中藥復(fù)方“促孕散”中生物堿的提取方法及其促孕活性研究

邵會(huì)娟,李炳奇,唐利容,劉勤興,谷新利

(1石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,石河子832003;2石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,石河子832003)

目前,由淫羊藿、益母草等中藥組合而成的中藥復(fù)方已被廣泛的用于治療奶牛持久黃體、卵巢靜止、卵巢囊腫、卵巢萎縮、子宮內(nèi)膜炎等不孕癥。學(xué)者們[1～4]先后分別對(duì)不同中藥復(fù)方的臨床試驗(yàn)也均表現(xiàn)出良好的效果。中藥復(fù)方“促孕散”由淫羊藿、益母草等九味中藥組成,在治療母畜卵巢靜止和持久黃體引起的不孕癥方面臨床效果顯著,副作用小,安全性好,治愈率可達(dá)80%[5,6]。但其作用機(jī)理、藥物的活性成分尚不明確,因此其內(nèi)在有效成分不能確定和控制,并且作為傳統(tǒng)中藥散劑,其用量偏大,不利于臨床實(shí)際操作。

益母草是大多數(shù)中藥復(fù)方中的主要成分,在獸醫(yī)臨床中可用于母畜不孕、母牛帶下、子宮內(nèi)膜炎、胎動(dòng)不安、牛胎衣不干等產(chǎn)科疾病的治療[7],其主要活性成分是鹽酸水蘇堿和益母草堿等生物堿。因此,可擬定鹽酸水蘇堿作為本復(fù)方中生物堿的重要質(zhì)量指標(biāo)。

為了進(jìn)一步定量地深入研究“促孕散”的藥理機(jī)制,使臨床獸醫(yī)和藥檢部門控制該產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),確保療效有一定的檢測(cè)手段,本研究以“促孕散”復(fù)方中君藥益母草中鹽酸水蘇堿的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),通過正交試驗(yàn)考察了超聲波法提取“促孕散”中生物堿的主要影響因素[8,9],優(yōu)化了提取工藝,并通過小鼠子宮增重[10,11]、卵巢發(fā)育試驗(yàn),初步探討了“促孕散”中生物堿提取物對(duì)小白鼠子宮增重和卵巢發(fā)育的影響,以期為實(shí)現(xiàn)“促孕散”安全,穩(wěn)定,高效,可控的質(zhì)量要求奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)藥品與試劑

中藥復(fù)方“促孕散”(由石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院提供);21日齡昆明種雌性小白鼠(石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。

乙醇(分析純);鹽酸水蘇堿標(biāo)準(zhǔn)品(上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司);雷氏鹽(上海邁坤化工有限公司);鹽酸(分析純);蒸餾水;苯甲酸雌二醇注射液(2mg/mL,批號(hào)080414,寧波市三生藥液有限公司)用甘油稀釋成50μg/mL。

1.1.2 主要試驗(yàn)儀器

紫外-可見分光光度計(jì)(BLUESTAR,北京萊伯泰科儀器有限公司);超聲波提取儀(KQ5200B型,江蘇省昆山市超聲儀器有限公司);循環(huán)水式真空泵(SH-C,河南鞏義市英峪予華儀器廠);電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司);DKS系列恒溫水浴鍋(嘉興中新醫(yī)療儀器有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE52-05,上海亞榮生化儀器廠);Olympus顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 “促孕散”中生物堿的含量測(cè)定

1.2.1.1 供試品溶液制備

稱取若干份中藥樣品各1.00g于三角燒瓶,加入乙酸乙酯10mL浸泡1h,超聲5min,過濾,藥渣再加乙酸乙酯10mL,超聲 5min,過濾,揮干溶劑,用60%乙醇溶液10mL為溶劑,在常溫下超聲提取3次,每次20min,減壓抽濾,濾液用同一濃度的乙醇定容于25mL容量瓶中,作為供試品溶液待用。

1.2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以105℃干燥至恒重的鹽酸水蘇堿為標(biāo)準(zhǔn)品,用試劑空白為對(duì)照,于520nm波長處測(cè)定其吸光度,用空白試劑吸光度減去對(duì)照品的吸光度,以吸光度的差值為縱坐標(biāo)(吸光度的差值為被反應(yīng)掉的雷氏鹽,它與樣品物質(zhì)溶液濃度成正比),濃度為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程:

A=0.3456c+0.0128,

其中,相關(guān)系數(shù) r=0.9996,生物堿濃度在0.05～0.25mg/mL時(shí)與吸收度呈線性關(guān)系,如圖1所示。

圖1 鹽酸水蘇堿苷對(duì)照品溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1The standard curve of Hydrochloric acid stachydrine reference substance

1.2.1.3 生物堿的含量測(cè)定

準(zhǔn)確移取8mL供試品溶液于50mL燒杯中蒸干,加入10mL0.10mol/L的鹽酸溶解,水浴加熱,加入0.5g活性炭邊加熱邊攪拌1min,過濾至25mL容量瓶中,用0.1mol/L的鹽酸溶液10mL分次洗滌燒杯,洗滌液濾并入同一容量瓶中;各加入新制2%雷氏鹽溶液3mL,搖勻,加0.1mol/L的鹽酸溶液稀釋至刻度,搖勻。置冰水浴放置1h,用干燥濾紙濾過,取續(xù)濾液。

測(cè)其吸光度,測(cè)定吸光度按回歸方程計(jì)算供試品溶液中鹽酸水蘇堿的濃度c,按下列式(1)計(jì)算提取物中生物堿的含量。

式(1)、(2)中,m1為提取物生物堿的質(zhì)量,mg;c為供試品溶液中生物堿濃度,mg/L,由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出;a為測(cè)定時(shí)提取液的稀釋倍數(shù);V為提取液總體積;m2為供試品溶液中生物堿的含量百分比。

1.2.1.4 “促孕散”中生物堿提取的正交試驗(yàn)

稱取若干份中藥樣品各1.00g于三角燒瓶,加入乙酸乙酯10mL浸泡1h,超聲5min,過濾,藥渣再加乙酸乙酯10mL,超聲5min,過濾,揮干溶劑,分別加入一定濃度的乙醇溶液10mL為溶劑,常溫下分別超聲提取一定次數(shù),每次提取一定時(shí)間,減壓抽濾,各濾液分別用同一溶劑濃度的乙醇定容于25mL容量瓶中,作為供試品溶液待用。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對(duì)影響中藥復(fù)方“促孕散”中生物堿提取效果的乙醇濃度、提取時(shí)間、料液比、提取次數(shù)4個(gè)因素,每個(gè)因素選擇3個(gè)水平,選用L9(34)正交表進(jìn)行試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。

表1 L9(34)正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Tab.1 The level of factor in the orthogonal experimental design

1.2.2 “促孕散”中生物堿提取物促孕活性指標(biāo)的測(cè)定

1.2.2.1 “促孕散”生物堿提取物的制備

準(zhǔn)確稱取“促孕散”群藥粗粉適量,按照超聲提取“促孕散”生物堿最優(yōu)工藝進(jìn)行提取,收集濾液,減壓濃縮除去溶劑,用蒸餾水稀釋并酌情加入適量助溶劑,制為相當(dāng)于1g/mL生藥的溶液(用時(shí)按需要稀釋)。

1.2.2.2 “促孕散”生物堿提取物對(duì)小白鼠子宮增重的影響[12,13]

取21日齡健康雌性小白鼠,隨機(jī)分組,每組10只,分別為:生物堿提取物組、正常組(生理鹽水)及雌二醇陽性對(duì)照組。除雌二醇陽性對(duì)照組外,生物堿提取物組和正常組灌服給藥,0.06g/只,1次/d,連續(xù)給藥7d。雌二醇陽性對(duì)照組從第4d開始腹腔注射,5μg/只,連續(xù)給藥 7d。各組于末次給藥后24h,脫頸處死小鼠,剖開腹腔,摘取子宮、卵巢及陰道,放于濾紙上,除去脂肪組織和卵巢后,迅速稱子宮濕重,計(jì)算子宮與體重的比值。

1.2.2.3 “促孕散”生物堿提取物對(duì)小白鼠卵巢的影響

取21日齡健康雌性小白鼠,隨機(jī)分組:每組10只,分別為:生物堿提取物組、正常組(生理鹽水)及雌二醇陽性對(duì)照組。除雌二醇陽性對(duì)照組外,生物堿提取物組和正常組灌服給藥,0.06g/只,1次/d,第4d劑量加倍,連續(xù)給藥7d。雌二醇陽性對(duì)照組從第4d開始腹腔注射,5μg/只,連續(xù)給藥7d。各組小白鼠均于第8d剖殺,立即切取雙側(cè)卵巢投入10%中性福爾馬林中固定,常規(guī)石蠟切片,蘇木素-伊紅染色,顯微鏡下測(cè)定卵泡直徑。將卵泡按大、中、小三類分別計(jì)數(shù),求其百分比。卵泡分類標(biāo)準(zhǔn):直徑在100μm以上為大型卵泡;直徑在100μm以下的有卵泡腔卵泡為中型卵泡;無卵泡腔的最小卵泡為小型卵泡[14]。

1.2.2.4 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)采用 SPSS11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物堿提取的正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

試驗(yàn)結(jié)果(表2)表明,生物堿的最佳超聲提取條件為:乙醇濃度60%,提取時(shí)間20min,提取3次,料液比1∶10。各因素對(duì)生物堿的提取率影響大小依次為料液比、溶劑濃度、超聲提取次數(shù)、提取時(shí)間。

表2 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果分析Tab.2L9(34)orthogonal experimental designand the analysis of the result

2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

準(zhǔn)確稱取5份中藥樣品(各1.00g)于三角燒瓶中,根據(jù)以上正交實(shí)驗(yàn)篩選所得最佳提取工藝條件對(duì)中藥"復(fù)方促孕散"平行提取5次。重復(fù)單因素試驗(yàn),過濾,濾液分別用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度,并計(jì)算出中藥中鹽酸水蘇堿的含量。

由表3可知,按最優(yōu)提取工藝提取“促孕散”生物堿得生物堿含量為1.1477%。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)Tab.3verification test

2.3 “促孕散”生物堿提取物促孕活性

2.3.1 子宮增重結(jié)果

子宮與體重之比值的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表4。

從試驗(yàn)結(jié)果(表4)可以看出,與空白組相比,“促孕散”生物堿提取物組均明顯促進(jìn)小鼠子宮增重(P<0.01),但與雌二醇組相比差異不顯著。

2.3.2 卵巢的發(fā)育影響

各組小鼠卵巢中各種類型卵泡所占百分比和最大卵泡直徑測(cè)定結(jié)果見表5。

從表5可以看出,雌二醇組、“促孕散”生物堿提取物組與空白組相比大型卵泡數(shù)量百分比的差異極顯著(P<0.01);大型卵泡最大直徑與正常組差異顯著(P<0.01)。各組與空白組的中型卵泡數(shù)量百分比差異顯著(P<0.01);各組小型卵泡數(shù)量百分比極顯著低于正常組(P<0.01)。

表4 各組對(duì)雌性的小鼠子宮的影響Tab.4 The effect on the uterine of the female Musmusculus albus in different group

表5 小鼠卵巢中各種類型卵泡百分比及最大卵泡直徑Tab.5The percentage of three typus of ovarian follicle and the max follicular Diameter

3 討論

目前,益母草制劑中鹽酸水蘇堿的含量測(cè)定應(yīng)用較多的方法有用高效液相法、薄層掃描法和超聲提取法,但前兩種方法的前處理過程較復(fù)雜,且成本昂貴,本研究采用的超聲法對(duì)“促孕散”中生物堿的最佳提取工藝為:溶劑60%乙醇,料液比1∶10,超聲提取次數(shù)3次,每次20min;測(cè)得的生物堿含量達(dá)1.1477%。這與張師愚等[15]利用95%乙醇超聲提取益母草中生物堿的效率接近,比吳海林等[16]等應(yīng)用HPLC法對(duì)益母草中鹽酸水蘇堿的提取效率略低。與常規(guī)提取方法相比,超聲波提取具有提取時(shí)間短,提取效率高,成本低等特點(diǎn)。因此,超聲法是中藥復(fù)方制劑中生物堿提取的一種較理想方法。

中藥復(fù)方中包含大量的植物莖葉,其色素成分會(huì)影響試驗(yàn)中生物堿含量測(cè)定結(jié)果,試驗(yàn)中采用等劑量乙酸乙酯和活性炭雙重除色法,有效地降低了色素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響,減少了試驗(yàn)誤差。

利用小鼠子宮增重法檢測(cè)藥物的雌激素活性是一種最常用的評(píng)價(jià)雌激素作用的方法[17]。本研究中的活性試驗(yàn)結(jié)果表明,給予雌性小鼠生物堿提取物后,小鼠子宮增重作用明顯。這表明,“促孕散”生物堿有促進(jìn)小鼠子宮發(fā)育的作用。

卵泡成熟的程度是衡量卵巢發(fā)育的重要依據(jù)之一。本試驗(yàn)結(jié)果顯示,生物堿提取物組連續(xù)灌服給藥7d后,該組小鼠的大型卵泡比例為36.68%,比空白組提高了5倍,差異極顯著,而中型卵泡數(shù)量比空白組反而要少。空白組的中型卵泡數(shù)量最多,大型卵泡數(shù)量極少。這說明灌服生物堿提取物后促進(jìn)了中型卵泡向大型卵泡的發(fā)育,提示:生物堿提取物能促進(jìn)卵巢發(fā)育,促使性成熟形態(tài)學(xué)特征提前出現(xiàn),啟動(dòng)新的發(fā)情周期。

本試驗(yàn)確認(rèn)了中藥復(fù)方“促孕散”生物堿有較強(qiáng)的活性作用,能夠促進(jìn)小鼠卵泡發(fā)育。

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