胃癌中Runx3基因甲基化表達及臨床研究

何小兵，張海元 王衛(wèi)政

(長江大學醫(yī)學院，湖北 荊州 434023) (長江大學附屬第一醫(yī)院 荊州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 荊州 434000)

胃癌中Runx3基因甲基化表達及臨床研究

何小兵，張海元 王衛(wèi)政

(長江大學醫(yī)學院，湖北 荊州 434023) (長江大學附屬第一醫(yī)院 荊州市第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 荊州 434000)

目的：通過檢測胃癌中Runx3基因啟動子區(qū)域甲基化狀態(tài)及Runx3基因表達情況，探討Runx3基因啟動子區(qū)域甲基化及表達在胃癌發(fā)生和發(fā)展過程中的意義。方法：采用DNA甲基化特異性PCR(MSP)技術(shù)分別對9種胃癌細胞系和35例胃癌患者手術(shù)切除腫瘤組織及其癌旁組織Runx3基因啟動子區(qū)域甲基化進行檢測，同時采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測Runx3 mRNA的表達情況。結(jié)果：在7種胃癌細胞系中Runx3基因啟動子區(qū)域過度甲基化；Runx3基因在35例胃癌及其癌旁組織中甲基化率分別為40.0 %(14/35) 和8.6 %(3/35)；胃癌組織標本中Runx3基因表達(0.5938±0.1007) 較癌旁正常組織表達(0.8311±0.2872)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(Plt;0.05)。Runx3 mRNA在胃癌標本的表達與其病理臨床特征密切相關(guān)，在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和低分化的胃癌組織標本中Runx3 mRNA的表達顯著下調(diào)(Plt;0.01)。結(jié)論：Runx3基因啟動子區(qū)域甲基化是導致Runx3基因失活的主要原因之一，與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可作為胃癌早期診斷的分子標記物及分子治療的靶點。

胃癌；Runx3基因；甲基化；細胞系；甲基化特異性PCR；逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應

胃癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率僅次于肺癌的惡性腫瘤，在我國胃癌是發(fā)病率和死亡率很高的惡性腫瘤之一[1]。通過研究表明，胃癌是一類多基因疾病，其發(fā)病分子機制是由于端粒酶激活、抑癌基因失活和癌基因激活等[2-5]引發(fā)的多因素、多階段及多基因變異綜合病變過程。盡管癌基因的活化是促使腫瘤發(fā)生的關(guān)鍵因素之一，但抑癌基因的失活在胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起到更加常見、更加重要的作用[6]。Runx基因(runt-related transcription factor gene)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型抑癌基因，與人類多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著極其密切的關(guān)系，受到國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注。Runx家族基因的產(chǎn)物分別具有不同的生物學功能，其中Runx3對脊神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)發(fā)育及胃粘膜上皮細胞的增生有調(diào)節(jié)作用，在胃癌中Runx3基因?qū)Π┘毎纳L有明顯的抑制作用。Runx3基因在胃癌中主要以基因純合或雜合缺失以及啟動子區(qū)域過度甲基化方式失活，其中基因甲基化是表達下調(diào)的重要機制。本文主要采用MSP方法[7]檢測了9種胃癌細胞系和35例胃癌腫瘤組織及其癌旁組織Runx3基因甲基化狀態(tài)[8]，同時利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測胃癌細胞系和胃癌腫瘤組織及其癌旁組織中Runx3 mRNA的表達情況，闡明Runx3基因啟動子甲基化與胃癌發(fā)生、發(fā)展過程的關(guān)系，從而探討Runx3基因成為胃癌早期診斷的分子標記物的可能性。

1 對象與方法

1.1對象 35例胃癌組織及相對應的癌旁正常組織取自湖北省腫瘤醫(yī)院和鄂州市中心醫(yī)院腫瘤科2007年6月至2008年9月手術(shù)切除標本，所選取的胃癌患者術(shù)前均未實施放療或化療，患者年齡38～76歲，平均年齡59歲，其中男32例，女5例。

1.2方法

1.2.1標本處理 取胃癌及相關(guān)癌旁組織各一份，組織離體后立即一分為二，一份先置于液氮中速凍10min，然后置于-80℃冰箱中保存。另一份以40g/L甲醛溶液固定，制作常規(guī)病理切片，通過HE染色，確定病理診斷。

1.2.2基因組DNA提取及甲基化PCR 利用常規(guī)酚/氯仿抽提法提取DNA,并置于-20℃冰箱中暫存。取4μg DNA用去離子水稀釋至90μl，參照MSP方法[7]對稀釋的DNA進行預處理，按照Wizard DNA Clean-up Systerm說明書進行純化DNA，用50ml TE溶解DNA,儲存于-20℃冰箱中備用。設(shè)計兩對Runx3基因的甲基化引物和非甲基化引物。見表1。

PCR反應體系總體積為30μl: DNA 5μl, 10×緩沖液3μl， 氯化鎂 2.5mmol/L, 引物0.5mmol/L,dNTP(各2.5mmol/L)4.8μl, Hotstar Taq 0.5μl。MSP反應條件：95℃ 15min,95℃ 30s, 60℃ 30s, 72℃ 30s,35個循環(huán)，72℃ 10min。

1.2.3總RNA抽提及RT-PCR 按照QIAamp RNA抽提試劑盒說明書提取總RNA；將組織標本研磨后，采用Trizol試劑按照說明書提取組織樣本總RNA.通過紫外分光光度計定量總RNA,調(diào)整濃度為1μg/μl, 通過反轉(zhuǎn)錄酶(SuperScript II RNase H-Reverse Transcriptase)進行逆轉(zhuǎn)錄cDNA。設(shè)計引物PsCA、PsCB: PsCA:5’GAGTTTCACCCTGACCATCACTGTG 3’; PsCB: 5’GCCCATCACTGGTCTTGAAGGTTGT 3’。用β-actin作為內(nèi)參照，進行RT-PCR，反應條件為：95℃ 15min, 95℃ 30s, 55℃ 30s, 72℃ 45s,30個循環(huán)，72℃ 10min；PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳，電壓60V,60min。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件處理，進行t檢驗、χ2檢驗和Fisher確切概率法，Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1不同胃癌細胞系MSP結(jié)果 細胞系A(chǔ)Z521中Runx3基因啟動子區(qū)域部分甲基化，細胞系SNU5中Runx3基因啟動子區(qū)域未甲基化，其余7種胃癌細胞系中Runx3基因啟動子區(qū)域高度甲基化。見圖1。

圖1 不同胃癌細胞系MSP結(jié)果

2.2Runx3基因在胃癌和癌旁正常組織的甲基化率 在胃癌組織中，Runx3基因啟動子區(qū)域甲基化率占40.0 %(14/35)，而在相對應的癌旁正常組織中，Runx3基因啟動子區(qū)域甲基化率占8.5%(3/35)，兩者差異有統(tǒng)計學意義(χ2=9.04，Plt;0.01)。

2.3不同胃癌細胞系RT-PCR結(jié)果 Runx3 mRNA在胃癌細胞系SNU5和AZ521中有表達，在其余7種細胞系中未見表達，見圖2。其結(jié)果與本文中9種胃癌細胞系MSP結(jié)果相符，可以說明在胃癌細胞系中，Runx3基因啟動子區(qū)域甲基化是Runx3基因失活的主要機制之一。

圖2 胃癌細胞系中RT-PCR結(jié)果

2.4Runx3 mRNA在胃癌和癌旁正常組織中的表達 胃癌組織標本中Runx3基因表達(0.5971±0.1013)較癌旁正常組織表達(0.8297±0.2912)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(t=4.46，Plt;0.05)。

2.5胃癌組織Runx3基因mRNA表達與臨床病理特征的關(guān)系 采用Fisher確切概率法計算P值，結(jié)果顯示，Runx3的表達與胃癌的分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(Plt;0.01)，而與年齡、性別及腫瘤大小無關(guān)(Pgt;0.05)。見表2。

表2 胃癌組織Runx3基因mRNA表達與臨床病理特征的關(guān)系 例

3 討 論

DNA甲基化是表觀遺傳修飾的一個重要方式，DNA的甲基化狀態(tài)受到DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase, DNMT)的調(diào)節(jié)，該酶能使CpG島的胞嘧啶環(huán)5’位的氫被s-腺苷甲硫氨酸的活性甲基所取代，變成5’-甲基胞嘧啶[9]。DNA甲基化主要發(fā)生在富含CpG島的啟動子區(qū)域，通過該區(qū)域的甲基化將直接阻礙轉(zhuǎn)錄因子如AP-2、c-Myc/Myn、CREB、E2F等與啟動子結(jié)合，從而使基因不能轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄水平降低[10]，這在正常細胞是調(diào)節(jié)基因表達的手段，但在腫瘤中，腫瘤抑制基因的異常甲基化能促進腫瘤的發(fā)生，導致惡性表型[11]。目前發(fā)現(xiàn)，在幾乎所有的人類腫瘤中都存在CpG島的過甲基化現(xiàn)象，但各種不同類型的腫瘤中，檢測到發(fā)生甲基化的基因及甲基化的狀態(tài)并不一致。實際上，到目前為止，大多數(shù)學者都認為甲基化的異常是導致某些重要基因，如MGMT、BRCA1等失活的最常見的原因，而這些基因與腫瘤的直接相關(guān)性提示我們甲基化的異常在腫瘤的形成和發(fā)展中起著重要的推動作用。Runx3基因是一種新型的抑癌基因，目前已經(jīng)在肝癌、膽道腫瘤、肺癌、嬰兒睪丸內(nèi)胚竇瘤中發(fā)現(xiàn)Runx3基因過度甲基化現(xiàn)象。Waki等研究10個胃癌細胞系，有70.0%(7/10)細胞系被檢測Runx3基因甲基化，而通過胃癌患者手術(shù)標本研究顯示，45%腫瘤組織(42/93)和8%(7 /93)癌旁正常組織發(fā)生了Runx3基因甲基化。本文采用MSP方法檢測了9個胃癌細胞系，發(fā)現(xiàn)有77.8%(7/9)細胞系被檢測到Runx3基因過度甲基化；在35例胃癌患者手術(shù)切除標本胃癌組織及其癌旁組織Runx3基因甲基化與報道的研究結(jié)果相似。本文利用RT-PCR方法顯示在9個胃癌細胞系中，2個Runx3基因啟動子區(qū)域未過度甲基化的細胞系存在Runx3基因表達，其結(jié)果與MSP結(jié)果相符。在胃癌組織中Runx3基因的表達量明顯低于癌旁正常組織，Runx3基因在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組及低分化組中的表達明顯低于未轉(zhuǎn)移組和高分化組。本研究通過對胃癌細胞系及癌組織中Runx3基因甲基化與表達情況研究，推斷Runx3基因啟動子區(qū)域的過度甲基化可能是導致該基因轉(zhuǎn)錄失活及其表達下調(diào)的主要原因，從而與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。因DNA甲基化在腫瘤的形成中普遍存在， DNA甲基化改變是一種可逆的表觀遺傳修飾，因此，DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT)成為目前DNA去甲基化恢復抑癌基因功能的熱點靶分子，通過DNMT抑制劑，可以使腫瘤中許多過甲基化的基因被重新激活。這提示我們在胃癌中可以Runx3基因為治療靶點，用DNMT抑制劑，如5-aza-2’-deoxycytidine(decitabine)、Fazarabine、zebularine等誘導沉默的Runx3基因重新表達的方法對胃癌進行基因治療。

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[編輯] 一 凡

R730.231

A

1673-1409(2009)02-R016-04

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2009.02.005

2009-03-02

湖北省教育廳中青年項目(Q20091207)

何小兵(1970-)，男，湖北京山人，講師，從事生物化學與分子生物學教學與研究工作。