中性粒細胞相關載脂蛋白表達與胃癌進展、轉(zhuǎn)移及預后的關系*

厲金雷 余 震 胡 禮 王蓉蓉 張 行

中性粒細胞相關載脂蛋白表達與胃癌進展、轉(zhuǎn)移及預后的關系*

厲金雷 余 震△胡 禮 王蓉蓉 張 行

目的：探討中性粒細胞相關載脂蛋白（NGAL）在胃癌組織中的表達及與胃癌進展、轉(zhuǎn)移及預后的關系。方法：應用免疫組化法檢測NGAL在102例胃癌、32例正常胃組織中的表達，分析其與胃癌臨床病理特征及預后的關系。結果：NGAL在胃癌組織中的陽性表達率為56.9%，明顯高于在正常胃組織中的21.9%（χ2=11.938，P<0.01），不同胃癌組織學分型患者NGAL陽性表達差異有統(tǒng)計學意義（χ2=10.180，P<0.05），胃癌患者NGAL表達與漿膜侵犯、TNM 分期、淋巴結轉(zhuǎn)移以及 T 分期呈正相關（rs分別為 0.307、0.211、0.220、0．201，P<0．05 或 P<0．01）。NGAL 表達陽性組和陰性組5年累積生存率分別為24.3%和43.7%，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.018）。結論：NGAL在胃癌中表達上調(diào)，與胃癌進展和淋巴結轉(zhuǎn)移顯著相關，提示預后不良，可作為評價胃癌預后新的生物學指標。

中性白細胞 載脂蛋白類 胃腫瘤 癌 淋巴轉(zhuǎn)移 預后 免疫組織化學

中性粒細胞相關載脂蛋白（neutrophil gelatinase－associated lipocalin，NGAL）是 lipocalin 家族的新成員，由Kjeldsen等[1]于1993年首先發(fā)現(xiàn),分子質(zhì)量25 ku，由一條多肽鏈構成,含有178個氨基酸殘基。此后研究證明，NGAL與炎癥、免疫反應、細胞分化、細胞凋亡、組織重構以及多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，NGAL 在胰腺癌[2]、食管癌[3]、卵巢癌[4]等惡性腫瘤中異常表達，并且其表達與腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移、預后密切相關，成為近年來腫瘤轉(zhuǎn)移研究的新熱點。本研究采用免疫組化方法檢測NGAL在胃癌組織中的表達情況，分析其與胃癌臨床病理特征的關系，探討NGAL作為有效預后指標的可行性。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2004年11月—2005年3月我院102例胃癌患者手術切除的石蠟標本，選取同期在我院32例診斷為胃十二指腸消化性潰瘍患者行胃大部切除術標本，離病灶≥5 cm處取胃黏膜組織做對照研究。所有患者均經(jīng)組織病理學確診并依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（UICC）第5版進行胃癌TNM分期。所有患者均有完整病歷資料，無嚴重心肺疾病，術前均未行放療及化療，非復發(fā)再手術病例，非急診手術病例。所有患者均行手術治療。隨訪主要通過電話、查閱門診復診病歷、上門拜訪等方式進行。隨訪從確診之日開始，每3個月1次，直至2010年3月或患者死亡或失訪。疾病特異生存時間為確診胃癌之日起至患者死于胃癌或隨訪截止時間。

1.2主要試劑 羊抗人單克隆抗體購自美國R＆D公司（目錄號：AF1757；簽號：JBH04）；免疫組化試劑盒（PV－9003）、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3免疫組織化學染色 采用免疫組化SP法，石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化、抗原枸櫞酸鹽微波修復，過氧化氫常溫下滅活內(nèi)源性酶，牛血清封閉非特異性抗原，一抗（工作濃度5 mg/L）4℃孵育過夜，滴加生物素標記二抗37℃孵育30 min，滴加辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素工作液37℃孵育30 min，DAB光鏡下顯色、蘇木素復染、常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。以PBS代替一抗做陰性對照，以已知胰腺癌陽性片做陽性對照。

1.4結果判定 NGAL蛋白定位于細胞漿,以出現(xiàn)棕黃色顆粒且染色強度高于背景非特異性著色者為陽性。由2位病理學專家獨立閱片，確定免疫組化結果。采用IP（Intensity＋Percentages）評分方法[5]，綜合考慮染色強度和陽性細胞數(shù)。（1）染色強度記分：細胞漿無染色或與背景非特異性著色一致者記0分，淡黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分。（2）陽性細胞數(shù)記分：細胞漿無染色評定為0，染色細胞個數(shù)<1%評定為1，1%～10%評定為2，>1/10且<1/3評定為3，1/3～2/3評定為4，＞2/3評定為5。以上兩項相加即得總分（范圍0～8分），＜2分為陰性，2～8分為陽性；2～4分為低表達，5～6分為中等表達，7～8分為高表達。

1.5統(tǒng)計學分析 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學處理。不同臨床病理情況患者NGAL表達的差異采用χ2檢驗；NGAL表達與漿膜侵犯、胃癌TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、T分期（原發(fā)灶浸潤胃壁深度）的相關性采用Spearman等級相關分析；應用Kaplan-Meier法計算疾病累積生存率,生存率差異比較采用Log-rank檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1NGAL在胃癌和胃正常組織中的表達 NGAL蛋白在胃癌的表達情況，見圖1、2。NGAL在32例正常胃組織中7例（21.9%）陽性表達，均為低表達，在102例胃癌組織中58例（56.9%）陽性表達，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=11.938，P<0.01）。

圖1 胃癌脈管癌栓NGAL蛋白陽性表達（免疫組化SP法×200）

圖2 胃癌原發(fā)灶NGAL蛋白陽性表達（免疫組化SP法×200）

2.2不同臨床病理情況胃癌患者NGAL表達情況比較 不同年齡、性別、肉眼腫瘤分型胃癌患者NGAL陽性表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），其余不同臨床病理情況胃癌患者NGAL陽性表達差異均有統(tǒng)計學意義（均P<0.05），見表1。NGAL表達與漿膜侵犯、TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移以及T分期呈正相關（rs分別為 0.307、0.211、0.220、0.201，P<0.05或 P<0.01）。

表1 NGAL蛋白表達與胃癌臨床和病理類型關系 例（%）

2.3NGAL表達與胃癌患者預后的關系 胃癌患者中NGAL表達陽性組和陰性組中位生存時間分別為33個月和43個月；5年累積生存率分別為24．3%和43．7%；NGAL表達陽性組的預后明顯差于陰性組，2組生存率比較差異有統(tǒng)計學意義（P＝0．018），見圖 3。

圖3 不同NGAL表達情況胃癌患者的生存曲線

3 討論

已有研究證實，NGAL可與基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）－9形成復合物，增加 MMP－9活性，并可拮抗基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子（TIMP）－1對MMP－9的抑制作用，促進MMP－9對細胞外基質(zhì)的降解[6]。本研究顯示NGAL表達與漿膜侵犯呈正相關。尤其是脈管癌栓形成的胃癌中，NGAL在脈管癌栓中強表達，提示NGAL可能是腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移機制中的重要分子。據(jù)本研究結果推測胃癌細胞分泌的NGAL蛋白先進入脈管，通過脈管運輸?shù)狡渌课?，參與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移。此外，NGAL表達與胃癌TNM分期、淋巴結轉(zhuǎn)移、原發(fā)灶浸潤胃壁的深度呈正相關，表明NGAL陽性表達的胃癌生物學惡性程度較高，容易發(fā)生浸潤、轉(zhuǎn)移。NGAL在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中的作用機制尚未完全闡明，但已有研究證實NGAL在腫瘤組織的高表達促進了自身與MMP－9形成復合物，此復合物抑制MMP－9自我降解，上調(diào)細胞外腫瘤相關性MMP－9的表達，調(diào)控細胞外基質(zhì)血管內(nèi)皮細胞生長因子的釋放，而血管內(nèi)皮細胞生長因子與胃癌淋巴結轉(zhuǎn)移正相關[7]，此復合物促進新生血管的形成，從而促進腫瘤細胞的增殖[8]。NGAL還可下調(diào)E-鈣黏蛋白表達，參與表皮生長因子誘導的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelio-mesenchymal transition,EMT）[2]，在腫瘤的局部浸潤和遠處轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。Yang等[9]發(fā)現(xiàn)NGAL可與鐵高親和力結合，獨立介導鐵的轉(zhuǎn)運，上調(diào)鐵易感基因的表達，促進腫瘤細胞的增殖。

本研究顯示,NGAL陽性組胃癌患者5年累積生存率明顯低于陰性組患者，提示NGAL是影響胃癌預后的因素。Fernandez等[8]報道NGAL與MMP－9可以形成復合物，從乳腺癌患者的尿液中排泄，而在正常對照組，未檢測到這種復合物。Kubben等[10]研究發(fā)現(xiàn)胃癌患者存在類似的情況。尿NGAL檢測可作為臨床上評價某些惡性腫瘤如胃癌、乳腺癌治療效果和預后的新指標。

綜上，NGAL的表達與胃癌進展、轉(zhuǎn)移及預后密切相關，其陽性表達提示胃癌生物學惡性程度高、侵襲性強、預后不良，可作為評價預后的新生物學指標，指導臨床合理選擇治療方案。

[1] Kjeldsen L,Johnsen AH,Sengelov H,et al.Isolation and primary structure of NGAL,a novel protein associated with human neutrophil gelatinase[J].J Biol Chem,1993,268(14):10425-10432.

[2] Furutani M,Arii S,Mizumoto M,et al.Identification of a neutrophil gelatinase-associated lipocalin mRNA in human pancreatic cancers using a modified signal sequence trap method[J].Cancer Lett,1998,122(1-2):209-214.

[3] Zhang H,Xu L,Xiao D,et al.Upregulation of neutrophil gelatinaseassociated lipocalin in oesophageal squamous cell carcinoma:significant correlation with cell differentiation and tumour invasion[J].J Clin Pathol,2007,60(5):555-561.

[4] Lim R,Ahmed N,Borregaard N,et al.Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL)an early-screening biomarker for ovarian cancer:NGAL is associated with epidermal growth factor-induced epithelio-mesenchymal transition [J].Int J Cancer,2007,120(11):2426-2434.

[5] Bauer M,Eickhoff JC,Gould MN,et al.Neutrophil gelatinase-associated lipocalin (NGAL)is a predictor of poor prognosis in human primary breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat,2008,128(3):389-397.

[6] Yan L,Borregaard N,Kjeldsen L,et al.The high molecular weight urinary matrix metalloproteinase (MMP)activity is a complex of gelatinase B/MMP-9 and neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL).Modulation of MMP-9 activity by NGAL [J].J Biol Chem,2001,276(40):37258-37265.

[7] 張娜，鄭海燕，杜華欣，等.VEGF-C、NF-κBp65和COX-2與胃癌淋巴結轉(zhuǎn)移的關系[J].天津醫(yī)藥,2009,37(6):459-461.

[8] Fernandez CA,Yan L,Louis G,et al.The matrix metalloproteinase-9/neutrophil gelatinase-associated lipocalin complex plays a role in breast tumor growth and is present in the urine of breast cancer patients[J].Clin Cancer Res,2005,11(15):5390-5395.

[9] Yang J,Goetz D,Li JY,et al.An iron delivery pathway mediated by a lipocalin[J].Mol Cell,2002,10(5):1045-1056.

[10] Kubben FJ,Sier CF,Hawinkels LJ,et al.Clinical evidence for a protective role of lipocalin-2 against MMP-9 autodegradation and the impact for gastric cancer[J].Eur J Cancer,2007,43(12):1869-1876.

The Correlation of NGAL and Clinicopathologic Progress,Metastasis and Prognosis in Gastric Carcinoma

LI Jinlei,YU Zhen,HU Li,WANG Rongrong,ZHANG Xing
The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College,Zhejiang 325000,China

Objective:To investigate the expression of neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL)，and the correlation of NGAL with clinicopathologic progression,metastasis and prognosis in gastric carcinoma.Methods：The expression of NGAL was observed in 102 gastric carcinoma tissues and 32 normal gastric tissues by immunohistochemistry.The correlation of NGAL expression with clinicopathologic parameters and metastasis was analyzed.Results：The positive rate of NGAL expression was 56.9%in gastric carcinoma， which was significantly higher than that in normal gastric tissue （21.9%， χ2＝11．938， P<0.01).The expression of NGAL was significantly different in patients with different histological types( χ2=10.180,P<0.05).The expression of NGAL was observed to correlate positively with serosal invasion,TNM stage,lymph node status and T stage (rs=0.307,0.211,0.220 and 0.201,P<0.01 or P<0.05).The five-year cumulative survival rates were 24.3%and 43.7%in the positive and negative NGAL expression groups.Kaplan-Meier curves showed a significant difference(P=0.018).Conclusion:NGAL expression was up-regulated in gastric carcinoma,which was significantly correlated with tumor progression and lymphatic metastasis.The expression of NGAL might be a novel molecular marker to predicate the prognosis of gastric carcinoma.

neutrophils apolipoproteins stomach neoplasms carcinoma lymphatic metastasis prognosis immunohistochemistry

*浙江省自然科學基金資助項目（項目編號：Y207799）

325000 溫州醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院普外科（厲金雷，余震，胡禮），病理科（王蓉蓉），外科實驗室（張行）

△通訊作者 E-mail：yuzhen0577@yahoo.com.cn

（2010-04-22收稿 2010-06-15修回）

（本文編輯 李國琪）