小鼠胚胎干細(xì)胞移植后兩種示蹤方法的比較

關(guān)云謙，謝 淑，孫靜敏，鄒春林，陳 凌，張 愚

1首都醫(yī)科大學(xué) 宣武醫(yī)院 老年病研究所細(xì)胞治療室，北京 100053 2教育部神經(jīng)變性病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100053 3國家人類基因組北方研究中心，北京 100176 4空軍第三通信修理所衛(wèi)生所，北京 100075

小鼠胚胎干細(xì)胞移植后兩種示蹤方法的比較

關(guān)云謙1，2，謝 淑3，孫靜敏4，鄒春林1，2，陳 凌1，2，張 愚1，2

1首都醫(yī)科大學(xué) 宣武醫(yī)院 老年病研究所細(xì)胞治療室，北京 1000532教育部神經(jīng)變性病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 1000533國家人類基因組北方研究中心，北京 1001764空軍第三通信修理所衛(wèi)生所，北京 100075

目的觀察小鼠胚胎干細(xì)胞 (ES)移植入大鼠腦內(nèi)后綠色熒光蛋白 (GFP)質(zhì)粒和Thy-1抗體在指示細(xì)胞及細(xì)胞分化方面的特點(diǎn)。方法標(biāo)記方法一:將p-EGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入ES細(xì)胞，連續(xù)10代抗生素篩選表達(dá)GFP的GFPES，并將GFP-ES移植入活體大鼠腦內(nèi)。取材后冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察切片上的綠色熒光。標(biāo)記方法二:直接移植胚胎干細(xì)胞后取材，用特異性抗小鼠Thy-1抗體作移植細(xì)胞的免疫組織化學(xué)染色，熒光顯微鏡下觀察。另外，兩種標(biāo)記方法均做神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的特異抗體神經(jīng)細(xì)胞核抗體 (NeuN)和膠質(zhì)原纖維酸性蛋白 (GFAP)的免疫組織化學(xué)染色，觀察是否與GFP或Thy-1抗體雙標(biāo)記，以此判定細(xì)胞分化情況。結(jié)果GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化后的ES細(xì)胞團(tuán)和單細(xì)胞均表達(dá)亮綠色的GFP，轉(zhuǎn)化效率為30%;移植21d后，大鼠腦內(nèi)存活的移植細(xì)胞仍表達(dá)GFP，但不能和NeuN、GFAP的染色雙標(biāo)記。大量Thy-1陽性的植入細(xì)胞和NeuN、GFAP雙標(biāo)記。結(jié)論GFP質(zhì)粒標(biāo)記胚胎干細(xì)胞后移植可以較好地顯示移植細(xì)胞，但不能觀察細(xì)胞分化;而Thy-1抗體不僅在顯示移植細(xì)胞上有較好的效果，還可以準(zhǔn)確地標(biāo)記分化細(xì)胞。

綠色熒光蛋白;胚胎干細(xì)胞;分化

干細(xì)胞移植治療常需要在體外對(duì)將要移植的細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，使這些細(xì)胞植入及體內(nèi)分化后仍能攜帶標(biāo)記，借此可以對(duì)其進(jìn)行監(jiān)測(cè)。標(biāo)記方法有多種，早期使用的有生物染料DiI等［1］，還有利用干細(xì)胞不斷增殖的特性，使其在復(fù)制過程中攝取一些放射性標(biāo)記的堿基，例如H3-胸苷［2］，或堿基的類似物，例如5溴-2脫氧尿苷 (5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)［3］，再用同位素顯影或者抗體檢測(cè)的方法。但是，生物染料可能在植入細(xì)胞死亡后漏出，再被宿主細(xì)胞攝取形成假相;BrdU類方法的缺陷在于植入的細(xì)胞無論是否存活，都可以被檢測(cè)到。近年有學(xué)者利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，使綠色熒光蛋白 (green fluorescent protein，GFP)基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞，可以用熒光顯微鏡直接觀察［4］，還便于進(jìn)行抗體雙標(biāo)記鑒定細(xì)胞的分化情況;另一個(gè)明顯優(yōu)于BrdU類方法的特點(diǎn)是:只有活細(xì)胞才表達(dá)GFP，GFP熒光的存在表明植入的細(xì)胞在取材當(dāng)時(shí)是活細(xì)胞。另一種在移植實(shí)驗(yàn)中常采用的示蹤方法，即用特異性抗小鼠的抗體做植入細(xì)胞的標(biāo)記，這樣的抗體有M2、Thy-1等。其中小鼠Thy-1抗原是在小鼠神經(jīng)細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞特異性表達(dá)的抗原，本研究選取的抗小鼠Thy-1抗體與大鼠和人無交叉反應(yīng)，而且大鼠腦組織中也無Thy-1抗原。所以抗小鼠Thy-1抗體可以用來做小鼠ES細(xì)胞分化成為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的檢測(cè)［5-7］。本研究主要比較GFP標(biāo)記和Thy-1染色兩種方法在鑒定小鼠ES細(xì)胞移植后的存活、分化等情況時(shí)的特點(diǎn)。

材料和方法

材料 小鼠ES細(xì)胞由Stanford大學(xué)Okada博士贈(zèng)送。細(xì)胞培養(yǎng)器皿使用美國Falcon公司產(chǎn)品。細(xì)胞培養(yǎng)試劑購自美國GIBCO/BRL公司。PEGFP-N1質(zhì)粒購自美國CLONTECH公司。聚陽離子脂質(zhì)體(Lipofectamine)購自美國Invitrogen公司。免疫抑制劑環(huán)胞霉素A購自諾華制藥 (中國)有限公司。小鼠抗小鼠 Tuj-1(β-tubulin-Ⅲ)IgG抗體購自美國Promega公司，兔抗小鼠Thy-1購自美國Santa Cruz。質(zhì)粒DNA提取采用美國Promega公司的“Wizard PureFection”質(zhì)粒DNA純化系統(tǒng) (Wizard PureFection Plasmid DNA Purification System)。美國 Pharmagen公司GENETVX-MAC 8.0分光光度計(jì)。美國BIO-RAD公司激光共聚焦顯微鏡，型號(hào)MRC-1024。Nikon TE2000-U型倒置熒光顯微鏡，SPOT-RT冷卻式數(shù)字顯微攝像系統(tǒng)。

ES細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠ES細(xì)胞在鋪有明膠的培養(yǎng)瓶中使用下述培養(yǎng)基培養(yǎng):DMEM、15%胎牛血清、100 mmol/L 非必需氨基酸、0.55 mmol/L β-巰基乙醇、L谷氨酸、青鏈霉素，使用前添加1 000 U/ml人類白血病抑制因子 (human leukemia inhibition factor，hLIF)。隔天換液，2～3 d后細(xì)胞長滿瓶底，按照1∶5 比例傳代［8］。

大腸桿菌中常規(guī)擴(kuò)增pEGFP-N1質(zhì)粒 質(zhì)粒的提取按照“Wizard PureFection”質(zhì)粒DNA純化系統(tǒng)使用說明進(jìn)行［9］。用GENETVX-MAC 8.0分光光度計(jì)測(cè)定質(zhì)粒DNA的濃度。

質(zhì)粒DNA與脂質(zhì)體共同轉(zhuǎn)化ES細(xì)胞 轉(zhuǎn)化前1 d，將5×105ES細(xì)胞傳代到25 cm2培養(yǎng)瓶，過夜培養(yǎng)后細(xì)胞貼壁。轉(zhuǎn)化之前，首先將3 μg GFP-DNA加入到1 ml去除血清和青鏈霉素的ES細(xì)胞培養(yǎng)基中(A管)，將18 μl脂質(zhì)體加入到去除血清和青鏈霉素的ES細(xì)胞培養(yǎng)基1 ml中 (B管)，將A、B管混合，輕柔搖勻，靜置30 min待脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物形成，將普通ES培養(yǎng)基換成A、B管混合后形成的培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜棄去，恢復(fù)普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基中添加500 μg/ml G418。連續(xù)10代G418傳代培養(yǎng)。

細(xì)胞移植和組織處理 取健康雄性SD大鼠8只(購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所)，體重300～330 g。移植術(shù)前3 d到術(shù)后處死日每天按照10 mg/kg劑量腹腔注射免疫抑制劑環(huán)胞霉素A。移植的細(xì)胞采用轉(zhuǎn)化后第10～12代、傳代后24 h、處于對(duì)數(shù)生長期的GFP-ES，將胰酶消化后打散的GFP-ES細(xì)胞以 (5～6)×107/ml密度移植。將大鼠麻醉后固定在立體定位儀上，以前囟為坐標(biāo)原點(diǎn)，按照以下位置:前囟向后2 mm，旁開3.5 mm，深5 mm(尾殼核)，用微量進(jìn)樣器植入 (2.5～3) ×105個(gè) ES細(xì)胞 (5 μl)，植入速度為1 μl/min，植入完畢后留針5 min［10］。動(dòng)物飼養(yǎng)21 d后深麻醉處死，100 ml生理鹽水、300 ml 4%多聚甲醛經(jīng)心灌注固定取腦，腦組織經(jīng)后固定、梯度蔗糖脫水后液氮速凍，注射針孔前2.0 mm到后2.0 mm連續(xù)20 μm冰凍切片，10%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

免疫組織化學(xué)檢測(cè) 將冰凍切片用0.01 mol/L PBS洗滌，1%Triton X-100孵育4℃過夜，PBS洗滌，羊血清封閉30 min，1∶400鼠抗鼠神經(jīng)細(xì)胞核(neuronal nuclei，NeuN)，1∶400 鼠抗鼠膠質(zhì)原纖維酸性蛋白 (glial fibrillary acidic protein，GFAP)一抗4℃過夜，PBS洗滌，羊抗兔 Texas Red熒光二抗避光孵育2 h，PBS洗滌，10%甘油封片，熒光顯微鏡觀察。

激光共聚焦顯微鏡斷層掃描 油鏡 (×100)對(duì)視野中的綠色細(xì)胞進(jìn)行掃描，參數(shù)設(shè)置如下:激發(fā)光波長:綠色光488 nm，紅色光596 nm。

細(xì)胞雙標(biāo)比例計(jì)數(shù) 在每只大鼠約200張切片中選擇第75～125張，每隔5張取2張切片，分別做GFP和NeuN抗體、GFAP抗體的免疫雙標(biāo)記染色，以及Thy-1和NeuN、GFAP的免疫熒光雙標(biāo)記染色。每張切片在紋狀體區(qū)隨機(jī)選取10個(gè)視野。在熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)與GFP雙標(biāo)的、同時(shí)表達(dá)NeuN、GFAP的細(xì)胞占GFP陽性細(xì)胞的比例，以及與Thy-1雙標(biāo)記的NeuN、GFAP陽性細(xì)胞占Thy-1陽性細(xì)胞的比例。

結(jié) 果

GFP-質(zhì)粒-脂質(zhì)體復(fù)合物轉(zhuǎn)化 ES細(xì)胞過夜后，第2天即可見到大量細(xì)胞表達(dá)GFP，熒光顯微鏡下無論是細(xì)胞團(tuán)還是散在細(xì)胞均為亮綠色 (圖1A)。隨機(jī)選取1 000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，對(duì)比表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞和光鏡下 (圖1B)可見的細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果30%～40%的細(xì)胞表達(dá)GFP熒光。向培養(yǎng)基添加500 μg/ml G418后，部分未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞死亡。

攜帶GFP的ES植入活體大鼠腦組織后，經(jīng)過21 d，在全部8只大鼠的注射位點(diǎn)針道周圍2 mm范圍內(nèi)均可看到移植入的細(xì)胞表達(dá)亮綠色的GFP，可以和宿主本身的組織清晰地區(qū)別開來 (圖2A)。利用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行斷層掃描，可以清楚地計(jì)數(shù)每一層的細(xì)胞數(shù)量 (圖2B)。注射位點(diǎn)的綠細(xì)胞仍然聚集存在，距離注射位點(diǎn)越遠(yuǎn)，綠細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，移植針道周圍有密集的表達(dá)Tuj-1(紅色)的神經(jīng)元 (圖2A)。與此相對(duì)應(yīng)，Thy-1抗體的熒光和NeuN或者GFAP的熒光重合較好，移植細(xì)胞所表達(dá)的Thy-1綠色熒光和NeuN(圖3A、B、C)、GFAP(圖3D、E、F)表達(dá)的紅色熒光可以較好地重合。經(jīng)過雙標(biāo)記細(xì)胞計(jì)數(shù)可以得出，與Thy-1雙標(biāo)記的NeuN、GFAP陽性細(xì)胞占Thy-1陽性細(xì)胞的79%～90%和16%～28%。

討 論

干細(xì)胞因其具有較強(qiáng)的增殖能力可以解決移植所需要的細(xì)胞數(shù)量的問題，同時(shí)具有分化的全能性，可以分化成為多種組織細(xì)胞，所以被認(rèn)為在治療嚴(yán)重的組織損傷、退行性變等疾病中具有潛在應(yīng)用價(jià)值［11］。利用ES細(xì)胞移植治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究，例如帕金森病、脫髓殼疾病等方面已經(jīng)取得了較好的效果［12-13］，這些研究工作的開展需要對(duì)移植細(xì)胞進(jìn)行有效的標(biāo)記。

GFP標(biāo)記干細(xì)胞是一種較好的方法，將GFP基因轉(zhuǎn)入干細(xì)胞的常用載體有病毒和質(zhì)粒兩種。使用病毒給ES細(xì)胞標(biāo)記GFP可以形成穩(wěn)定的表達(dá)，但是病毒轉(zhuǎn)染需要的實(shí)驗(yàn)條件比較復(fù)雜。質(zhì)粒標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)是簡便有效，不足之處是轉(zhuǎn)染效率低。質(zhì)粒標(biāo)記為不穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，理論上質(zhì)粒DNA能使0.001%～1%的細(xì)胞形成穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，pEGFP-N1質(zhì)粒所轉(zhuǎn)入的GFP基因上連接有G418(新霉素)抗性基因，連續(xù)抗生素傳代培養(yǎng)后可以形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化細(xì)胞株。但是本研究小鼠ES細(xì)胞移植前經(jīng)過連續(xù)10～12代500 μg/ml G418培養(yǎng)尚不足以形成穩(wěn)定的GFP-ES細(xì)胞株，只能保持60% ～70%的細(xì)胞表達(dá)GFP。

移植實(shí)驗(yàn)證實(shí)植入活體大鼠尾殼核的細(xì)胞經(jīng)過3周后，熒光顯微鏡下可以直接觀察到仍有多量細(xì)胞表達(dá)GFP，可以方便地進(jìn)行這些區(qū)域存活細(xì)胞計(jì)數(shù)。具體到細(xì)胞分化情況，在移植區(qū)域表達(dá)GFP的細(xì)胞周圍聚集存在多量表達(dá)Tuj-1的細(xì)胞，但對(duì)側(cè)尾殼核并不存在，所以這些表達(dá)Tuj-1的神經(jīng)元應(yīng)當(dāng)來自移植細(xì)胞，Thy-1抗體和Tuj-1、GFAP的雙標(biāo)記也證明了這一點(diǎn)。未發(fā)現(xiàn) GFP熒光與 Tuj-1、NeuN或者GFAP的重合，表明這些分化的植入細(xì)胞不再表達(dá)GFP，原因可能是分化了的細(xì)胞是移植前未被GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入的細(xì)胞，也可能由于質(zhì)粒轉(zhuǎn)入過的細(xì)胞分化以后丟失了GFP。所以質(zhì)粒標(biāo)記可以用于觀察細(xì)胞是否能夠經(jīng)過移植操作后存活下來的實(shí)驗(yàn)，但不能有效地說明ES細(xì)胞的分化情況。

Thy-1又稱為CD-90，是一種特異性地在小鼠T淋巴細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)的糖蛋白。五步法細(xì)胞分化實(shí)驗(yàn)證實(shí)，小鼠胚胎干細(xì)胞分化成為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞前均不表達(dá)Thy-1，而分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞后Thy-1才和神經(jīng)元特征性的抗原NeuN、星形膠質(zhì)細(xì)胞特征性抗原GFAP雙標(biāo)記。小鼠ES細(xì)胞腦內(nèi)移植實(shí)驗(yàn)證實(shí)，表達(dá)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志抗原的細(xì)胞同時(shí)表達(dá)Thy-1，證明了這些移植細(xì)胞分化成為了神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。結(jié)合體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)可以看出，Thy-1對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞分化成為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞可以特異性地顯示，但其對(duì)于分化成為神經(jīng)細(xì)胞前的各個(gè)細(xì)胞階段均不能有效示蹤。

綜上，通過GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞和分化后用特異性抗體顯示移植細(xì)胞兩種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，適當(dāng)?shù)貙?duì)這兩種方法進(jìn)行選擇，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)移植細(xì)胞的有效標(biāo)記。

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小鼠胚胎干細(xì)胞移植后兩種示蹤方法的比較

圖1 p-EGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化小鼠胚胎干細(xì)胞 (×200)Fig 1 Transfection of mouse embryonic stem cell with p-EGFP-N1 plasmid(×200)

圖2 經(jīng)GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的胚胎干細(xì)胞移植后21d的免疫組織化學(xué)染色Fig 2 Immuno-staining of pEGFP-N1 plasmid transfected mouse embryonic stem cells 21 days after transplantation

小鼠胚胎干細(xì)胞移植后兩種示蹤方法的比較

Comparison of Two Tracing Method of Transplanted Mouse Embryonic Stem Cell

GUAN Yun-qian1，2，XIE Shu3，SUN Jing-min4，ZOU Chun-lin1，2，CHEN Ling1，2，ZHANG Yu1，2

1Department of Cell Therapy，Xuanwu Hospital，Capital Medical University，Beijing 100053，China2Key Lab of Neurodegenerative Diseases of Education Ministry，Beijing 100053，China3Chinese National Human Genome Center，Beijing 100176，China4Health Center of the Third Communication Device Repair Shop of Air Force，Beijing 100075，China

CHEN Ling Tel:010-83198852，E-mail:chlyz34@163.com

ObjectiveTo trace the embryonic stem(ES)cells transplanted into rat brain by labeling the cells with green fluorescent protein(GFP)and by mouse neuronal specific antibody Thy-1 and compare their features.MethodsFor GFP labeling，transfect pEGFP-N1 plasmid containing GFP and anti-neomycin sequences into embryonic stem cell and add neomycin for more than 10 passages.To test the GFP expressionin vivo，the GFP-ES was transplanted into healthy rat brain，and the frozen sectioned slides wereobserved under fluorescence microscope and laser con-focal microscope 21 days later.For the amtibody labeling，embryonic stem cells were directly transplanted into the rat brain.The specific mouse thy-1 antibody was used in immunostaining of transplanted cells.For both of the two labeling method，the slides were also examined by double labeling with the antibodies，neuronal nuclei(NeuN)or glial fibrillary acidic protein(GFAP)to identify the differentiation of transplanted cells.ResultsBoth single ES cell and cell pellets expressed bright green fluorescence the day after plasmid transfection，and more than 30%ES cells were labeled.The GFP-labeled cells could still be found gathered around the infusion channel at least 21 days later，but the GFP fluorescent could not be overlapped with NeuN or GFAP staining.On the contrary，Thy-1 antibody overlapped well with NeuN or GFAP staining.Conclusions Liposome-helped plasmid GPF transfection is effective in labeling mouse embryonic stem cellin vivo，but is not effective in showing the differentiated cells.On the contrary，Thy-1 antibody can not only show the transplanted cells，but also trace the transplanted cells after their differentiation.

green fluorescent protein;embryonic stem cell;differentiation

Acta Acad Med Sin，2010，32(4):445-448

陳 凌 電話:010-83198852，電子郵件:chlyz34@163.com

Q2-33

A

1000-503X(2010)04-0445-04

10.3881/j.issn.1000-503X.2010.04.019

(本文圖1～3見插圖第4、5頁)

2009-06-29)

國家自然科學(xué)基金 (30940039，30970939)，國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (2006CB943703)和北京市科委科技計(jì)劃(H020220010290)Supported by the National Natural Sciences Foundation of China(30940039，30970939)，National Basic Research Program of China(973 Program)(2006CB943703)，and Scientific Project of Beijing Municipal Science＆ Technology Commission(H020220010290)

圖3 Thy-1抗體顯示胚胎干細(xì)胞移植入正常大鼠腦內(nèi)21d后的分化 (×200)Fig 3 Differentiation of mouse embryonic stem cells identified by Thy-1 antibody 21 days after transplantation into normal rat brain(×200)

·短篇論著·