千層塔NFT扦插育苗技術(shù)研究

覃大吉，楊永康，向極釬，曾凡忠，李亞杰，殷紅清，鄒迎春，馬 進(jìn)

(1. 湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心鄂西綜合試驗站,湖北 恩施 445000；2.恩施清江生物工程有限公司，湖北 恩施 445000)

千層塔(Huperziaserrata(Thunb.) Trev.)為石杉科植物蛇足石杉[1]，千層塔全草入藥，民間主治癰癤腫毒，跌打損傷[2].1972年國內(nèi)首次報道該植物的生物堿石杉堿甲(HuPerzine A.)在動物試驗上有橫紋肌松弛作用[3]，隨后又發(fā)現(xiàn)石杉堿甲對老年性癡呆、重癥肌無力和記憶力減退等疾病具有良好的治療效果[4,5].

千層塔植株頂端具有生殖芽，落地可生根成新苗.長有孢子囊，成腎形，淡黃色，橫生葉腋，成熟時撒出孢子粉[6].主要分布在東北、長江流域以南等地區(qū)的山區(qū)林下陰濕處，野生條件下通過孢子和生殖芽繁殖，但鑒于孢子萌發(fā)周期長，萌發(fā)后屬地下生配子體，需6～15年才能成熟[7].雖然我國蛇足石杉資源分布區(qū)域廣闊且生物量較大，但分布星散，資源更新周期較長，可供開采的天然資源可能比估計的開采量還要小，因此，直接采收天然資源是不太可行的利用途徑，而要從根本上解決蛇足石杉資源短缺問題，則有必要尋求比較科學(xué)合理的開發(fā)利用方式[8].有些學(xué)者認(rèn)為孢子人工繁殖和生物技術(shù)離體繁殖方法是解決石杉堿甲藥源稀缺問題的較好的途徑[9].野外觀察發(fā)現(xiàn)，千層塔通過生殖芽繁殖的現(xiàn)象也極少，因此極大地限制了千層塔野生資源的再生.野生資源也不能滿足市場需求，有必要尋找一條快速大量繁殖千層塔的途徑.本試驗試圖通過對千層塔扦插的研究，找到一條能提前千層塔插條生根，并提高生根率的繁殖途徑，在不影響人工栽培千層塔藥材產(chǎn)量的同時達(dá)到大量快速繁殖千層塔種苗的目的.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗植物材料 野生千層塔資源的種兜、莖段、莖梢、枝條若干.

1.1.2 試驗其它材料 自制植物無土栽培NFT(nutrient film techniquey)育苗床(儲液池：10L)三臺(套)、84消毒液、MS大量元素母液、MS微量元素母液、EDTA-鐵鹽，IAA(吲哚乙酸)、NAA(萘乙酸)、IBA(吲哚乙酸)、2，4-D(2-，4-二氯苯氧乙酸)等.

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計 采用隨機(jī)區(qū)組法設(shè)置試驗處理，重復(fù)3次，共68個處理(含4個對照)，每個處理100個樣本.處理編碼如下：

營養(yǎng)配方:Y1(1/8MS),Y2(1/4MS)

激素種類:J1(IAA),J2(NAA),J3(IBA),J4(2，4-D)

激素處理濃度(mg/L):C1(1 000 mg/L濃度激素浸泡20 min),C2(500 mg/L濃度激素浸泡20 min)

外植體:Z1(種兜)，Z2(莖段)，Z3(莖梢)，Z4(枝條)

處理編碼：Y1J1C1Z1，Y1J1C1Z2，Y1J1C1Z3，Y1J1C1Z4；Y1J1C2Z1，Y1J1C2Z2，Y1J1C2Z3，Y1J1C2Z4；

Y1J2C1Z1，Y1J2C1Z2，Y1J2C1Z3，Y1J2C1Z4；Y1J2C2Z1，Y1J2C2Z2，Y1J2C2Z3，Y1J2C2Z4；

Y1J3C1Z1，Y1J3C1Z2，Y1J3C1Z3，Y1J3C1Z4；Y1J3C2Z1，Y1J3C2Z2，Y1J3C2Z3，Y1J3C2Z4；

Y1J4C1Z1，Y1J4C1Z2，Y1J4C1Z3，Y1J4C1Z4；Y1J4C2Z1，Y1J4C2Z2，Y1J4C2Z3，Y1J4C2Z4；

Y2J1C1Z1，Y2J1C1Z2，Y2J1C1Z3，Y2J1C1Z4；Y2J1C2Z1，Y2J1C2Z2，Y2J1C2Z3，Y2J1C2Z4；

Y2J2C1Z1，Y2J2C1Z2，Y2J2C1Z3，Y2J2C1Z4；Y2J2C2Z1，Y2J2C2Z2，Y2J2C2Z3，Y2J2C2Z4；

Y2J3C1Z1，Y2J3C1Z2，Y2J3C1Z3，Y2J3C1Z4；Y2J3C2Z1，Y2J3C2Z2，Y2J3C2Z3，Y2J3C2Z4；

Y2J4C1Z1，Y2J4C1Z2，Y2J4C1Z3，Y2J4C1Z4；Y2J4C2Z1，Y2J4C2Z2，Y2J4C2Z3，Y2J4C2Z4；

對照編碼：Y0J0C0Z1，Y0J0C0Z2，Y0J0C0Z3，Y0J0C0Z4(營養(yǎng)元素、激素濃度均為零處理)

1.2.2 試驗實施

1.2.2.1 營養(yǎng)液配制 在植物組織培養(yǎng)室儲存的MS培養(yǎng)基母液(1 000∶1)中直接用移液管加入2.5 mL大量元素和2.5 mL微量元素配制成供1個NFT育苗床(儲液池：10 L)使用的1/4MS營養(yǎng)液，臨時配制并添加相應(yīng)濃度的鐵鹽；量取1.25 mL大量元素和1.25 mL微量元素配制成供1個NFT育苗床(儲液池：10 L)使用的1/8MS營養(yǎng)液，臨時配制并添加相應(yīng)濃度的鐵鹽.

1.2.2.2 激素配制 激素為IAA、NAA、IBA、2，4-D.配制時分別用95%的乙醇溶解后再用蒸餾水稀釋成1 000 mg/L(C1)和500 mg/L(C2)的濃度備用.

1.2.2.3 植物樣本處理 首先用自來水清洗植物樣本，涼干.操作人員清洗雙手，消毒，然后剪取均勻一致的莖段、莖梢和枝條各1 700個，分別扎成小捆(100個/捆)，選留種兜1 700個，以每100個為1組.將莖段、莖梢、枝條各8捆和8組種兜按C1的方法進(jìn)行處理，將另外莖段、莖梢、枝條各8捆和8組種兜按C2的方法進(jìn)行處理.將莖段、莖梢、枝條各1捆和1組種兜采用對照處理方式處理相同的時間并涼干.

1.2.2.4 NFT育苗床制作與移栽 NFT育苗床制作：長6.0 m，寬1.25 m，高0.5 m，床體用高1.2 m的床架支撐.育苗床一端中間的底部為進(jìn)液口，與儲液池(長×寬×高=1.0 dm×2.0 dm×5.0 dm)的潛水泵(15.0 W)相連，育苗床另一端中間的底部為出液口，與儲液池相連，進(jìn)液口端底部比出液口端底部高6.0 cm，以便于營養(yǎng)液自動回流至儲液池.育苗床內(nèi)部底面鋪設(shè)園藝無紡布，無紡布上面墊一層50目的塑料過濾網(wǎng)，過濾網(wǎng)內(nèi)填充厚度為40 cm的珍珠巖，珍珠巖中按一定密度鑲嵌著從定植板放下來的網(wǎng)格式定植杯(D上=1.8 cm，D下=1.2 cm,H=5.0 cm).床面放置厚度為2 cm的泡沫定植板，定植板上打有一定密度(2 cm×2 cm/孔、2 cm×4 cm/孔、4 cm×4 cm/孔、4 cm×5 cm/孔和5 cm×5 cm/孔)的定植孔，每個定植孔之內(nèi)安放一個定植杯.

育苗床消毒及清洗：移栽定植前用200 mg/L濃度的84消毒液對無紡布、珍珠巖和育苗床的內(nèi)面進(jìn)行循環(huán)消毒30 min，然后用自來水進(jìn)行全面清洗10 min.同時用75%乙醇對試驗所需器具和育苗床的外面進(jìn)行全面消毒.

移栽密度與排列：采用4 cm×5 cm/孔(株)的移栽密度，即500株/m2，在各處理樣本之間和育苗床的進(jìn)液口端和育苗床的出液口端用空定植杯(15排)進(jìn)行空間隔離標(biāo)示，同時填補(bǔ)沒有移載處理樣本的空余定植孔.移栽時，每個定植杯移栽1株處理后的植物樣本.定植板上的排列為：空定植杯(橫：25杯，縱：2排)-種兜(橫：25杯，縱：32排)-空定植杯(橫：25杯，縱：2排)-莖段(橫：25杯，縱：32排)-空定植杯(橫：25杯，縱：2排)-莖梢(橫：25杯，縱：32排)-空定植杯(橫：25杯，縱：1排)-枝條(25杯，縱：32排)-空定植杯(橫：25杯，縱：2排).

移栽與定植：移栽前操作人員清洗雙手，消毒.用珍珠巖作基質(zhì)將樣本固定在定植杯中間，將各處理樣本及空定植杯按設(shè)計的排列方式依次進(jìn)行移栽.移栽完成后，按營養(yǎng)液配制方法分別配制1/4MS和1/8MS營養(yǎng)液各10 L，同時配制對照組營養(yǎng)液(零濃度)10 L，分別注入相應(yīng)的營養(yǎng)池中，調(diào)節(jié)pH值為5.6，開啟電源，使NFT循環(huán)系統(tǒng)開始工作.

1.2.3 試驗管理 試驗進(jìn)行中，隨時注意營養(yǎng)液是否正常循環(huán)供給，每兩天對pH值進(jìn)行一次檢測和調(diào)節(jié)，使之維持在pH5.6.每周更換一次營養(yǎng)液，以保證植株正常生根、發(fā)芽和生長的需要.試驗在人工遮陽棚內(nèi)進(jìn)行，應(yīng)保持育苗床不被陽光直射，以防燒苗，必要時可以用雙層遮陽網(wǎng).

2 結(jié)果與分析

各種外殖體經(jīng)過不同種類及濃度的激素處理(浸泡30 min)后，在NFT循環(huán)營養(yǎng)(1/8-1/4MS營養(yǎng)液)供給培養(yǎng)下，培養(yǎng)98 d后，調(diào)查其生根、新葉發(fā)生情況，如表1，2所示.

表1 莖梢、枝條各培養(yǎng)階段生根情況匯總表

注:1、Ⅰ為培養(yǎng)58 d觀察值,Ⅱ為培養(yǎng)98 d觀察值；2、種兜與莖段生根情況較差，沒有列入此表；3、2，4-D處理效果較差，沒有列入此表.

表2 莖梢、枝條各培養(yǎng)階段新葉發(fā)生發(fā)生匯總表

注:1、Ⅰ為培養(yǎng)58 d觀察值,Ⅱ為培養(yǎng)98天觀察值；2、種兜與莖段新葉發(fā)生情況較差，沒有列入此表；3、2，4-D處理效果較差，沒有列入此表.

第Ⅰ培養(yǎng)階段調(diào)查數(shù)據(jù)顯示：在1/8MS營養(yǎng)液培養(yǎng)床，莖梢的平均生根率為56.67%,平均新葉發(fā)生率為74.83%;枝條平均生根率為62.17%,平均新葉發(fā)生率為83.83%.在1/4MS營養(yǎng)液培養(yǎng)床，莖梢的平均生根率為60.33%,平均新葉發(fā)生率為78.67%;枝條的平均生根率為59.17%,平均新葉發(fā)生率為82.5%.

第Ⅱ培養(yǎng)階段調(diào)查數(shù)據(jù)顯示：在1/8MS營養(yǎng)液培養(yǎng)床，莖梢的平均生根率為88.33%,平均新葉發(fā)生率為88.33%;枝條平均生根率為92.17%,平均新葉發(fā)生率為91.00%；在1/4MS營養(yǎng)液培養(yǎng)床，莖梢的平均生根率為87.00%,平均新葉發(fā)生率為87.00%;枝條的平均生根率為94.17%,平均新葉發(fā)生率為88.33%.

本研究篩選出平均生根率、新葉發(fā)生率較高的外殖體Z3和Z4，以及相應(yīng)的激素處理種類(J1、J2和J3)，并從中篩選出平均生根率最高且新葉發(fā)生率也較高的兩個處理，即Y1J3C1Z3(生根率：98%；新葉發(fā)生率：98%)、Y1J3C1Z4(生根率：98%；新葉發(fā)生率：93%).選擇莖梢作外植體對藥材收獲產(chǎn)量影響較小，比選擇枝條作外植體具有更大的優(yōu)勢.本研究形成了千層塔NFT扦插育苗技術(shù)體系:莖梢+IBA 1 000 mg/L 30 min浸泡+1/8MS無機(jī)營養(yǎng)液+98 d NFT培養(yǎng).收獲藥材時剪切所有的莖梢作外植體進(jìn)行育苗，人工栽培藥材產(chǎn)量和種苗外植體材料都得到保證.

3 討論

3.1 扦插繁殖外殖體選擇

本試驗選擇種兜、莖段、莖梢、枝條作為外殖體進(jìn)行生根與新葉發(fā)生情況研究，在不同激素種類及濃度處理后，在無營養(yǎng)液(CK)、1/8MS和1/4MS的NFT循環(huán)系統(tǒng)中通過兩個培養(yǎng)階段(Ⅰ：移栽-58 d培養(yǎng)，Ⅱ：58～98 d培養(yǎng))后，調(diào)查并取得相關(guān)試驗數(shù)據(jù).通過對試驗數(shù)據(jù)的平均數(shù)進(jìn)行簡單分析發(fā)現(xiàn)：莖梢與枝條具有明顯的生根與新葉發(fā)生優(yōu)勢(2，4-D處理的除外).因此，選擇莖梢與枝條作為千層塔扦插繁殖外殖體是理想的選擇.

3.2 激素種類及處理濃度

從表1，2分析得知：在1/8～1/4MS培養(yǎng)條件下，各種激素以500～1000 mg/L濃度浸泡30 min處理，經(jīng)過兩個培養(yǎng)階段(Ⅰ：移栽-58 d培養(yǎng)，Ⅱ：58～98 d培養(yǎng))后，調(diào)查并取得相關(guān)試驗數(shù)據(jù)，通過對試驗數(shù)據(jù)的平均數(shù)進(jìn)行簡單分析發(fā)現(xiàn)：2，4-D處理的生根率與新葉發(fā)生率最低，且明顯低于對照處理，說明2，4-D有抑制千層塔生根與新葉發(fā)生的作用.生根率較高的處理為IBA500-1000 mg/L濃度浸泡30 min處理，其中IBA1 000 mg/L處理莖梢生根率和新葉發(fā)生率均達(dá)到98%(1/8MS培養(yǎng)條件下)，枝條生根率達(dá)到98%，新葉發(fā)生率達(dá)到93%.因此，1 000 mg/L濃度浸泡30 min是較理想的激素處理方案.

3.3 營養(yǎng)液濃度

由于千層塔生長緩慢，所需營養(yǎng)元素的量不大，尤其是在外殖體生根和新葉發(fā)生期對營養(yǎng)物質(zhì)的需求不明顯，試驗數(shù)據(jù)說明：從0～1/4MS范圍內(nèi)，營養(yǎng)液濃度對外殖體的生根率和新葉發(fā)生率的影響沒有顯著的區(qū)別.采用1/8MS濃度可以保證其最低的需求.

3.4 NFT扦插育苗方式

NFT扦插育苗方式：用無紡布襯底，用50目的塑料過濾網(wǎng)包裹珍珠巖(40 cm)作保濕透氣蔽光支撐，不僅保證了外殖體生根部位保持在黑暗狀態(tài)，同時保持了生根所需的濕度和通氣度，采用循環(huán)流動的方式保證營養(yǎng)液持續(xù)供給同時又可以隨時調(diào)節(jié)(濃度或pH值等)，是一種較理想的千層塔扦插育苗方式.只是育苗過程中必須保持60%～80%的遮陽度，以保證千層塔對環(huán)境光照強(qiáng)度的要求.

3.5 試驗數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性

雖然有關(guān)處理的生根及新葉發(fā)生情況較好，但本研究僅調(diào)查了千層塔生根與新葉發(fā)生與否，對生根量的多少、生根分枝情況、新葉發(fā)生的多少以及新莖生長量等沒有作具體測量，有待于作進(jìn)一步系統(tǒng)研究.同時，針對不同類型的外殖體，自制的NFT扦插育苗床還可以作進(jìn)一步功能性改善，以適應(yīng)大規(guī)模人工育苗.

[1]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典(上冊)[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社,1985:215.

[2]浙江省藥用植物志編寫組.浙江藥用植物志[M].杭州:浙江科學(xué)技術(shù)出版社,1980:51-51.

[3]衰珊琴,馮銳,顧國明.蛇足石杉生物堿成分的研究(Ⅱ)[J].中草藥,1994,25(9):453-454,473,502.

[4]余紅英,孫遠(yuǎn)明,楊躍進(jìn).草藥蛇足石杉的研究進(jìn)展[J].中草藥,2001,32(3):279-252.

[5]余紅英,孫遠(yuǎn)明,楊躍生.蛇足石杉生物堿的研究[J].時珍國醫(yī)國藥,2002,13(3):176-179.

[6]江蘇新醫(yī)學(xué)院中藥大辭典[M].上海:上?？萍汲霭嫔?，1985:215-216.

[7]中山大學(xué)生物系.南京大學(xué)生物系合編植物學(xué)[M].北京:人民教育出版社,1979:137.

[8]吳葒,莊平,馮正波,等.中國蛇足石杉資源調(diào)查與評估[J].自然資源學(xué)報,2005,20(1):59-66.

[9]黎萬奎.蛇足石杉內(nèi)生真菌生成石杉堿甲生物技術(shù)的研究[M].上海:上海中醫(yī)藥大學(xué)出版社,2006.