腫瘤突變負(fù)荷在胃癌中的應(yīng)用研究進(jìn)展

衛(wèi)江鵬，余鵬飛，楊鈞，王偉東，高瑞祺，楊西勝，李曉華，季剛

（中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸外科，陜西西安710032）

胃癌（gastric cancer，GC） 是世界上第三大癌癥相關(guān)死亡原因[1]。中國(guó)2015年胃癌新發(fā)病例67.91 萬(wàn)例，死亡49.8 萬(wàn)例，占世界胃癌死亡人數(shù)的一半以上[2]。以免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitors，ICI） 為主的免疫治療顯著提高了晚期惡性腫瘤患者的客觀緩解率（objective mitigation rate，ORR）和總生存期（overall survival，OS），但并非所有患者在免疫治療獲益，因而需要發(fā)現(xiàn)更好的預(yù)測(cè)標(biāo)志物，并篩選出對(duì)免疫治療潛在獲益的患者亞群，同時(shí)進(jìn)一步闡明免疫治療方法具體機(jī)制。腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutational burden，TMB）是指特定基因組區(qū)域內(nèi)每兆堿基對(duì)（Mb）體細(xì)胞非同義突變的個(gè)數(shù)，可以間接反映腫瘤產(chǎn)生新抗原的能力和程度，已被證實(shí)可預(yù)測(cè)多種腫瘤的免疫治療療效[3-5]，但在胃癌臨床研究和實(shí)踐過(guò)程中TMB 評(píng)估尚無(wú)統(tǒng)一結(jié)論，本文現(xiàn)就TMB 在胃癌免疫治療領(lǐng)域的研究進(jìn)展進(jìn)行文獻(xiàn)綜述，旨在為胃癌患者的免疫臨床治療提供一定的基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 TMB概述

TMB 是腫瘤基因組去除胚系突變后的體細(xì)胞突變數(shù)量，是指在腫瘤細(xì)胞基因組中,所評(píng)估基因的編碼區(qū)發(fā)生置換、插入和缺失性突變的總和，即體細(xì)胞突變的總數(shù)，也可以非同義突變來(lái)表示[3-5]。腫瘤細(xì)胞在基因?qū)用嫔峡砂l(fā)生大量具有特異性的突變，突變基因可產(chǎn)生新的蛋白，這些蛋白或其降解產(chǎn)物被主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC） 遞呈至腫瘤細(xì)胞表面形成腫瘤新抗原，每150 個(gè)非同義突變可能產(chǎn)生1～2 個(gè)新抗原,這些新抗原則可被自身免疫系統(tǒng)識(shí)別,從而激活CD8+T 細(xì)胞,引起免疫反應(yīng)[6-7]。當(dāng)非同義突變?cè)蕉?則會(huì)有越多的新抗原被自身免疫系統(tǒng)識(shí)別，可引起的自身免疫效果則越強(qiáng),因此當(dāng)TMB越高，就越容易從免疫抑制劑治療中獲益[8-9]，因此理論上來(lái)說(shuō)，TMB 有望成為ICI 的療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物。

2 胃癌TMB檢測(cè)方法

目前臨床實(shí)踐中組織腫瘤突變負(fù)荷（tissue tumor mutational burden，tTMB）檢測(cè)最為常見(jiàn)，大多數(shù)研究認(rèn)為血液腫瘤突變負(fù)荷（blood tumor mutational burden，bTMB） 檢測(cè)準(zhǔn)確性有待進(jìn)一步驗(yàn)證[10]。目前推薦使用近期石蠟包埋腫瘤組織樣本進(jìn)行tTMB 檢測(cè)，但應(yīng)首先完成病理質(zhì)控并確保胃癌細(xì)胞數(shù)能夠滿足檢測(cè)要求，通過(guò)采集患者外周血、唾液或正常組織作為對(duì)照樣本以過(guò)濾胚系突變對(duì)后續(xù)tTMB 評(píng)估的影響[11]。全外顯子組測(cè)序（WES）是進(jìn)行TMB 檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)采用WES 所得的TMB 與免疫治療臨床獲益相關(guān)。但成本較高、樣本需求量較大、數(shù)據(jù)分析較復(fù)雜限制了其臨床引用，靶向測(cè)序Panel 聚焦于大量腫瘤相關(guān)基因，可以結(jié)合生物信息學(xué)算法快速高效檢測(cè)腫瘤靶基因組改變。因此，采用靶向測(cè)序Panel 進(jìn)行腫瘤基因組分析已成為WES 在臨床檢測(cè)的另一種選擇[12-13]，目前要求靶向測(cè)序Panel 覆蓋范圍原則上不應(yīng)約1.0 Mb，最低有效測(cè)序深度應(yīng)≥500×，且其TMB 評(píng)估結(jié)果應(yīng)于WES 評(píng)估的TMB進(jìn)行一致性評(píng)價(jià)[11]，納入影響蛋白質(zhì)編碼的體細(xì)胞突變，保證檢出突變頻率≥5%的體細(xì)胞突變，以確保TMB 檢測(cè)值的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

3 TMB與胃癌的臨床病理分子生物學(xué)關(guān)系

3.1 TMB與胃癌臨床病理特征研究

目前，多個(gè)臨床研究分析了胃癌組織中TMB 表達(dá)情況，并進(jìn)一步評(píng)估了TMB 表達(dá)與臨床病理關(guān)系。Cai 等[14]檢測(cè)了153 例胃癌的TMB，平均TMB 為5.801 突變/Mb，并分為低TMB （1～5 個(gè)突變/Mb）、中TMB（6～19 個(gè)突變/Mb）和高TMB（≥20 個(gè)突變/Mb）[15]。相似的，在另一項(xiàng)包含58 例胃癌在內(nèi)的100 000 例腫瘤標(biāo)本的TMB 檢測(cè)中，胃癌平均TMB值為5 突變/Mb，其中高TMB （>20 突變/Mb） 占19%[16]。在另一項(xiàng)研究中，因?yàn)?5%的TMB<11.4 突變/Mb，因而選擇≥11.4 突變/Mb 定義為高TMB[17]，但也有研究則將TMB>12 突變/Mb 定義為高TMB[18]。Cho 等[19]檢測(cè)了330 列胃癌患者TMB，其中11%患者為高TMB （≥10.5 突變/Mb），其中病理分型是19% 腸型，3% 彌漫型[20]，15% 的混合/不確定類型。高TMB 易發(fā)生在中分化管狀腺癌、Lauren 腸型、基質(zhì)和免疫評(píng)分低、ATM 基因缺失患者，并首次發(fā)現(xiàn)克羅恩樣淋巴（Crohn's-like lymphoid reaction，CLR） 細(xì)胞免疫反應(yīng)及TNM 早期患者更易出現(xiàn)高TMB， 但與HER-2、 EGFR、 FGFR-2、MET 等基因表達(dá)狀態(tài)無(wú)相關(guān)性。在65 歲以上女性，TNM 分期早， T1-2期，無(wú)淋巴結(jié)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中觀察到高TMB。然而，TMB 值與M 分期或組織學(xué)分級(jí)之間無(wú)顯著差異[21]。以上結(jié)果表明，胃癌組織TMB 值總體較其它腫瘤相對(duì)偏低，高TMB 值一般定義為>10.5～20 突變/Mb，并呈現(xiàn)出一定的臨床病理特征。

3.2 TMB與胃癌分子生物學(xué)相關(guān)性研究

在一項(xiàng)納入了375 例胃癌患者的TGCA 數(shù)據(jù)中，15.7%（118/375）患者出現(xiàn)高TMB，并從中篩選出632 個(gè)上調(diào)基因和979 個(gè)下調(diào)基因[22]，進(jìn)一步通路分析顯示高TMB 組患者與神經(jīng)活性配體受體相互作用、cAMP 信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路有關(guān)。高TMB 組活化的CD4+記憶T 細(xì)胞、濾泡輔助性T 細(xì)胞、靜止期NK 細(xì)胞、M0 和M1 巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)均高于低TMB 組。張帥等[23]通過(guò)研究TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中88 對(duì)胃癌組織與癌旁組織分析了CTF1 表達(dá)與TMB 和免疫細(xì)胞浸潤(rùn)的關(guān)系，結(jié)果表明CTF1 高表達(dá)患者的TMB 越高。此外NOTCH3 分子作為公認(rèn)的胃癌患者良好的預(yù)后因子，與TMB水平呈負(fù)相關(guān)，高NOTCH3 表達(dá)的患者的TMB 評(píng)分明顯低于低NOTCH3 表達(dá)的患者，而在NOTCH3 高表達(dá)的患者中，IPRES 標(biāo)志（代表對(duì)ICI 治療的抵抗）和TIDE 評(píng)分（描述CD8+T 細(xì)胞的功能障礙和衰竭）均較高[24]。

P53 基因是最重要的腫瘤抑制因子之一，與腫瘤的發(fā)生有關(guān)在廣泛的癌癥相關(guān)途徑的調(diào)控中，如細(xì)胞周期、凋亡、DNA 損傷修復(fù)、代謝、炎癥等以及免疫反應(yīng)、血管生成和轉(zhuǎn)移。TP53 突變可能導(dǎo)致染色體/基因組突變不穩(wěn)定性從而提高TMB值。對(duì)356 例胃腫瘤組織的基因測(cè)序結(jié)果表明，TP53 突變型較野生型組有更高的TMB 水平[25]，這一結(jié)果表明TP53 引起TMB 水平改變程度取決于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。對(duì)免疫因子的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TMB 水平與自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK）水平，細(xì)胞溶解水平、抗炎因子比例及M1/M2 巨噬細(xì)胞比例水平相關(guān)，這進(jìn)一步解釋了TP53 突變的胃腫瘤組織更容易發(fā)生免疫豁免[26]。

此外，Li 等[27]通過(guò)Hub 基因分析確定了6 個(gè)影響胃癌預(yù)后的基因，分別是FBN1、FN1、HGF、MMP9、THBS1 和VCAN，這6 個(gè)基因的非沉默突變?cè)赥MB 高表達(dá)中發(fā)揮重要作用，并可能通過(guò)影響腫瘤純度。同時(shí)他們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)CXCR4 基因高表達(dá)的患者有較低TMB 值[28]。其它分子如ANTXR1、DYNC1H1、CENPF 及KIF26B 突變均與TMB 值相關(guān)[22,29]。但以上結(jié)果均為TMB 與胃癌生物分子相關(guān)性研究，均未能進(jìn)一步闡明具體機(jī)制，未來(lái)有待進(jìn)一步基礎(chǔ)研究。

4 TMB與胃癌免疫治療

4.1 胃癌中TMB、MSI及PD1/PDL1表達(dá)的關(guān)系

Weinberg 等[30]分析了581 例胃癌標(biāo)本，其中9.3%的腫瘤為PD-L1 陽(yáng)性，當(dāng)PD-L1 是1+時(shí)（1%閾值）有30（5.2%）例的患者是高TMB 或MSI-H，若以PD-L1 是2+為閾值則有64 例的患者是高TMB或MSI-H，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)原發(fā)腫瘤的高TMB（8.8%vs.3.9%）的發(fā)生率高于轉(zhuǎn)移瘤。一項(xiàng)對(duì)食管胃結(jié)合部腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)在PD-L1 陽(yáng)性和陰性患者中平均TMB 值分別為6.1 突變/Mb 和3.7 突變/Mb，兩組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明TMB 與PD-L1 存在相關(guān)性[31]。在一項(xiàng)對(duì)330 列胃癌患者檢測(cè)中顯示，高TMB 在MSI-H（n=19）中最高，但也有部分在MSS組中TP53 突變型（n=10） 和TP53 野生型（n=8）分布。高TMB 組PD-L1 陽(yáng)性率（78.4%） 高于低TMB 組（64.6%），但差異不顯著。然而，在高TMB 亞組中，MSI-H 患者PD-L1 陽(yáng)性率最高[19]。

4.2 TMB對(duì)免疫治療的預(yù)測(cè)價(jià)值

一項(xiàng)研究表明中國(guó)胃癌中MSI-H 的檢出率較低（2.3%）[32]，而來(lái)自其他國(guó)家的胃癌患者中MSI-H為18%～22%[33-34]，這表明MSI-H 可能并不適用于篩查胃癌患者對(duì)免疫治療的反應(yīng)，聯(lián)合其他生物標(biāo)志物的預(yù)測(cè)價(jià)值有待進(jìn)一步研究。TMB 作為新型的免疫治療標(biāo)志物，多篇文章報(bào)道了腫瘤患者TMB 越高，預(yù)后越好[18,35-36]。Kim 等[37]通過(guò)回顧性分析63 例接受免疫治療的晚期胃癌患者臨床資料，評(píng)估了TMB 是否與免疫治療反應(yīng)相關(guān)，并探討其與進(jìn)展期胃癌免疫治療反應(yīng)的其他生物標(biāo)志物的關(guān)系，結(jié)果表明高TMB 與ICI 治療有效性、化療有效性相關(guān)，高TMB（≥14.31 突變/Mb）組無(wú)進(jìn)展生存期延長(zhǎng)，化療難治組的中位TMB（8.43 突變/Mb）明顯高于化療初治組（3.42 突變/Mb），因而TMB可作為ICI 治療進(jìn)展期胃癌患者的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物，有助于臨床決策。另一項(xiàng)研究表明TMB 較PDL1 可更有效預(yù)測(cè)托利帕利單抗治療進(jìn)展期胃癌的治療效果，其中高TMB（≥12 突變/Mb）組的OS 明顯優(yōu)于低TMB （<12 突變/Mb） 組（14.6 個(gè)月vs.4.0 個(gè)月），這項(xiàng)研究是第一次確定TMB 作為胃腸道腫瘤免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的預(yù)測(cè)性生物標(biāo)志物[38]，但其中1 例PD-L1 陰性和低TMB 的患者仍可從托利帕利單抗治療獲益，這表明還應(yīng)進(jìn)一步研究TMB 在對(duì)PD-1 抗體單一治療有反應(yīng)的胃癌患者的作用[39]。

在食管胃結(jié)合部癌患者中，高TMB 患者接受包括PD-1/PD-L1 或CTLA4 免疫治療時(shí)可獲得更好的OS，但亞組分析中126 例的OS 無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[40]。隨著TMB 每增加1 個(gè)單位，PFS 和OS 均有明顯改善，但在多變量分析中，TMB 作為一個(gè)連續(xù)變量與PFS 或OS 之間無(wú)顯著的關(guān)聯(lián)，但當(dāng)TMB 按四分位數(shù)分類時(shí)，TMB>8.78 時(shí)PFS 和OS 均有顯著改善[40]。通過(guò)建立TMB 預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分（TMB prognostic risk score，TMBPRS），以此分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低分險(xiǎn)組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高風(fēng)險(xiǎn)組總體1年OS 較差[41]。以上結(jié)果表明，胃癌高TMB 患者可從免疫治療中獲益更多，但目前總體研究數(shù)量較少，不同研究中心間結(jié)果異質(zhì)性較大，未來(lái)需進(jìn)一步前瞻性多中心研究進(jìn)一步驗(yàn)證TMB 對(duì)胃癌免疫治療的預(yù)測(cè)價(jià)值。

4.3 TMB 聯(lián)合其它免疫分子標(biāo)記物對(duì)免疫治療的預(yù)測(cè)價(jià)值

由于單純TMB 可能無(wú)法完全有效地篩選ICI 獲益人群，同樣現(xiàn)在廣泛應(yīng)用于ICI 療效預(yù)測(cè)分子標(biāo)志物的PD-L1 也不能完全精準(zhǔn)地篩選臨床獲益者，這使得人們開(kāi)始探索是否可以協(xié)同使用多個(gè)不同的分子標(biāo)志物來(lái)共同作為ICI 療效預(yù)測(cè)的指標(biāo)。

為更好的預(yù)測(cè)免疫治療所帶來(lái)的持續(xù)獲益效果（durable clinical benefit，DCB），Lu 等[42]將TMB與腫瘤拷貝數(shù)變異負(fù)荷（copy-number alterations，CNA）聯(lián)合應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)CNAs 和TMB 之間未觀察到顯著相關(guān)性，表明兩個(gè)基因組決定因素之間沒(méi)有相關(guān)性，TMB 高/CNA 低亞組的DCB 患者比例顯著高于TMB 低/CNA 高亞組（12/14）。另一項(xiàng)對(duì)56 例胃癌患者預(yù)后多因素分析結(jié)果顯示，基線病變數(shù)（baseline lesion number，BLN)是胃癌OS 的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，BLN 和TMB 聯(lián)合應(yīng)用時(shí)，低BLN 高TMB 組的療效和生存率最高，高BNL 低TMB 組的療效和生存率最差。

EB 病毒（EBV）感染與胃癌之間的關(guān)系已為人們所知，并被認(rèn)為是胃癌分子分類的重要因素之一。He 等[43]148 例胃癌患者組織檢測(cè)，其中EBV陽(yáng)性組織中TMB 的平均水平明顯高于陰性組，進(jìn)一步的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)EBV+/TMB-high 亞型的突變基因包括與JAK/STAT 通路密切相關(guān)的基因，如STAT4、CCND3、CCND2、SOCS1、JAK1 和JAK3，與EBV+/TMB-low 亞型相關(guān)的特定基因經(jīng)常涉及DNA 損傷和錯(cuò)配修復(fù)途徑， 包括MSH2、 FANCE、 PMS2、RAD50、RPA1、IKBKE 和MUTYH 等基因。將EBV與TMB 兩者聯(lián)合應(yīng)用于生存分析，結(jié)果表明在EBV 陽(yáng)性患者高TMB 較低TMB 有更好的OS，但在EBV 陰性患者TMB 水平對(duì)OS 的影響無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

綜上，TMB 的水平與胃癌臨床病理存在多種相關(guān)性，但具體機(jī)制仍不明確。TMB 的最佳臨界值仍需在未來(lái)更大的隊(duì)列中進(jìn)行徹底的研究，并進(jìn)一步建立分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，以便于更好的開(kāi)展臨床研究。雖然越來(lái)越多的證據(jù)表明，TMB 與接受ICI 治療的胃癌的療效之間存在著顯著的相關(guān)性，但TMB 的效用仍然存在爭(zhēng)議，未來(lái)需聯(lián)合其它分子標(biāo)記物更好的預(yù)測(cè)胃癌ICI 治療的效果。