斜臥青霉纖維素酶和木聚糖酶高產(chǎn)菌株的選育

劉新育,靖梅貞,宋安東,劉亮偉,陳紅歌

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,河南鄭州 450002)

天然纖維素原料是地球上最豐富的可再生資源,但目前被利用的只有11%。纖維素大多被半纖維素包裹,其降解必然受到半纖維素(大多是木聚糖)的制約,所以纖維素酶和木聚糖酶兩種酶的聯(lián)合使用,廣泛應(yīng)用到造紙、食品加工、紡織、動(dòng)物飼料和能源工業(yè)等諸多領(lǐng)域[1-2],具有明顯的應(yīng)用效果。自然界中的微生物通常能同時(shí)產(chǎn)生纖維素酶和木聚糖酶,但目前同時(shí)產(chǎn)纖維素酶和木聚糖酶的菌株產(chǎn)酶能力還不理想,所以獲得既產(chǎn)纖維素酶又產(chǎn)木聚糖酶的微生物成為高效降解纖維素原料的熱點(diǎn)途徑[3]。本研究利用纖維素酶活力為目前國(guó)內(nèi)領(lǐng)先水平的斜臥青霉A50作為出發(fā)菌株,通過(guò)原生質(zhì)體誘變育種方式獲得了產(chǎn)雙酶且雙酶酶活都很高的6號(hào)菌,并對(duì)該菌株雙酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株 斜臥青霉(Penicillium decumbens)A50,由山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室曲音波教授饋贈(zèng)。

1.1.2 試劑與儀器 樺木木聚糖是Sigma產(chǎn)品,蛋白質(zhì)分子量Marker為TaKaRa產(chǎn)品;DNS溶液配置參照文獻(xiàn)[4]方法。UN ICO-7200型可見分光光度計(jì)為上海尤尼柯儀器有限公司產(chǎn)品;凝膠成像系統(tǒng)為Gene公司產(chǎn)品。

1.1.3 培養(yǎng)基 ①菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基：改良Mandels營(yíng)養(yǎng)鹽液中加總液量10%的麩皮,煮沸10～15 min。4層紗布過(guò)濾,濾液5 000 r/min離心5 min,上清液即為菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基;②再生高滲培養(yǎng)基：向生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入0.6 mol/L的葡萄糖;③孢子萌發(fā)培養(yǎng)基：生長(zhǎng)培養(yǎng)基中加入0.059%的檸檬酸三鈉,0.1%的丙酮酸鈉,0.05%的L-天冬酰胺,0.005%的MgSO4·7H2O,0.015%的KH2PO4,0.005%的KCl,0.004%的NH4NO3,0.06%的葡萄糖,pH 6.0;④誘變篩選培養(yǎng)基：4%麩皮培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 孢子懸浮液的制備 新鮮斜臥青霉A50菌株斜面,用少量無(wú)菌水洗脫后轉(zhuǎn)入50 mL裝有玻璃珠的孢子萌發(fā)培養(yǎng)基中,30℃靜置培養(yǎng)8～12 h,然后200 r/min震蕩培養(yǎng)3 h,用于原生質(zhì)體的制備。

1.2.2 原生質(zhì)體的紫外誘變 將制備好的原生質(zhì)體懸浮液(纖維素酶：蝸牛酶：溶菌酶=7.5：7.5：2.5 mg/mL,30℃酶解3 h)稀釋至濃度為1×106～5×106個(gè)/mL,置于15W紫外燈下25 cm處理20 min。

1.2.3 誘變菌株的篩選 處理過(guò)的原生質(zhì)體適當(dāng)稀釋后涂布于添加0.1%樟腦(10%的乙醇溶液)的再生平板中。33℃恒溫避光培養(yǎng)4～6 d,隨機(jī)挑取菌落轉(zhuǎn)接至菌絲生長(zhǎng)斜面,然后接入4%麩皮液體培養(yǎng)基中搖瓶發(fā)酵76 h,4層紗布過(guò)濾培養(yǎng)液,4℃下10 000 r/min離心10 min,上清即為粗酶液,測(cè)定酶活,篩選高酶活的菌株。

1.2.4 木聚糖酶活的測(cè)定[5]在最適反應(yīng)條件下,以每分鐘產(chǎn)生1μmol木糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位( IU)。

1.2.5 纖維素酶活的測(cè)定[6]在最適反應(yīng)條件下,以每分鐘產(chǎn)生1μmol葡萄糖所需要的酶量為一個(gè)酶活力單位( IU)。

1.2.6 胞外蛋白的酶譜檢測(cè) 分離膠中添加1%木聚糖用于檢測(cè)木聚糖酶酶譜;分離膠中添加2%羧甲基纖維素鈉用于檢測(cè)纖維素酶酶譜[7-8]。

1.2.7 孢子形態(tài)的電鏡觀察 用碳膠帶印上菌落表面的孢子粉,噴鍍金原子后,在日立S-3400NⅡ型掃描電子顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變株的初篩

A50的原生質(zhì)體紫外誘變篩選結(jié)果見表1,從中篩選出木聚糖酶活和纖維素酶活都比較高的突變株6號(hào)菌,其纖維素酶活比親本A50有稍許提高,木聚糖酶活為67.3 IU/mL,是親本的1.86倍。經(jīng)傳代10次,6號(hào)菌遺傳穩(wěn)定性較好。

表1 A50誘變部分結(jié)果Table 1 The partial results of mutation of strain A50

2.2 菌落和孢子形態(tài)觀察

在相同生長(zhǎng)條件下,A50和6號(hào)菌菌落形態(tài)相似;培養(yǎng)第10 d,6號(hào)菌菌落飽滿,而A50菌落出現(xiàn)褶皺。將A50和6號(hào)菌的孢子影印、處理,置電鏡下觀察,結(jié)果見圖1。A50的孢子為橢圓形,而6號(hào)菌的孢子較A50鈍圓。

圖1 A50和6號(hào)菌孢子電鏡形態(tài)Fig.1 The spores of strain A50 and No.6 strain by SEM

2.3 木聚糖酶和纖維素酶的酶譜檢測(cè)

將A50和6號(hào)菌的粗酶液進(jìn)行酶譜電泳SDS-PAGE,電泳結(jié)束后進(jìn)行蛋白質(zhì)復(fù)性、反應(yīng)、染色,結(jié)果見圖2。酶譜檢測(cè)表明,6號(hào)菌和A50的纖維素酶譜條帶基本一致,6號(hào)菌條帶亮度略強(qiáng)。兩菌的木聚糖酶譜差異明顯,6號(hào)菌比A50多了一條29 ku左右的木聚糖酶條帶(PAGE上條帶較弱)。由此推測(cè),6號(hào)菌木聚糖酶活力的提高可能是因?yàn)樗哪揪厶敲赶蛋l(fā)生了變化。

圖2 A50和6號(hào)菌培養(yǎng)液的SDS-PAGE和酶譜檢測(cè)Fig.2 Detection of SDS-PAGE and zymogram of cultures from strain A50 and No.6

2.4 麩皮濃度對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

選取不同濃度麩皮進(jìn)行發(fā)酵,產(chǎn)酶情況見圖3。結(jié)果表明,當(dāng)麩皮濃度為7%時(shí),木聚糖酶活和纖維素酶活都達(dá)到最高。

圖3 麩皮濃度對(duì)6號(hào)菌產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effects of concentration of bran on strain No.6 producing xylanase and CMCase

2.5 輔加碳源對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響

在主碳源為7%麩皮的條件下,選擇葡萄糖和蔗糖作為輔加碳源,添加濃度為0.1%～0.5%。液體發(fā)酵76 h測(cè)定雙酶活性,結(jié)果見表2。從表2可以看出,隨著葡萄糖濃度的增大,木聚糖酶活逐漸升高,纖維素酶活稍有下降,可見低濃度的葡萄糖可以促進(jìn)木聚糖酶的產(chǎn)生;隨著蔗糖添加量的增大,纖維素酶活基本不變;蔗糖添加量從0.1%增加到0.2%時(shí)木聚糖酶活力有小幅升高,大于0.2%時(shí)基本不變。從生產(chǎn)成本的角度,選擇0.1%的葡萄糖作為輔加碳源。

表2 葡萄糖和蔗糖添加量對(duì)產(chǎn)酶的影響Table 2 Effects of addition of glucose and sucrose on strain No.6 producing xylanase and CMCase

2.6 突變6號(hào)菌在不同溫度下的產(chǎn)酶曲線

將突變株6號(hào)菌接入上述優(yōu)化培養(yǎng)基,并在不同溫度下?lián)u床培養(yǎng),從24 h開始,每隔12 h測(cè)定雙酶酶活,直到96 h結(jié)束,結(jié)果見圖4、圖5。結(jié)果表明,不同溫度下木聚糖酶的產(chǎn)量不同,在28℃和30℃時(shí),木聚糖酶均在84 h到達(dá)產(chǎn)酶高峰期,28℃最高酶活力比30℃高,33℃產(chǎn)酶高峰期提前到72 h,且最高酶活比28℃略高;對(duì)于纖維素酶,6號(hào)菌在28℃和30℃下產(chǎn)酶比較緩慢,菌絲從36 h才開始產(chǎn)酶,84 h達(dá)到產(chǎn)酶高峰期,最高酶活性也相差不大,之后產(chǎn)酶能力逐漸下降,33℃時(shí)72 h即達(dá)到產(chǎn)酶高峰期,最高酶活比前兩者也要高。

圖4 不同溫度下6號(hào)菌木聚糖酶的產(chǎn)酶曲線Fig.4 The course of strain No.6 producing xylanase under different temperature

圖5 不同溫度下6號(hào)菌纖維素酶的產(chǎn)酶曲線Fig.5 The course of strain No.6 producing cellulase under different temperature

由于木聚糖酶和纖維素酶產(chǎn)酶期同步,所以選擇33℃作為最適發(fā)酵溫度。

3 討 論

突變株6號(hào)菌的木聚糖酶譜比親本A50多了一條帶,相同培養(yǎng)條件下兩者的孢子形態(tài)也不同,表明6號(hào)菌確實(shí)發(fā)生了突變,可能是由于基因的表達(dá)調(diào)控因子得到了誘導(dǎo)或者是抑制因子被解除,使得受抑制的木聚糖酶基因得到表達(dá),從而使木聚糖酶的酶活得到很大提高。

該菌遺傳穩(wěn)定性良好,同時(shí)具備纖維素酶和木聚糖酶較高的產(chǎn)酶能力。另外,產(chǎn)酶培養(yǎng)基簡(jiǎn)單,只需要7%的麩皮和0.1%的葡萄糖,不需要添加其他任何碳源、氮源以及表面活性劑等物質(zhì)(數(shù)據(jù)未顯示),所以該菌株是一株非常適合工業(yè)生產(chǎn)的纖維素酶/木聚糖酶復(fù)合酶生產(chǎn)菌株,將有效地提高對(duì)纖維素原料的利用效率,在生物轉(zhuǎn)化和飼料等領(lǐng)域?qū)⒕哂泻芎玫膽?yīng)用前景。

[1] P.I.P.Ponte,L.M.A.Ferreira,M.A.C.Soares.Use of Cellulases and Xylanases to SupplementDiets ContainingAlfalfa for Broiler Chicks：Effects on Bird Performance and Skin Color[J].J.Appl.Poult.Res.,2004,13(1)：412-420.

[2] 陳朝銀,石家驥,錢世鈞.纖維素酶的研究進(jìn)展與發(fā)展趨勢(shì)[J].微生物學(xué)雜志,2008,28(1)：83-87.

[3] Subramaniyan S,Prema P.Cellulase-free xylanases from Bacillus and othermicroorganis ms[J].FEMSMicrobio Lett,2000,183：1-7.

[4] 北京大學(xué)制藥廠.微生物和酶學(xué)基本知識(shí)[M].北京：科學(xué)出版社,1971：201.

[5] 陳紅歌,朱靜,梁改芹,等.黑曲霉木聚糖酶的純化與性質(zhì)[J].菌物系統(tǒng),2000,19(1)：111-116.

[6] 孫憲昀.斜臥青霉木質(zhì)纖維素酶系的合成調(diào)控研究[D].山東大學(xué)博士論文,2007.

[7] Bartley TD,Murphy-Holland K,Eveleigh DE,A method for the detection and differentiation of celluase compotents in polyacrylamide gels[J].Anal.Biochem.,1984,140-157.

[8] Biely P,Mislivicova D,oman R.Soluble chromogenic substrates for the assay of endo-1,4-β-xylanase and endo-1,4-βglucanases[J].Anal.Biochem.,1985,144：140-142.