機(jī)氮轉(zhuǎn)化為NH4+的速率和/或NH4+轉(zhuǎn)化為NO3-的速率來(lái)表示.而農(nóng)藥對(duì)“氮轉(zhuǎn)化”活性的影響則通過(guò)處理組相對(duì)于對(duì)照組NH4+和/或NO3-生成的下降率來(lái)表示.為此需要將土樣中的NH4+和NO3-加以提取. OECD和美國(guó)EPA分別給出了NH4+和NO3-的提取方法：

按照OECD試驗(yàn)準(zhǔn)則，將5mL 0.1mol·L-1的KCl加入相當(dāng)于1g干重的土樣，初步搖動(dòng)后，將混合液置于150rpm的搖床上振蕩60min，離心，取上清液，測(cè)定其中NH4+和NO3-濃度.來(lái)不及測(cè)定的上清液可在室溫（20±5）℃下保存，OECD認(rèn)為貯存期不宜超過(guò)6個(gè)月（OECD,2000a）.

按照美國(guó)EPA的試驗(yàn)準(zhǔn)則，將80mL 0.1mol· L-1的KCI加入內(nèi)含相當(dāng)于50g干重土樣的試驗(yàn)容器中.初步搖動(dòng)后，將容器至于搖床上繼續(xù)振蕩1h，提取液經(jīng)低氮濾紙（如Whatman 42號(hào)定量濾紙） 過(guò)濾后，用于 NO3-或 NH4+檢測(cè)（EPA, 1996）.

NO3-和NH4+檢測(cè)方法很多.具體可參見(jiàn)嚴(yán)昶生（1988）.

3.4.2 “碳轉(zhuǎn)化”

微生物的“碳轉(zhuǎn)化”活性通常以土壤在單位時(shí)間內(nèi)對(duì)氧氣的吸收率或?qū)Χ趸坚尫怕蕘?lái)表示.而農(nóng)藥土壤微生物“碳轉(zhuǎn)化”活性的影響，可通過(guò)處理組相對(duì)于對(duì)照組氧氣的吸收或?qū)Χ趸坚尫诺南陆德蕘?lái)衡量.

對(duì)于二氧化碳釋放，美國(guó)EPA推薦在氣體流通狀態(tài)下測(cè)量.其原理是將內(nèi)含土樣并經(jīng)過(guò)一段時(shí)間密閉的培育容器，經(jīng)由進(jìn)、出氣體的兩個(gè)通道，分別與氣泵和紅外氣體檢測(cè)器（Infrared gas analysis,IRGA）相連.通道上分別安裝有可控開(kāi)關(guān).氣泵提供的不含二氧化碳的濕潤(rùn)氣流通過(guò)進(jìn)氣通道進(jìn)入培育容器，氣流攜帶土壤呼吸作用釋放出的二氧化碳，經(jīng)出氣通道和干燥器而到達(dá)IRGA.在氣體的流速確定的前提下，土樣在容器內(nèi)的密閉培養(yǎng)時(shí)間需要通過(guò)預(yù)試驗(yàn)加以調(diào)節(jié)，使出氣通道內(nèi)二氧化碳的分壓與IRGA的檢測(cè)靈敏度相匹敵，同時(shí)又不會(huì)因?yàn)槊荛]培養(yǎng)而使容器內(nèi)氧氣過(guò)多下降，以致影響土壤微生物的正常生長(zhǎng). EPA認(rèn)為密閉培養(yǎng)的時(shí)間以 1~77h為宜（EPA, 1996）.

為了刺激土樣的瞬時(shí)呼吸率，OECD推薦在每一測(cè)試之前按2000~4000mg·kg-1（干土）的量向土樣中添加葡萄糖，經(jīng)過(guò)12h左右密閉培養(yǎng)之后加以測(cè)定（OECD,2000b）.

除了使用IRGA，土壤呼出的二氧化碳還可以用氫氧化鈉吸收，再通過(guò)滴定或氣相色譜法檢測(cè).我國(guó)國(guó)家環(huán)保局推薦了一種簡(jiǎn)易的土壤二氧化碳吸收裝置，目前被我國(guó)的農(nóng)藥登記試驗(yàn)單位普遍采用（蔡道基，1989）.該裝置以密閉的廣口瓶作為培養(yǎng)容器.植入土樣的同時(shí)，每只廣口瓶中放入一只盛有5mL NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的小燒杯，再將整個(gè)廣口瓶移至（25±1）℃的恒溫箱中培養(yǎng).至于取樣計(jì)劃，起初是在試驗(yàn)開(kāi)始后的第0d、第5d、第10d和第15d進(jìn)行（蔡道基，1989），后來(lái)變更為試驗(yàn)后的第1d、第2d、第4d、第7d、第11d和第15d.此處所謂“取樣”，是指從密閉廣口瓶中取出培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)（第0d）放置的小燒杯，同時(shí)將一個(gè)新的小燒杯放在原來(lái)位置以繼續(xù)CO2的吸收.“取樣”的同時(shí)也更換了廣口瓶中的空氣，不至于使瓶中氧氣分壓下降到明顯影響土壤呼吸作用的程度.

堿液中吸收的CO2可以參考中科院南京土壤研究所微生物室（1985）的方法進(jìn)行測(cè)量.

目前我國(guó)室內(nèi)測(cè)量農(nóng)藥對(duì)土壤“碳轉(zhuǎn)化”的影響，其測(cè)量終點(diǎn)與OECD和美國(guó)EPA的稍有不同：前者測(cè)的是土壤微生物在整個(gè)溫育時(shí)段（如0~1d、0~2d、0~4d、0~7d、0~11d、0~15d）的“碳轉(zhuǎn)化”效率，而后者測(cè)的是土壤微生物在溫育的某一時(shí)間點(diǎn)（如第0d、第7d、第14d、第28d）的“碳轉(zhuǎn)化”效率.除了作用強(qiáng)度，農(nóng)藥在土壤中發(fā)揮作用的時(shí)間也是衡量其對(duì)微生物影響的一個(gè)重要因素.我國(guó)以整個(gè)暴露時(shí)段內(nèi)土壤二氧化碳的釋放量作為測(cè)量終點(diǎn)，從這一點(diǎn)上看，具有其合理的一面.但是在溫室和田間試驗(yàn)中，人們很難進(jìn)行類(lèi)似的測(cè)定，而比較容易測(cè)量土壤微生物在試驗(yàn)階段的某一時(shí)間點(diǎn)的碳轉(zhuǎn)化效率，因此OECD和美國(guó)EPA的測(cè)量方法可用于不同層次間的試驗(yàn)，也易于試驗(yàn)結(jié)果的相互比較.

3.5 評(píng)價(jià)

Johnen和Drew早在1977就年提出了一套以功能的恢復(fù)時(shí)間作為關(guān)注水平（Level of concerns, LOCs）的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系.此體系中，對(duì)于室內(nèi)試驗(yàn)和野外試驗(yàn)而言，恢復(fù)時(shí)間<15d和<30d，為無(wú)風(fēng)險(xiǎn)；恢復(fù)時(shí)間15~30d和30~60d，為略有風(fēng)險(xiǎn)但可以忍受；>30d和>60d，為有風(fēng)險(xiǎn).比如某一農(nóng)藥對(duì)土壤微生物的影響需要20d恢復(fù)，對(duì)于野外試驗(yàn)而言，該農(nóng)藥屬于“無(wú)風(fēng)險(xiǎn)”等級(jí)，對(duì)于室內(nèi)試驗(yàn)，該農(nóng)藥則屬于“略有風(fēng)險(xiǎn)但可以忍受”.Johnen和Drew評(píng)估體系，其室內(nèi)試驗(yàn)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)于室外.之所以如此設(shè)置，目的在于防止室內(nèi)試驗(yàn)出現(xiàn)“假陰性”結(jié)果：如果室內(nèi)試驗(yàn)證明農(nóng)藥對(duì)土壤微生物“無(wú)風(fēng)險(xiǎn)”，風(fēng)險(xiǎn)也不可能在野外發(fā)生；反之，如果室內(nèi)試驗(yàn)顯示農(nóng)藥對(duì)土壤微生物“有風(fēng)險(xiǎn)”，可以進(jìn)一步開(kāi)展溫室或田間試驗(yàn)，以確認(rèn)類(lèi)似的風(fēng)險(xiǎn)是否會(huì)在野外發(fā)生.Johnen和Drew的這一評(píng)估體系得到了聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（FAO）的認(rèn)可（FAO, 1981）.凡以環(huán)境濃度為依據(jù)的試驗(yàn)，其結(jié)果均可應(yīng)用該體系進(jìn)行評(píng)估.

在微生物風(fēng)險(xiǎn)的評(píng)估中，聯(lián)邦農(nóng)林生物研究中心（Biologische Bundesanstalt für Land-und Forstwirtschaft,BBA）將對(duì)照組和處理組微生物活性的差異作為關(guān)注目標(biāo).它為室內(nèi)和野外試驗(yàn)設(shè)定的LOCs分別是15%和25%.按照這套評(píng)估體系，在歷時(shí)不超過(guò)90d的室內(nèi)暴露之后，對(duì)照組和處理組之間土壤微生物活性的差異如果低于15%，供試藥劑對(duì)微生物的影響被認(rèn)為“可以接受”；反之，如果差異超過(guò)15%，則需要進(jìn)一步開(kāi)展溫室或田間試驗(yàn).BBA規(guī)定的溫室或田間試驗(yàn)歷時(shí)不超過(guò)120d.通過(guò)試驗(yàn)，對(duì)照組和處理組之間土壤微生物活性的差異如果低于25%，供試藥劑的影響被認(rèn)為“可以接受”，如果差異超過(guò)25%，供試藥劑則被認(rèn)為對(duì)土壤微生物有不良影響.為了消除或減輕這種不良影響，農(nóng)藥管理部門(mén)或許會(huì)對(duì)該藥劑的使用范圍施加某種限制（Ehle,1993）.

歐洲和地中海植保組織 （European and Mediterranean Plant Protection Organization,EPPO）將農(nóng)藥的土壤微生物風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)進(jìn)行了如下劃分并給出了相應(yīng)的處理意見(jiàn)（EPPO,2003）：1）通過(guò)28d的室內(nèi)暴露，如果處理組相對(duì)于對(duì)照組土壤微生物活性的差異未超過(guò)25%，該藥劑被認(rèn)為“低風(fēng)險(xiǎn)”；2）通過(guò)28d的室內(nèi)暴露，如果處理組相對(duì)于對(duì)照組土壤微生物活性的差異達(dá)到或超過(guò)25%，應(yīng)該延長(zhǎng)暴露時(shí)間進(jìn)一步測(cè)試，但最終的暴露時(shí)間不應(yīng)超過(guò)100d；3）延長(zhǎng)暴露時(shí)間后，如果處理組相對(duì)于對(duì)照組土壤微生物活性的差異未超過(guò)25%，該藥劑被認(rèn)為具有“中等風(fēng)險(xiǎn)”；反之，如果處理組相對(duì)于對(duì)照組土壤微生物活性的差異達(dá)到或超過(guò)25%，該藥劑被認(rèn)為具有“高風(fēng)險(xiǎn)”；4）對(duì)于室內(nèi)判斷為“高風(fēng)險(xiǎn)”的藥劑，一般需開(kāi)展溫室或田間試驗(yàn)，以明確供試藥劑在實(shí)際應(yīng)用中的風(fēng)險(xiǎn)程度、范圍和持續(xù)時(shí)間.

蔡道基等（1986）針對(duì)15d室內(nèi)試驗(yàn)提出了毒性等級(jí)劃分的下列標(biāo)準(zhǔn)：1）在1mg·kg-1（干土）的試驗(yàn)濃度下，如果處理組相對(duì)于對(duì)照組的土壤微生物活性下降率達(dá)到或超過(guò)50%，供試藥劑對(duì)土壤微生物“高毒”；2）在10mg·kg-1（干土）的試驗(yàn)濃度下，如果處理組相對(duì)于對(duì)照組的土壤微生物活性下降率未達(dá)到50%，供試藥劑對(duì)土壤微生物“低毒”；3）在10mg·kg-1（干土）的試驗(yàn)濃度下，處理組相對(duì)于對(duì)照組的土壤微生物活性下降率達(dá)到或超過(guò)50%，而在1mg·kg-1（干土）的試驗(yàn)濃度下，如果處理組相對(duì)于對(duì)照組的土壤微生物活性下降率未達(dá)到50%，供試藥劑對(duì)土壤微生物具有“中等毒性”.

上述劃分主要基于以下假設(shè)：1）大多數(shù)農(nóng)藥的最高田間用量不超過(guò)750g·hm-1；2）均勻施用的農(nóng)藥大多分布在距地表0~5cm、容重為1.5g·cm-3的土層中；3）基于上述兩個(gè)假設(shè)大多數(shù)農(nóng)藥在土壤中的最高起始濃度不超過(guò)1mg·kg-1干土；4）在最高起始濃度下，如果處理組相對(duì)于對(duì)照組的土壤微生物活性下降幅度達(dá)到或超過(guò)50%，說(shuō)明該農(nóng)藥對(duì)土壤微生物“高毒”；5）在“條施”或“點(diǎn)施”等特殊施藥條件下，農(nóng)藥在農(nóng)田中的分布面積僅有均勻施藥時(shí)的1/10，或者說(shuō)農(nóng)藥在局部農(nóng)田中的最高起始濃度可能達(dá)到均勻施藥時(shí)的10倍，即10mg·kg-1（干土）.在此前提下，如果處理組相對(duì)于對(duì)照組的土壤微生物活性下降幅度未能達(dá)到50%，說(shuō)明該農(nóng)藥對(duì)對(duì)土壤微生物“低毒”.

衡量農(nóng)藥對(duì)土壤微生物的影響，除抑制程度之外，抑制作用所持續(xù)的時(shí)間具有同樣重要的意義.蔡道基等（1986）綜合抑制程度、抑制所持續(xù)的時(shí)間，以及造成該抑制所需的暴露濃度三方面因素，提出使用“危害系數(shù)”評(píng)估農(nóng)藥對(duì)土壤微生物影響的設(shè)想.“危害系數(shù)”，可由下列公式來(lái)計(jì)算：

農(nóng)藥的“危害系數(shù)”可以被劃分成下列3個(gè)等級(jí)：1）“危害系數(shù)”≥200，具有“嚴(yán)重危害”；2）200>“危害系數(shù)”≥20.0，具有“中等危害”；3）“危害系數(shù)”<20.0，“無(wú)實(shí)際危害”.

上述劃分的主要依據(jù)是：1）在1mg·kg-1（干土）的濃度下，經(jīng)過(guò)120d（即4個(gè)月，相當(dāng)于1個(gè)生長(zhǎng)季）的暴露期，如果處理組相對(duì)于對(duì)照組的土壤微生物活性下降幅度仍然能夠達(dá)到或超過(guò)50%，說(shuō)明該農(nóng)藥對(duì)對(duì)土壤微生物具有“嚴(yán)重危害”；2）在10mg·kg-1（干土）的濃度下，經(jīng)過(guò)120d的暴露期，如果處理組相對(duì)于對(duì)照組的土壤微生物活性下降幅度未能達(dá)到50%，說(shuō)明該農(nóng)藥對(duì)對(duì)土壤微生物“無(wú)實(shí)際危害”；3）在10mg·kg-1（干土）的濃度下，經(jīng)過(guò)120d的暴露期，處理組相對(duì)于對(duì)照組的土壤微生物活性下降幅度達(dá)到或超過(guò)50%，但是在1mg·kg-1（干土）的濃度下，經(jīng)過(guò)同樣的暴露期，處理組相對(duì)于對(duì)照組的土壤微生物活性下降幅度未能達(dá)到50%，說(shuō)明該農(nóng)藥對(duì)對(duì)土壤微生物具有“中等危害”.

“危害系數(shù)”可用于田間試驗(yàn)的結(jié)果評(píng)估.需要指出的是，為計(jì)算“危害系數(shù)”所開(kāi)展的田間試驗(yàn)，其持續(xù)時(shí)間應(yīng)該是120d，而不是室內(nèi)試驗(yàn)所采用的15d.

研究和確定農(nóng)藥對(duì)土壤微生物的影響，是農(nóng)藥生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)管理的客觀需要.而關(guān)注這方面問(wèn)題，是農(nóng)藥環(huán)境毒理學(xué)向生態(tài)毒理學(xué)發(fā)展的一個(gè)重要標(biāo)志.針對(duì)土壤微生物的化學(xué)品評(píng)估試驗(yàn)，無(wú)論在室內(nèi)、溫室，還是在田間進(jìn)行，均屬于系統(tǒng)層次的研究.室內(nèi)就相當(dāng)于一個(gè)土壤微宇宙試驗(yàn).此類(lèi)試驗(yàn)之所以選擇功能性指標(biāo)作為測(cè)試終點(diǎn)，是因?yàn)檫@類(lèi)指標(biāo)是土壤生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)和能量循環(huán)水平以及系統(tǒng)抗脅迫能力的集中體現(xiàn).對(duì)土壤微生物而言，以室內(nèi)試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)其在野外可能受到的影響，比起其他類(lèi)型的非靶標(biāo)生物做類(lèi)似推測(cè)時(shí)的結(jié)果可靠性要強(qiáng)得多.室內(nèi)試驗(yàn)關(guān)鍵的一點(diǎn)，是要保持土樣中微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的完整性，在試驗(yàn)過(guò)程中不會(huì)受到藥劑以外的因素的破壞.

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