傳統(tǒng)魚露發(fā)酵的微生物動(dòng)態(tài)分析*

黃紫燕，朱志偉，曾慶孝，張永絲，簡(jiǎn)永舜

(華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州，510640)

魚露是我國(guó)典型的傳統(tǒng)調(diào)味品之一，其獨(dú)特的風(fēng)味是在釀造過程中，由微生物引起的一系列生化變化形成的［2］。目前，我國(guó)魚露的加工生產(chǎn)需要2～3年的時(shí)間，生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，生產(chǎn)成本高，縮短發(fā)酵時(shí)間是急需解決的問題。以往的研究主要側(cè)重于從物理、化學(xué)方面優(yōu)化加工工藝，生產(chǎn)周期大大縮短，但無法還原魚露天然風(fēng)味。

魚露發(fā)酵過程中要對(duì)微生物進(jìn)行選擇性培養(yǎng)，生存下來的優(yōu)勢(shì)菌可通過發(fā)酵賦予產(chǎn)品主要滋味。對(duì)魚露風(fēng)味有直接關(guān)系的微生物是酵母菌和乳酸菌。在黃豆醬、醬油等發(fā)酵食品的實(shí)際生產(chǎn)中，一些工廠會(huì)在發(fā)酵后期加入乳酸菌與酵母菌發(fā)酵液，以增加其風(fēng)味物質(zhì)的形成［3］。魚露發(fā)酵過程中其品質(zhì)特征形成規(guī)律仍不為人們所了解，目前仍未見對(duì)魚露傳統(tǒng)發(fā)酵過程中微生物的動(dòng)態(tài)分析及優(yōu)勢(shì)菌群的分析［4］。

本實(shí)驗(yàn)以傳統(tǒng)發(fā)酵工藝制作魚露，研究發(fā)酵過程中不同階段的微生物的消長(zhǎng)變化，檢測(cè)pH值、總酸、總酯、乙醇含量、TSN、AAN、TVB-N等理化指標(biāo)，分析游離氨基酸組成與含量，將這3者結(jié)果結(jié)合起來綜合分析，試圖找出加工過程中微生物與游離氨基酸形成、風(fēng)味形成的關(guān)系，明確微生物的作用，初步探討發(fā)酵機(jī)理。我們可以以此為理論依據(jù)，選擇合適時(shí)期有目的的添加合適的發(fā)酵菌種，保證風(fēng)味的基礎(chǔ)上加快發(fā)酵進(jìn)程，應(yīng)用在魚露的實(shí)際生產(chǎn)中，科學(xué)指導(dǎo)魚露快速發(fā)酵［5］。

1 材料與方法

1.1 原材料及樣品準(zhǔn)備

發(fā)酵魚露由廣東省汕頭魚露廠有限公司提供。以鳀魚(Engraulis japonicus)為原料，加30%的海鹽混勻，在(30±5)℃下自然發(fā)酵3年，在不同階段取出發(fā)酵液進(jìn)行分析。取樣時(shí)，將魚露發(fā)酵液混勻，取適量混合液，部分用于微生物檢測(cè)，部分用濾紙(新星，102#定性濾紙Ф12.5cm)過濾，濾液沸水浴10 min后用于理化指標(biāo)分析。

1.2 微生物檢測(cè)

計(jì)數(shù)總菌，用顯微鏡(CX31RTSF，OLYMPUS，日本)觀察;計(jì)數(shù)菌落總數(shù)，采用營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基;計(jì)數(shù)細(xì)菌數(shù)，采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基;計(jì)數(shù)乳酸菌數(shù)，采用MRS培養(yǎng)基;計(jì)數(shù)產(chǎn)蛋白酶乳酸菌數(shù)，采用TSA培養(yǎng)基;計(jì)數(shù)酵母菌數(shù)，采用麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基;計(jì)數(shù)霉菌數(shù)，采用察氏瓊脂培養(yǎng)基［4，6］。

選取菌落數(shù)在30～300之間的平板作為菌落數(shù)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)，1個(gè)稀釋度選用2個(gè)平板。

1.3 理化指標(biāo)的測(cè)定

總可溶性氮(TSN)，凱氏定氮法［7］;氨基酸態(tài)氮(AAN)，甲醛滴定法［6］;揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N)，康維皿法(微量擴(kuò)散法)［8］;pH 值，按照 GB/T10786－1989方法，用數(shù)字式pH計(jì)(pHS－3C，上海精密科學(xué)儀器有限公司)測(cè)定;總酸，GB/T 12456－1990;總酯，按照GB/T 10345.5－1989測(cè)定;揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中乙醇含量的測(cè)定，采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GCMS)進(jìn)行定性定量分析［9］。

所有的試驗(yàn)至少進(jìn)行3次，計(jì)算相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)偏差。指標(biāo)內(nèi)部的均值比較采用最小顯著差異法(Least significant difference，LSD)，取 95% 置信度(P＜0.05)。

1.4 游離氨基酸組成的測(cè)定

游離氨基酸的測(cè)定采用高效液相色譜法，采用Waters高效液相色譜儀和PICO.TAG氨基酸分析柱，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫為38℃，流速為1 mL/min。標(biāo)準(zhǔn)氨基酸溶液為Sigma產(chǎn)品。數(shù)達(dá)到最大，其對(duì)數(shù)值為8.0，而后開始緩慢下降，大部分微生物，尤其是不適鹽微生物逐漸被淘汰，直到進(jìn)入后期保溫發(fā)酵期(55～60℃)時(shí)，無需經(jīng)殺菌即可得商業(yè)魚露。

2 結(jié)果與討論

2.1 魚露發(fā)酵過程微生物菌系的消長(zhǎng)變化分析

對(duì)汕頭魚露廠釀造的魚露進(jìn)行鏡檢及平板稀釋分離計(jì)數(shù)，結(jié)果見圖1。從圖1中可以發(fā)現(xiàn)，在魚露傳統(tǒng)發(fā)酵的整個(gè)過程中，各類微生物數(shù)量相差很大，顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果比倒平板實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均高出2個(gè)對(duì)數(shù)值。發(fā)酵前半年，優(yōu)勢(shì)菌互相交替，為魚露發(fā)酵主要活動(dòng)期，而后慢慢穩(wěn)定。在發(fā)酵3～4個(gè)月時(shí)菌落總

圖1 傳統(tǒng)魚露發(fā)酵過程主要微生物的消長(zhǎng)變化

結(jié)合圖1、圖2可以看出，魚露中含有豐富的耐鹽性乳酸菌，尤其是產(chǎn)蛋白酶乳酸菌。在整個(gè)發(fā)酵期間，乳酸菌的數(shù)量一直高于其他2種菌，是整個(gè)發(fā)酵期的優(yōu)勢(shì)菌，所占比例維持在30%以上。在發(fā)酵2～4個(gè)月時(shí)其數(shù)量達(dá)到最大值，對(duì)數(shù)值為7.5～7.6。發(fā)酵1年以后，菌相組成相對(duì)穩(wěn)定，乳酸菌占菌落總數(shù)的比例維持在60%左右。乳酸菌發(fā)酵使環(huán)境pH值下降。

在發(fā)酵初期，由于海鹽尚未滲入魚體，魚汁尚未滲出，魚鹽空隙存在空氣，大量的霉菌開始生長(zhǎng)。發(fā)酵至15天時(shí)，霉菌最先達(dá)到最大量，對(duì)數(shù)值為6.19，占菌落總數(shù)的66%，是發(fā)酵初期的優(yōu)勢(shì)菌。霉菌分泌出各種蛋白酶，使蛋白質(zhì)水解成為多肽、氨基酸等，為后階段其他微生物的生長(zhǎng)創(chuàng)造條件。但隨著海鹽滲入魚體，魚汁滲出，魚鹽間空隙被填滿，高食鹽濃度和缺乏氧氣使霉菌生長(zhǎng)變緩，霉菌數(shù)量減少。

霉菌分泌的酶類發(fā)揮作用，乳酸發(fā)酵使pH值下降到一定程度，且存在厭氧環(huán)境，酵母菌大量繁殖。從發(fā)酵開始，酵母菌數(shù)量不斷增多，從最開始對(duì)數(shù)值為3.5，發(fā)酵3個(gè)月時(shí)，對(duì)數(shù)值已達(dá)到7.8，占菌落總數(shù)的63%，成為該時(shí)期的優(yōu)勢(shì)菌。在發(fā)酵2～4個(gè)月時(shí)，乳酸菌和酵母菌這兩種優(yōu)勢(shì)菌體之間引起競(jìng)爭(zhēng)進(jìn)行酒精發(fā)酵，生成乙醇，進(jìn)而促進(jìn)各種香氣成分的生成［10］。酵母和乳酸菌的混合發(fā)酵能產(chǎn)香、產(chǎn)酒精，與單純的乳酸發(fā)酵相比，酸味適口［11］。而后由于環(huán)境pH值的不斷下降，酵母菌數(shù)量逐漸減少，發(fā)酵1年以后，其所占的比例基本穩(wěn)定，為30%。

2.2 魚露發(fā)酵過程pH值、總酸含量的變化

酸度是反映乳酸發(fā)酵進(jìn)程的一個(gè)重要指標(biāo)，魚露發(fā)酵過程中pH值、總酸含量的變化如圖3所示。

結(jié)合微生物變化分析，耐鹽乳酸菌是整個(gè)發(fā)酵期間的優(yōu)勢(shì)菌，魚露中的主體酸是乳酸，它使發(fā)酵液中pH值下降。由圖3可看出，在發(fā)酵前0.5個(gè)月，由于乳酸菌與其他雜菌相競(jìng)爭(zhēng)，尚未成為優(yōu)勢(shì)菌，發(fā)酵過程中腐敗菌生長(zhǎng)較旺盛，有些蛋白質(zhì)被分解為揮發(fā)性鹽基氮，使pH值大幅度上升，發(fā)酵15 d，發(fā)酵液中pH值高達(dá)5.90。發(fā)酵2～3個(gè)月時(shí)，乳酸菌抑制住雜菌，開始成為環(huán)境中的優(yōu)勢(shì)菌，環(huán)境pH值呈緩慢下降狀態(tài)。

5.仔豬副傷寒。由沙門氏菌引起，多發(fā)生于2～4月齡的仔豬，無明顯的季節(jié)性。急性型：呈敗血癥癥狀，突然發(fā)病，體溫升高，食欲廢絕，初便秘，后下痢，排惡臭稀糞，病后2～3 d在鼻端、兩耳及四肢下部皮膚發(fā)紫，病豬低頭呆立，步態(tài)搖晃，體溫下降，不久死亡。慢性型最多見，病豬呈漸進(jìn)性消瘦，體溫略升高，精神不振，初便秘，后呈持續(xù)性或間歇性腹瀉，排淡黃色或黃綠色惡臭稀便，混有血液、壞死組織。剖檢急性呈敗血癥變化；慢性腸黏膜呈彌漫性壞死性糜爛。

圖3 傳統(tǒng)魚露發(fā)酵過程中PH及總酸含量的變化

發(fā)酵液中總酸的變化與pH值變化基本相反。已有研究認(rèn)為，酸類來源于脂肪酸的氧化或者微生物對(duì)氨基酸發(fā)酵作用［12－13］;尤其來自那些能耐高濃度鹽的菌種，Beddows等研究證明，產(chǎn)揮發(fā)性脂肪酸的細(xì)菌在魚和富含蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好［14］。故發(fā)酵3個(gè)月后酸度不斷上升，表明魚露發(fā)酵過程中產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸，使得魚露中酸類物質(zhì)(如乳酸、琥珀酸、檸檬酸等)含量不斷升高，大量低分子量的揮發(fā)性有機(jī)酸，如乙酸、丁酸、丙酸開始形成，它們是魚露中的主要風(fēng)味物質(zhì)，賦予魚露干酪的風(fēng)味［15］。

2.3 魚露發(fā)酵過程TSN、AAN、TVB-N含量的變化

TSN、AAN、TVB-N是能反映微生物群體利用氮源發(fā)酵的情況的指標(biāo)，是反映魚體蛋白質(zhì)被分解情況的指標(biāo)，也是魚露質(zhì)量分級(jí)的重要指標(biāo)，其發(fā)酵過程的變化如圖4所示。

圖4 傳統(tǒng)魚露發(fā)酵過程中TSN、AAN、TVB-N含量的變化

TSN和AAN含量的變化趨勢(shì)相一致，隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加。在發(fā)酵前6個(gè)月快速增長(zhǎng)，隨后增長(zhǎng)變緩。發(fā)酵6個(gè)月時(shí)，TSN含量已達(dá)1.43 g/100 mL，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率為51.8%。這可能是由于發(fā)酵初期，各種優(yōu)勢(shì)菌相互交替出現(xiàn)，乳酸菌、酵母菌處于活躍期，尤其是乳酸菌能分泌出蛋白酶，原料魚蛋白質(zhì)在半年內(nèi)基本完成水解。

TVB-N是衡量魚露腐敗變質(zhì)的1個(gè)重要指標(biāo)，其形成主要是由于魚體在發(fā)酵過程中腐敗微生物的生長(zhǎng)，將蛋白質(zhì)分解成氨基酸后，再進(jìn)一步分解為氨、三甲胺等揮發(fā)性鹽基含氮化合物［16］。圖3結(jié)果顯示，發(fā)酵前一個(gè)月，發(fā)酵液的TVB-N含量增長(zhǎng)較快，可以推斷優(yōu)勢(shì)菌尚未抑制住雜菌，隨后在2～4個(gè)月時(shí)，TVB-N含量基本不增長(zhǎng)，可能是由于乳酸菌、酵母菌的迅速繁殖，這與圖1結(jié)果相吻合。

2.4 魚露發(fā)酵過程總酯、乙醇含量的變化

發(fā)酵液中乙醇含量是能反映酵母菌發(fā)酵進(jìn)程的一個(gè)指標(biāo)，發(fā)酵過程總酯、乙醇含量變化如圖5所示。

圖5 傳統(tǒng)魚露發(fā)酵過程中總酯及乙醇含量的變化

在魚露的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中，乙醇是最先快速生長(zhǎng)的物質(zhì)。由圖5可以看出，在發(fā)酵前1年，2大優(yōu)勢(shì)菌體競(jìng)爭(zhēng)引起乙醇的快速生長(zhǎng)。從發(fā)酵初期開始，由于酵母菌的大量繁殖，乙醇隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)不斷增長(zhǎng)，到發(fā)酵1年時(shí)達(dá)到最大值，含量占揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總量的28.83%。而發(fā)酵一年以后，乙醇可能通過被氧化成醛、酮類，進(jìn)而氧化成酸，慢慢轉(zhuǎn)化為其他風(fēng)味物質(zhì)，相對(duì)含量逐漸減少，到發(fā)酵3年后，乙醇含量?jī)H占11.66%。乙醇是魚露中主要風(fēng)味物質(zhì)生成的前體物。

潮汕魚露的獨(dú)特風(fēng)味在3年的發(fā)酵過程中逐漸形成，其間總酯含量不斷上升，尤其是第2～3年時(shí)上升很快，從2.08 g/100 mL上升到3.40 g/100 mL，增長(zhǎng)了49.7%，與乙醇含量的迅速下降形成鮮明對(duì)比。酯類中的2-硝基丙酸乙酯、二甲酯、乙酸乙酯等［13］相互協(xié)同，共同構(gòu)成魚露的特殊風(fēng)味。

2.5 魚露發(fā)酵過程中游離氨基酸組成與含量的變化

表1 魚露發(fā)酵過程中游離氨基酸的組成與含量mg/100g

游離氨基酸組成與含量測(cè)定結(jié)果見表1，可以看出，潮汕魚露中游離氨基酸總量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增加(P＜0.05)，發(fā)酵各階段樣液中谷氨酸含量都較高并不斷增加，這表明魚露的鮮味形成需要一定的時(shí)間。發(fā)酵3年后，終產(chǎn)品的游離氨基酸總量為5 705.79 mg/100 mL，而在發(fā)酵半年后其游離氨基酸總量已達(dá)到4 866.66 mg/100 mL，說明游離氨基酸的主要形成時(shí)間是在發(fā)酵的前6個(gè)月，其后游離氨基酸總量緩慢上升。這可能是由于發(fā)酵初期，各種優(yōu)勢(shì)菌相互交替出現(xiàn)，乳酸菌、酵母菌處于活躍期，尤其是乳酸菌能分泌出蛋白酶，原料魚蛋白質(zhì)在半年內(nèi)基本完成水解。但隨后環(huán)境pH值下降、溫度升高，乳酸菌、酵母菌數(shù)量減少，魚露發(fā)酵速度下降。這時(shí)可以在魚露中適量添加這2種優(yōu)勢(shì)菌，加速發(fā)酵，以利于風(fēng)味和滋味物質(zhì)的形成，從而縮短魚露產(chǎn)品的陳化和后熟時(shí)間。

色氨酸、絲氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的含量在發(fā)酵一年期間時(shí)而升高時(shí)而降低，明顯波動(dòng)，這與發(fā)酵初期優(yōu)勢(shì)菌體不能穩(wěn)定有關(guān)，也說明氨基酸是魚露揮發(fā)性化合物的重要前體物，例如特征揮發(fā)性化合物中的含硫化合物由含硫氨基酸轉(zhuǎn)化而來。

3 結(jié)論

(1)魚露發(fā)酵15d時(shí)發(fā)酵液中霉菌數(shù)達(dá)到最大值，是發(fā)酵初期的優(yōu)勢(shì)菌;3個(gè)月時(shí)酵母菌取代之;乳酸菌是整個(gè)發(fā)酵期間的優(yōu)勢(shì)菌，其含量在2～4個(gè)月達(dá)到最大，其對(duì)數(shù)值為7.5。

(2)乳酸菌生長(zhǎng)使環(huán)境中pH值下降，促進(jìn)酵母菌生長(zhǎng)，兩菌競(jìng)爭(zhēng)使乙醇得到迅速增長(zhǎng)，在發(fā)酵1年時(shí)達(dá)到最大，占揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)總量的28.83%，隨后，乙醇慢慢轉(zhuǎn)化為魚露中其他揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，而此時(shí)總酯含量逐漸增大，最后一年增加了49.7%。

(3)發(fā)酵初期微生物生長(zhǎng)比較活躍，數(shù)量較多，分泌出蛋白酶促使蛋白質(zhì)降解，TSN、AAN、TVB-N含量在前6個(gè)月增長(zhǎng)較快，游離氨基酸形成主要在發(fā)酵前半年，隨著微生物數(shù)量下降，其增長(zhǎng)速度也減緩，可以適量添加優(yōu)勢(shì)菌株，加速發(fā)酵，以利于風(fēng)味和滋味物質(zhì)的形成，從而縮短魚露產(chǎn)品的陳化和后熟時(shí)間。

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